Abstract
Den arkitektoniske transkripsjonsfaktor HMGA2 er rikelig uttrykt under embryonal utvikling. I flere maligne neoplasier inkludert prostata kreft, høyt re-uttrykk for
er HMGA2
korrelert med malignitet og dårlig prognose.
la-7
miRNA familie er beskrevet til å regulere
HMGA2
negativt. Balansen av
la-7 Hotell og
HMGA2
er diskutert å spille en viktig rolle i tumor etiologi. For ytterligere å analysere rollen til HMGA2 i prostatakreft en stabil og meget reproduserbar
in vitro
modellsystemet er forutsetning. Heri vi etablert en hjørnetann CT1258-EGFP-HMGA2 prostatakreft cellelinje stabilt overekspresjon HMGA2 knyttet til EGFP og i tillegg referansen cellelinje CT1258-EGFP uttrykker utelukkende EGFP å utelukke EGFP-indusert effekter. Begge rekombinante cellelinjer ble preget av fluorescens mikroskopi, flowcytometri og immunocytochemistry. Den proliferative virkning av ectopically overuttrykt HMGA2 ble bestemt ved hjelp BrdU-analyser. Sammenlignende karyotyping av den utledede og de innledende CT1258 cellelinjer ble utført for å analysere kromosom konsistens. Virkningen av ektopisk
HMGA2
uttrykk på sin regulator
la-7a
ble analysert ved kvantitativ real-time PCR. Fluorescens mikroskopi og immunocytokjemi detektert vellykket ekspresjon av EGFP-fusjonsprotein HMGA2 utelukkende akkumuleres i kjernen. Genuttrykk analyser bekreftet
HMGA2
overekspresjon i CT1258-EGFP-HMGA2 i forhold til CT1258-EGFP og innfødte celler. Betydelig høyere
la-7a
uttrykk nivåene ble funnet i CT1258-EGFP-HMGA2 og CT1258-EGFP. De BrdU analyser påvist en økt spredning av CT1258-HMGA2-EGFP celler sammenlignet med CT1258-EGFP og innfødte CT1258. De cytogenetiske analyser av CT1258-EGFP og CT1258-EGFP-HMGA2 resulterte i en sammenlignbar hyperdiploid karyotype som beskrevet for native CT1258 celler. For ytterligere å undersøke virkningen av rekombinant uttrykt HMGA2 på CT1258 celler, ble andre utvalgte mål som er beskrevet å ligge til grunn HMGA2 regulering vist i tillegg. Den nye fluorescerende CT1258-EGFP-HMGA2 cellelinje er et stabilt verktøy som gjør det mulig
in vitro Hotell og
in vivo
analyser av HMGA2-mediert effekter på celler og utvikling og patogenesen av prostatakreft.
Citation: Willenbrock S, Wagner S, Reimann-Berg N, Moulay M, Hewicker-Trautwein M, Nolte jeg, et al. (2014) Generasjon og karakterisering av en Canine EGFP-HMGA2 Prostate Cancer
In Vitro
Model. PLoS ONE 9 (6): e98788. doi: 10,1371 /journal.pone.0098788
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 17 februar 2014; Godkjent: 07.05.2014; Publisert: 10 juni 2014
Copyright: © 2014 Willenbrock et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Ingen tredje part midler støttet denne studien. Studien ble finansiert med interne budsjettet for Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine, Hannover. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Herved forfatterne bekrefte at Jörn Bullerdiek, medforfatter innenfor tidligere samarbeids publikasjoner, er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer.
Innledning
Ifølge nyere globale kreftstatistikken, er den nest hyppigste diagnosen kreft og sjette største dødsårsaken blant prostatakreft menn i økonomisk utviklede land [1]. Foruten mann, hunden er den eneste kjente domestiserte pattedyrarter utviklings spontan prostatakreft med stor interesse [2].
I motsetning til situasjonen i menn, forekomsten av hjørnetann prostata karsinomer er lav regnskap i 0,2 til 0,6% av canine neoplasier [3]. Imidlertid er lokalt invasive i begge arter med en sammenlignbar progresjon, metastatisk mønster og histopatologi sykdommen [2], [4].
Gjennomsnittsalderen ved diagnose hos hunder er ti år og dermed, hovedsakelig påvirker eldre individer som det også rapportert hos menn [5] – [7]. Tatt i betraktning den fysiologiske alder ved prostatakreft diagnose, er det respektive levetid lik mellom de to artene som viser økt forekomst med alderen [6].
