Abstract
TAE226, et bis-anilino pyrimidinforbindelse, har blitt utviklet som en inhibitor av fokal adhesjonskinase (FAK) og insulin-lignende vekstfaktor-i-reseptor (IGF-IR). I denne studien undersøkte vi effekten av TAE226 på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), spesielt med fokus på
EGFR
mutasjonsstatus. TAE226 var mer effektiv mot celler med mutert EGFR, inkludert T790M-mutant, enn mot celler med villtype-en. TAE226 preferensielt inhiberes fosfo-EGFR og nedstrøms signalemediatorer i cellene med mutant EGFR enn hos dem med villtype-en. Fosforylering av FAK og IGF-IR ble ikke hemmet ved den konsentrasjon ved hvilken formeringen av
EGFR
-mutant-celler ble hemmet. Resultatene av
in vitro
bindingsanalyse indikerte betydelige forskjeller i affinitet for TAE226 mellom vill-type og L858R (eller delE746_A750) mutant, og den reduserte affinitet av ATP til den L858R (eller delE746_A750) mutant ført god respons fra L858R (eller delE746_A750) mutante celler til TAE226. Av interesse, L858R /T790M eller delE746_A750 /T790M mutant forbedret bindingsaffinitet for TAE226 sammenlignet med L858R eller delE746_A750 mutant, noe som resulterer i effekten av TAE226 mot T790M mutante celler til tross for den T790M-mutasjonen gjenoppretter ATP affinitet for det mutante EGFR nær at for villtype. TAE226 viste også høyere affinitet på omtrent 15-ganger for L858R /T790M mutant enn for villtype-en av kinetisk interaksjonsanalyse. Den anti-tumor effekt mot
EGFR
-mutant tumorer inkludert T790M-mutasjonen ble bekreftet i musemodeller uten noen betydelig toksisitet. I sammendraget, viste vi at TAE226 hemmet aktivering av mutant EGFR og utstilt anti-proliferativ aktivitet mot NSCLCs bærer
EGFR
mutasjoner, inkludert T790M mutasjon
Citation:. Otani H, Yamamoto H, Takaoka M, Sakaguchi M, Soh J, Jida M, et al. (2015) TAE226, en Bis-anilino pyrimidinforbindelse hemmer EGFR-Mutant kinase Inkludert T790M Mutant til Vis Anti-tumor effekt på
EGFR
-Mutant ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 10 (6): e0129838. doi: 10,1371 /journal.pone.0129838
Academic Redaktør: Pier Giorgio Petronini, Universitetet i Parma, Italia
mottatt: 19 august 2014; Godkjent: 13 mai 2015; Publisert: 19 juni 2015
Copyright: © 2015 Otani et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan (tilskudd nummer : 18790993 til ST), https://www.mext.go.jp/english/. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Novartis Pharma AG gitt støtte i form av lønn for forfattere SH og EK, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser. Selv om forfatterne av dette manuskriptet (SH og EK) er ansatt i Novartis Pharma AG, ikke dette endre forfatternes overholdelse av PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Novartis Pharma AG gitt støtte i form av lønn for forfattere SH og EK, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Lungekreft er delt inn i to hovedkategorier histologiske, ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft. Til tross for store anstrengelser for å forbedre overlevelse av pasienter med lungekreft, en tilfredsstillende overlevelse har ennå ikke oppnådd fordi flertallet av pasienter til stede med et avansert stadium av sykdommen og deres svulster viser en iboende motstand mot konvensjonell kjemoterapi [2]. For å forbedre prognosen for pasienter med lungekreft, mange kliniske og grunnleggende undersøkelser, inkludert translasjonsforskning, har blitt gjennomført [3, 4].
Molecular målretting terapi basert på molekylære forandringer i kreft er en lovende strategi for behandlingen av lunge cancer, så vel som andre ondartede svulster. For eksempel, 4-anilinoquinazoline-hemmere, som gefitinib og erlotinib, har blitt konstruert for å inhibere tyrosin kinase domene av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), som blir overuttrykt i NSCLC; slike inhibitorer som for tiden blir brukt for behandling av NSCLC [5-8]. Av spesiell interesse er disse EGFR tyrosinkinasehemmere (EGFR-TKI) produserer drastiske anti-tumor effekt mot NSCLCs frakte felles
EGFR
mutasjoner, små slettinger på ekson 19 og L858R mutasjon i ekson 21. Foruten disse EGFR-TKI -sensitive mutasjoner er T790M mutasjon i exon 20 er kjent som EGFR-TKI-resistente mutasjon [9, 10]. Tidligere studier har rapportert at felles
EGFR
mutasjoner i tyrosinkinase domenet er hyppigere hos pasienter med adenokarsinom histologi, en aldri røyke historie, og et østasiatisk etnisitet [11-13]. Hyppigheten av felles
EGFR
mutasjon i adenokarsinom, som avhenger av pasientens bakgrunn, varierer 15-45%, noe som tyder på at den felles
EGFR
mutasjon er en hyppig og viktig begivenhet av lunge adenokarsinomer [11, 13, 14]. I motsetning til dette iboende T790M mutasjoner er meget sjelden [15]. Imidlertid er T790M mutasjoner funnet i ca 50% tilfeller blant NSCLCs at ervervet resistens mot EGFR-TKI [16].
I tillegg til EGFR-TKI rettet mot EGFR protein, ulike typer av små molekyl forbindelser har blitt utviklet mot kreft -spesifikke molekylære endringer. TAE226, en bis-anilino pyrimidinforbindelse, konkurrerer med ATP for fokal adhesjonskinase (FAK) og insulin-lignende vekstfaktor-I-reseptor (IGF-IR). Denne forbindelse velig inhiberer celleproliferasjon, migrering og invasjon av mange kreftformer, slik som gliom, Barretts esophageal adenokarsinom, eggstokkreft, kolorektal og brystkreft [17-22].
FAK er en ikke-reseptor tyrosinkinase som transduces signaler fra integrin-reseptoren og deltar i flere celle funksjoner som er nødvendige for cellevekst, overlevelse, motilitet, og invasjon [23]. IGF-IR er en transmembrane reseptor-tyrosinkinase som deltar i signalisering kaskader som fører til aktivering av både AKT og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) [24]. Disse tyrosinkinaser er kjent for å være overuttrykt i mange maligne tumorer inkludert noen NSCLCs og for å spille et oncogent rolle i kreftceller [25-27]. Disse fakta og bakgrunn oppfordret oss til å undersøke den anti-tumor effekt av TAE226 i NSCLC, og vi fant uventet at TAE226 hemmer fortrinnsvis spredning av
EGFR
-mutant NSCLC cellelinjer inkludert T790M mutant, sammenlignet med
EGFR
-wild-type NSCLC cellelinjer.
i denne studien beskriver vi anti-tumor effekt av TAE226 på
EGFR
-mutant celler
in vitro
og
in vivo Hotell og undersøkt anti-tumor mekanisme TAE226 i
EGFR
-mutant celler.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Animal Care og bruk komité Okayama University (Permit Number: OKU-2007232). Alle operasjoner ble utført under ketamin og xylazin anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Reagenser
NVP-TAE226 ble vennlig levert av Novartis Pharma AG (Basel, Sveits). ZD1839 (gefitinib) ble vennlig levert av Astrazeneca (Wilmington, DE). Den stamløsning av disse forbindelsene var henholdsvis rekonstituert i konsentrasjon på 20 mM og 10 mM med dimetylsulfoksid (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og lagret ved -20 ° C inntil anvendt til
in vitro
eksperimenter
antistoffer
de primære antistoffer mot disse proteinene ble brukt til western blotting. polyklonale anti-EGFR, fosfor-EGFR (Tyr1068), IGF-IRβ, fosfor-IGF -IRβ (Tyr1131), AKT, fosfo-AKT (Ser473), P44 /P42 mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), og fosfo-P44 /P42 MAPK-antistoffer ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Monoklonale anti-fokal adhesjonskinase (FAK), ble fosfo-FAK (pY397) antistoffer innkjøpt fra Biosource (Berkeley, CA), og anti-actin-antistoff som benyttes som likeverdige lasting kontroller, ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
for å vurdere effekten av TAE226, følgende 17 NSCLC cellelinjer, en brystkreft cellelinje (SK-BR-3), en magekreft cellelinje (MKN45) og HEK -293T cellelinje ble brukt for
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter. HCC827, HCC4006, NCI-H3255, NCI-H1975, NCI-H820, NCI-H1819, NCI-H1666, NCI-H1395, NCI-H2228, NCI-H1648, NCI-H1993, NCI-H838 og NCI-H1299 cellelinjer var vennlig levert av Dr. Adi F. Gazdar (University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, Dallas, TX, USA), som etablerte de NSCLC cellelinjer med Dr. John D. Minna [28-30] bortsett fra NCI-H3255, som ble etablert av Dr. Bruce E. Johnson [11, 31]. Disse cellelinjene ble påvist å ha individuelle genetiske opphav ved Powerplex 1.2 system (Promega, Madison, WI) ved University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, før vi fått disse cellelinjene [29]. PC-9 (katalognummer: 37012) ble kjøpt fra Immuno-Biological Laboratories (Takasaki, Japan). MKN45 (katalognummer: JCRB0254) ble kjøpt fra japansk Innsamling av forsknings Bioressurser Cell Bank, National Institute of Biomedical Innovation (Ibaraki, Japan). SK-BR-3 (katalognummer: HTB-30), A549 (katalognummer: CCL-185), Calu-3 (katalognummer: HTB-55) og HEK-293T (katalognummer: CRL-3216) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Den gefitinib bestandige PC-9-cellelinjen (RPC-9) ble etablert ved en av forfatterne (K.K.) [32]. PC-9, HCC827, HCC4006, NCI-H3255, NCI-H1975, NCI-H820 og RPC-9 har EGFR-TKI-følsomme mutasjoner. Dessuten NCI-H1975, NCI-H820 og RPC-9 cellelinjer har også T790M EGFR-TKI-resistent mutasjon. Detaljene for genetiske endringer i disse cellelinjene unntatt HCC4006 (delL747_A750, P ins) er og NCI-H820 (delE746_E749 /T790M) vist i tabell 1.
NCI-H3255 ble dyrket i ACL- 4 medium [33, 34] supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og de andre cancercellelinjer ble holdt i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich). HEK-293T-cellelinjen ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Sigma-Aldrich) supplert med 10% FBS. Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en fullstendig fuktet atmosfære av 5% CO
2 i luft. Alle
in vitro
eksperimenter ble gjennomført med ca 80% sammenflytende kulturer.
Effekten av TAE226 på IGF-IR etter serum-sult
For å vurdere effekten av TAE226 på IGF-IR henhold ligand-fri tilstand, analyserte vi den induserte IGF-IR fosforylering etter serum-sult etterfulgt av TAE226 behandling. Etter cellelinjer ble serum-sultet i tre timer og behandlet med økt konsentrasjon av TAE226 i to timer, ble de stimulert med 100 ng /ml IGF-I rekombinant (Sigma-Aldrich) i 15 minutter og deretter ble analysert ved western blotting.
Bestemme stoffet følsomhet for TAE226 og gefitinib i ulike cellelinjer
Drug følsomhet ble bestemt av en modifisert MTS analysen med CellTiter 96 vandige løsning Reagens (Promega, Madison, WI). Celler ble vanligvis sådd ut på 96-brønners plater ved en densitet som ville utbytte 80% konfluens ved fullføring av forsøket, varierende fra hver cellelinje 3000-4000 per brønn. Etter dette ble mediet i brønnene erstattet med medium inneholdende fortynnede oppløsninger av medikament TAE226 eller gefitinib i en 4-log rekkevidde eller fullstendig medium, som ble fordelt i 8-replikere brønner. Celler ble inkubert i nærvær av hver konsentrasjon av TAE226 i 48 timer og av gefitinib i 72 timer ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i luft. Etter dette ble MTS farge tilsatt til hver brønn. Kulturene ble inkubert i ytterligere 1 time ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Optiske tettheter av prøvene ble målt ved 490 nm ved hjelp Immuno Mini NJ-2300 (Nalge Nunc International KK, Rochester, New York). Mean optisk tetthet ved hver medikamentkonsentrasjon ble beregnet etter forkaster de høyeste og laveste verdiene. Den anti-tumoreffekter av TAE226 og gefitinib for hver cellelinje er vist i form av inhiberende konsentrasjon 50% (IC
50), som ble bestemt ved å plotte kurven for prosentvis hemming av cellevekst (Y-akse) versus legemiddelkonsentrasjon (X-aksen). IC
50 verdier ble uttrykt som gjennomsnitt og standardavvik. Analysene ble gjentatt inntil standardavviket ble mindre enn gjennomsnittet.
Western blot-analyse
Cellene ble dyrket i 60 mm skåler over natten, og deretter behandlet med DMSO eller hver konsentrasjon av TAE226 og gefitinib. Deretter ble de vasket med kald PBS og lysert i 1 x cellelyseringsbuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na
2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM beta-glycerophosphate, 1 mM Na
3VO
4, 1 mikrogram /ml leupeptin] (Cellesignalering signale~~POS=TRUNC Technology) supplert med Komplett, Mini (Roche, Basel, Sveits) til å trekke protein. Etter at proteinkonsentrasjonen ble målt, ble like mengder av totalt protein (30 ug) separert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Proteinene på Membranene ble inkubert over natten ved 4 ° C med de primære antistoffer. De følgende sekundære antistoffer ble anvendt: geit antikanin eller antimuse-IgG-konjugert pepperrotperoksidase (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). For å påvise spesifikke signaler, ble membranene ruges av ECL pluss Western blotting Detection reagenser (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK).
In vitro
bindingsanalyse av varianten EGFR-TK domener
bindingen evne TAE 226 for varianten EGFR-TK domener ble undersøkt med
in vitro
bindingsanalysen. Variant EGFR-TK domener besto av vill-type, delE746_A750, L858R, delE746_A750 /T790M, og L858R /T790M. Den detaljerte Metoden er beskrevet i S1 Method.
Kinetic interaksjonsanalyse av TAE226 og gefitinib mot villtype EGFR og L858R /T790M EGFR muterte
For å karakterisere mekanismen av handlingen av TAE226 på EGFR utførte vi kinetisk interaksjon analyse av TAE226 og gefitinib (som en kontroll) mot villtype-EGFR og L858R /T790M EGFR mutant av Proteros Reporter Displacement Assay (Proteros biostructures GmbH, Munchen, Tyskland), som ble anvendt for å bestemme følgende parametere: K
d,
k
på
k
av og oppholdstid. Den Proteros Reporter Displacement-analysen ble utført som beskrevet tidligere [35, 36]. Detaljert fremgangsmåte ble beskrevet i S1 metode.
Animal xenograft musemodell
I dette eksperimentet brukte vi BALB /c-nu /nu hunn nakne mus ved 4-6 ukers alder som ble kjøpt fra Charles River Laboratories Japan, Inc (Yokohama, Japan). De ble holdt under spesifikt patogenfrie forhold i samsvar med retningslinjene fra Animal Care og bruk komité på Okayama University. PC-9 og RPC-9 cellelinjer (4,0 × 10
6/100 ul) blandes med 100 ul Matrigel (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA) ble inokulert subkutant i 24 hårløse mus [4 forskjellige grupper (n = 6 i hver gruppe) ved konsentrasjonen av TAE226], som hadde omtrent 20 g kroppsvekt. TAE226 ble fortynnet med metylcellulose i konsentrasjonen av 0 mg /kg (kjøretøy), 30 mg /kg, 60 mg /kg og 90 mg /kg. Etter tumorvolumet har nådd 200-400 mm
3, TAE226 ble oralt administrert til hver naken mus en gang om dagen for serie 14 dager. Hver tredje dag, ble kroppsvekten til musene og den store akse og en mindre akse av hver tumor målt og beregnet tumorvolum ved hjelp av følgende formel; (Hovedakse) × (mindre aksen)
2 × 1/2 [37, 38]. For 14 dager, ble tumorvolumet, tumor vekst og kroppsvekt analysert som et gjennomsnitt av hver gruppe.
Statistisk analyse
Student
t
test ble brukt å sammenligne data mellom to grupper. Resultatene ble representert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD).
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Anti-proliferativ effekt av TAE226 på NSCLC cellelinjer
Vi har evaluert anti-tumor effekt av TAE226 å bruke en MTS analyse i 15 NSCLC-cellelinjer, en brystcancer cellelinje og en magekreft cellelinje (tabell 1). Antall MTS analyser utført og hver IC
50 verdi innhentes fra uavhengige analyser er vist i S2 tabell. Tre NSCLC cellelinjer (PC-9, HCC827, og NCI-H3255) med bare EGFR-TKI-sensitive
EGFR
mutasjoner og to NSCLC cellelinjer (RPC-9 og NCI-H1975) med både TKI-sensitive og TKI-resistente
EGFR
mutasjoner viste lignende IC
50-verdier, alt 0,086 til 0,31 mikrometer. I motsetning til dette IC
50-verdier for
EGFR
villtype-småcellet lungekreft cellelinjer (n = 10: varierte 0,28 til 6,2 pM) var høyere enn de i
EGFR
mutant NSCLC cellelinjer selv om to
BRAF
mutantcellelinjer og en
EML4 Anmeldelser –
ALK
translocated cellelinjen viste middels nivå av IC
50-verdier (range, 0,28 0,48 mm). Disse resultatene antydet at TAE226 var mer effektiv i
EGFR
-mutant cellelinjer, uavhengig av tilstedeværelsen av TKI-resistente
EGFR
T790M mutasjon, enn i
EGFR
vill -type cellelinjer, spesielt som ikke har
BRAF
eller
EML4 Anmeldelser -.
ALK
endringer
Vi har også undersøkt anti-tumor effekt av gefitinib mot 14 NSCLC cellelinjer (tabell 1). Tre NSCLC cellelinjer som bærer bare EGFR-TKI-sensitive
EGFR
mutasjon var følsomme for gefitinib (IC
50 verdier ble varierte 0,0014 til 0,0028 mm), mens andre NSCLC cellelinjer husing villtype
EGFR plakater (n = 9) eller TKI-resistente
EGFR
mutasjon (n = 2) var resistente (IC
50 ble varierte 5,3 til 32,6 uM). Disse data var i samsvar med tidligere rapporter [10, 28].
Deregulering av FAK, IGF-IR, og EGFR-relaterte proteiner etter TAE226 behandling hos NSCLC cellelinjer
Vi undersøkte effekten av TAE226 på FAK, IGF-IR, og EGFR-relaterte proteiner ved hjelp av 6 cellelinjer (PC-9, HCC827, NCI-H1975, RPC-9, NCI-H1299, og NCI-H1819). Fosforyleringen av FAK (Thy397) og IGF-IR (Tyr1131), som er mål for TAE226, ble ikke signifikant hemmet opp til en konsentrasjon på 5 pM i alle 6 cellelinjer som ble testet (fig 1). For FAK, ble inhibert-fosforylering i en konsentrasjon på 20 uM (data ikke vist). For IGF-IR, ble fosforylering fullstendig hemmet av TAE226 etter serum-sult i alle 4 cellelinjene som ble testet (PC-9, RPC-9, NCI-H1299, og NCI-H1819), uavhengig av ligand stimulering (S1 fig). Dette resultatet indikerer at TAE226 hemmet phoshorylation av IGF-IR som forventet.
NSCLC cellelinjer med EGFR-TKI-sensitive (ekson 19 slettinger) mutasjon (PC-9 og HCC827), cellelinjer med både EGFR TKI-sensitive og-resistente (T790M) mutasjoner (NCI-H1975 og RPC-9), og cellelinjer med vill-type EGFR (NCI-H1299 og NCI-H1819) ble behandlet med TAE226 ved flere konsentrasjoner og western-blotting-analyse ble utført . De phosphorylations av FAK og IGF-IR ble ikke undertrykket i alle NSCLC-cellelinjer som ble testet. I kontrast, ble phosphorylations av EGFR og nedstrøms proteiner, AKT og MAPK, undertrykt ved lavere konsentrasjon av TAE226 i
EGFR
-mutant cellelinjer uavhengig av tilstedeværelsen av T790M mutasjon sammenlignet med
EGFR
-wild-type cellelinjer. Vi inkuberes membranen for Actin (42 kDa) etter at vi inkuberes MAPK (42 og 44 kd) og stripping buffer ble brukt for at membranen.
Av spesiell interesse, fosforylering av EGFR var hovedsakelig hemmet ved TAE226 i alt fire
EGFR
-mutant cellelinjer (PC-9, HCC827, NCI-H1975 og RPC-9), uavhengig av tilstedeværelsen av TKI-resistente mutasjoner. I tillegg er phosphorylations av AKT og MAPK, som er nedstrøms molekyler av EGFR, ble også hemmet i disse
EGFR
-mutant cellelinjer. I kontrast, ble phosphorylations av EGFR, AKT, og MAPK ikke hemmet i cellelinjer med vill-type
EGFR plakater (NCI-H1299 og NCI-H1819) (fig 1). Disse data antydet at TAE226 kan ha en sterkere effekt på mutant EGFR enn villtype EGFR.
Vi har bekreftet uttrykket nivået av FAK, p-FAK, IGF-IR, og p-IGF-IR i cellelinjer uten narkotika eksponering ved hjelp av ti NSCLC cellelinjer (
EGFR
-mutant cellelinjer, PC-9, HCC827, NCI-H3255, HCC4006, NCI-H1975, NCI-H820 og RPC-9;
EGFR
villtype-cellelinjer NCI-H1819, NCI-H1299 og A549). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i ekspresjonsnivået av hvert av proteinene blant de cellelinjer (S2) Fig.
Effekt av TAE226 på mutant EGFR-transfekterte HEK-293T cellelinje
Vi undersøkte den anti-proliferative effekt av TAE226 på to HEK-293T-cellelinjer som stabilt transfektert med vill-type EGFR eller mutant EGFR (L858R) som vi tidligere hadde opprettet [39]. Den HEK-293T med mutant EGFR var mer følsom overfor gefitinib enn den HEK-293T med vill-type EGFR (IC
50-verdier var 0,38 ± 0,087 og 18,2 ± 3,9 uM, henholdsvis) (tabell 1). TAE226 som utøves en høyere antitumoreffekt på HEK-293T med det mutante EGFR enn på HEK-293T med villtype-EGFR (IC
50-verdier var 0,41 ± 0,06 og 3,0 ± 0,11 uM, henholdsvis) ( tabell 1). TAE226 hemmet de phosphorylations av EGFR og AKT i HEK-293T celle med det mutante EGFR, men ikke i HEK-293T celle med vill-type EGFR (S3 Fig). Resultatene viste også at TAE226 hemmet cellevekst eller overlevelse av
EGFR
-mutant celler ved å undertrykke mutant EGFR-proteinet.
Binding affinitet TAE226 å mutant EGFR
For å vurdere bindingsaffiniteten TAE226 til EGFR-kinaser, har vi utført en
in vitro bindingsanalyse
av varianten EGFR kinase (Fig 2). Supernatanten fraksjonen inneholdt EGFR kinase som ikke binder seg til perle-modifisert ATP på grunn av interferens fra TAE226 (eller eksogen ATP). Det utfelte fraksjonen inneholdt EGFR kinase som hadde bundet til perle-modifisert ATP, noe som indikerer at TAE226 (eller eksogen ATP) ikke forstyrrer den ATP-binding. Dermed blir båndintensiteten ved hver TAE226 (eller eksogen ATP) konsentrering gjenspeiler evnen til TAE226 (eller eksogen ATP) for å konkurrere med kule-modifisert ATP for EGFR-kinase.
A) som er felles EGFR muterte kinaser og B ) T790M inneholder EGFR muterte kinaser. De fem typer av EGFR kinaser, vill-type, ekson 21 L858R mutasjon (L858R) eller ekson 19 sletting (delE746_A750), T790M i tandem med L858R mutasjon (L858R /T790M), og T790M i tandem med delE746_A750 (delE746_A750 /T790M) som konkurransedyktig binder seg til ATP eller TAE226, ble hentet ut og ble inkubert med perler-modifiserte ATP. TAE226 eller den rekombinante ATP ble tilsatt for å konkurrere med perler-modifisert ATP for binding til EGFR kinase. EGFR kinase binging med perler-modifiserte ATP var til stede i utfellingen, og EGFR-kinase-binding med TAE226 (eller rekombinant ATP) var til stede i supernatanten. Western blotting ble utført for å påvise EGFR-kinaser i hver komponent ved hjelp av et HA-antistoff. *, Ved en konsentrasjon på 10 uM til ATP; **, Ved en konsentrasjon på 0,005 uM for TAE226.
Blant de varianten EGFR-kinaser som ble testet (vill-type, L858R, delE746_A750, L858R /T790M og delE746_A750 /T790M), ingen forskjell i mengdene av EGFR-kinaser som er bundet til vulsten-modifiserte ATP ble notert under kontroll tilstand (figur 2A og 2B). Eksogen ATP svakt bundet til EGFR-kinaser ved en konsentrasjon på 1000 pM i alle variantene som ble testet (figur 2A). I motsetning til dette begynte TAE226 å binde til villtype-EGFR kinase ved en konsentrasjon på 0,1 uM og ved lavere konsentrasjoner for mutant EGFRs, noe som indikerer at TAE226 ha en høyere affinitet til EGFR-kinaser enn ATP. Vi beregnet bindingsaffiniteten TAE226 til EGFR-varianter ved å sammenligne forholdet mellom halv kvantifisert bånd intensitet mellom den overliggende fraksjon og den utfelte fraksjon ved 0,1 uM av TAE226 mellom vill-type, L858R, eller delE746_A750 (S4A Fig). Kvantifisering ved hjelp ImageJ programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD) viste at bindingsaffiniteten TAE226 var omtrent 7,5 ganger høyere for begge muterte EGFRs enn til villtype EGFR (S4A fig). Effekten av ervervet T790M mutasjon på bindingsaffiniteten for TAE226 til vanlige mutant EGFR-kinaser (L858R eller delE746_A750) ble også evaluert ved en konsentrasjon på 0,005 uM for TAE226 og 10 uM for ATP (Fig 2B). Interessant, bindende affinitet for TAE226 var høyere i T790M inneholder EGFR muterte kinaser (L858R /T790M eller delE746_A750 /T790M) enn i vanlig EGFR muterte kinaser (L858R eller delE746_A750) (S4B figur).
Interaksjonskinetikk TAE226 og gefitinib med villtype EGFR og L858R /T790M EGFR muterte
IC
50 og K
d verdier for TAE226 og gefitinib mot villtype EGFR og L858R /T790M EGFR mutant ble vist i tabell 2. IC
50 og K
d verdier for TAE226 var 0,326 mikrometer og 0,163 mikrometer i villtype EGFR og 0,0193 um og 0,00966 mikrometer i L858R /T790M EGFR mutant, henholdsvis. Angå gefitinib, de var 0,0244 um og 0,0122 um i villtype EGFR og 0,927 mikrometer og 0,463 mikrometer i L858R /T790M EGFR mutant, henholdsvis. Gefitinib viste en høyere affinitet på omtrent 40 ganger for villtype-EGFR enn for L858R /T790M EGFR mutant. Tvert imot, TAE226 viste høyere affinitet på omtrent 15-ganger for L858R /T790M EGFR mutant enn for villtype-EGFR. Verdiene av
k
på og
k
off kunne ikke beregnes i TAE226 for begge type EGFR og i gefitinib for L858R /T790M EGFR muterte grunn av kort oppholdstid ( 1,4 min).
Anti-tumor effekt av TAE226 på NSCLC mus xenograft modeller
Basert på våre
in vitro
data, vi undersøkte den anti-tumoreffekten til TAE226 på mus xenograft-modeller. Etter subkutan tumorvolum av de inokulerte PC-9 og RPC-9 cellelinjer i nakne mus hadde nådd et volum på 200-400 mm
3, behandlet vi det nakne mus med oral administrering av TAE226 (30 mg /kg , 60 mg /kg eller 90 mg /kg) eller metylcellulose som bærer for 14 dager. Tumorvolumet og kroppsvekten av begge xenotransplantater ble målt på dagen før oral administrering av TAE226 og hver tredje dag deretter. Åpenbare bivirkninger, inkludert tap av kroppsvekt, ikke forekommer i den bærer-behandlede gruppe, eller i gruppene behandlet med 30 mg /kg eller 60 mg /kg av TAE226, mens et tap av kroppsvekt ble observert hos mus behandlet med 90 mg /kg av TAE226. Tumorvolumet i begge xenotransplantater betydelig redusert over tid og på en doseavhengig måte, sammenlignet med den bærer-behandlede mus (figur 3). Videre begge xenografter av EGFR-TKI-sensitive (PC-9) og EGFR-TKI-resistente (RPC-9) cellelinjer viste lignende anti-tumor effekter i respons til TAE226
in vivo
.
oral administrering av TAE226 i 14 dager inhiberte signifikant tumorvekst av de subkutant inokulert muse-xenografter med PC-9 (exon19 delesjon) eller RPC-9 (exon19 sletting og T790M-mutasjon) ved hver dose (30, 60 og 90 mg /kg). I tillegg viste TAE226 den tilsvarende anti-tumor virkning på både xenograft-modeller uavhengig av tilstedeværelsen av EGFR T790M mutasjon.
diskusjon
Som vist i forholdet mellom små EGFR-TKI og
EGFR
mutasjon [40], evne til TAE226 til å konkurrere med ATP, noe som resulterer i sin anti-tumor potensial, bestemmes av to faktorer: 1) bindingsevnen for TAE226 til mutant EGFR og 2) affinitet for ATP til mutant EGFR. Det er vel kjent at affiniteten for ATP er lavere for vanlige EGFR mutanter enn for villtype-EGFR [40].
Det synes å være en annen viktig faktor som sterkt påvirker effekten av molekylære målrettes mot legemidler på kreftcellene . Ifølge begrepet «onkogen avhengighet»,
EGFR
-mutant cellelinjer er svært avhengig av mutant EGFR for celledeling og overlevelse [41]. Mens årsaken til dårlig hemming til FAK eller IGF-IR-aktivitet i NSCLC er ikke klar, våre funn indikerte at TAE226 sterkt inhibert det mutante EGFR, sammenlignet med FAK og IGF-IR, i celler som er «avhengige» til den mutante EGFR, resulterer i anti-tumor aktivitet av TAE226. Av notatet, det var noen uoverensstemmelser mellom IC
50 av
in vitro
ikke-cellulær kinase analyse og celle hemming analysen for noen onkogener. Dette fenomen synes å være forklares med begrepet «onkogen tilsetning» at graden av avhengighet til bestemte onkogener kan være forskjellig hos tumorer og onkogener. IC
50-verdier for c-Src (0,91), HER2 (0,95), FGFR-1 (0,75), c-Met (0,16) og ALK (0,15), som ofte er aktivert i NSCLC, er mindre enn det for EGFR (1,7) (S1 Table, oppdaterte data fra dommeren. 20), noe som indikerer at TAE226 kan også hemme disse kinaser i tillegg til EGFR i NSCLCs, spesielt hvis svulstene er «avhengige» til disse kinaser.
når det gjelder mekanismen hvorved T790M-mutasjonen er antatt å påvirke lavmolekylære TKI som gefitinib og erlotinib, har T790M mutasjonen vært antatt å føre til at motstanden ved sterisk blokkerer bindingen av TKI [9, 10, 42]. I tillegg Yun og medarbeidere rapporterte at en økning i ATP affinitet er den primære mekanisme ved hjelp av hvilken T790M mutasjonen forårsaker resistens mot TKI; mens den eneste L858R mutasjonen reduserer bindingsaffiniteten til ATP ved omtrent 30-ganger sammenlignet med villtype-EGFR, innføring av den ytterligere T790M-mutasjonen gjenoppretter bindingsaffiniteten av ATP sammenlignes med villtype-EGFR [43]. Interessant, våre data viste at IC
50 verdier av TAE226 for EGFR T790M i tandem med L858R (eller delE746_A750) mutante celler er lik de for EGFR L858R (eller delE746_A750) mutante celler, som gir kontrasterende resultater sammenlignet med IC
50 verdier av gefitinib for dem. Vår
in vitro
bindingsanalysen indikerer også at den doble mutant viser høyere bindingsaffinitet til TAE226 enn den L858R (eller delE746_A750) mutant.