Hos mennesker er prostata kreft vanligvis en ganske treg framdrift kreft mens canine prostata kreft vokser raskt, svært aggressiv og mindre differensiert presentere en dårlig prognose [3], [8]. Kreft i canine prostatakjertelen ikke svarer til androgen tilbaketrekking terapi ligner mest menneskelige dårlig differensiert, androgen ildfast prostatakreft [4], [9]. På grunn av likhetene om presentasjon av menneskelige og hjørnetann prostatakreft, har hunden i det siste blitt fokusert som nyttig naturlig utfyllende dyremodell for å evaluere nye prostata kreft terapi [10].
Tidlig påvisning av prostatakreft hos menn er nå gjøres bruke etablert biokjemiske molekylære markører som prostataspesifikt antigen (PSA) og prostataspesifikt membranantigen (PSMA) med betydelig suksess.
i forhold til situasjonen i mennesker, hunder prostata kreft er diagnostisert på et meget sent stadium av sykdommen på grunn av fravær av pålitelige prostata-spesifikke biokjemiske prognostiske markører verktøy og behandlingen fortsatt smertestillende middel, siden det fortsatt ingen standard terapeutisk tilnærming for behandling av canine prostatakreft er tilgjengelige [11], [12]. Selv om flere studier rapporterer immunoreaktivitets for menneskelig PSA i canine ikke-neoplastisk prostatavevet og prostatakreft, inntil nå Ptil ble ikke funnet i plasma av prostatakreft bærende hunder [9], [12] -. [16]
Derfor vil identifisering av pålitelige molekylære biomarkører, slik som PSA og PSMA hos menn, slik at en tidlig diagnose og pålitelig prognose for canine prostatakreft være av betydelig verdi for fremtidig utvikling og evaluering av terapeutiske strategier samt vurdering av behandlingsrespons [2].
i denne sammenheng High-Mobility-Group Protein A2 (HMGA2) ble nylig funnet å tjene potensielt som en prognostisk markør for canine prostata neoplasier [17]. Heri analyse av et undersett av forskjellige canine prostata vevsprøver tydelig viste at ekspresjon av
HMGA2
øker betraktelig i korrelasjon med malign grad av vevsprøvene [17]. Videre
HMGA2
ble funnet å fungere som en potensiell differensiering markør for canine ondartet T- og B-cellelymfom [18] og for å være sterkt oppregulert i canine oral plateepitelkarsinom (upubliserte data).
i mennesker, en re-uttrykk for
HMGA2
ble også funnet i forskjellige maligne tumorer så som leukemi [19], [20], lymfom [18], bryst-[21], bukspyttkjertel [22] , ikke-småcellet lungekreft [23], muntlig plateepitelkarsinom [24], og thyroideakarsinom [25] være en indikator på dårlig prognose. I en fersk undersøkelse, ble HMGA2 protein uttrykk vist seg å være betydelig høyere i tumorvev sammenlignet med nærliggende normalt vev [26]. I tillegg er en
HMGA2
involvert i induksjon av epiteliale-til-mesenchymale overgang (EMT) i den humane prostatacancercellelinje PC-3 ble funnet [26].
Disse funnene tyder at HMGA2 spiller en sentral rolle i ulike tumortyper inkludert prostatakreft innenfor begge arter sterkt støtte
HMGA2
nytt uttrykk som en prognostisk svulst markør.
generelt er det svært konservert HMGA2 protein klink uttrykt under embryonal utvikling som virker som en arkitektonisk transkripsjonsfaktor i cellekjernen [27], [28]. Innenfor denne rollen, er HMGA2 allment rapportert å være involvert i en rekke cellulære prosesser som genuttrykk, induksjon av neoplastisk transformasjon, og fremming av metastase [29], [30].
uttrykk for
HMGA2
er regulert via mikro RNA (miRNA) av
la-7
familien ved å binde seg til sekvenser lokalisert i 3 «ikke-translatert område (UTR) av transkripsjon [31] – [35], som alle er konservert i gnagere, hund, kylling og [36] – [38]. Binding av
la-7
mirnas til komplementære sekvenser regulerer post-transkripsjonelt ekspresjonen av
hmga
2 på en negativ måte [31], [35], [39], [40]. Nylig en avregulert
la-7
uttrykk var assosiert med lunge [41], [42], bryst [43] og prostata kreft [44].
Hunden prostata adenokarsinom avledet cellelinje CT1258 [45] – [47] brukt i denne studien ble også analysert for
HMGA2
markør uttrykk av oss avsløre en sterk overekspresjon (upubliserte data). Dette resultatet gjør det mulig å hypothesise at en overekspresjon av dette målet genet er sannsynlig å spille en viktig rolle i canine prostatakreft, fremme spredning av kreftceller.
For å bekrefte denne hypotesen, tilgjengeligheten av stabile verktøy som tillater å evaluere rives
HMGA2 Anmeldelser –
la-7
aksen i prostata kreft
in vitro
og
in vivo
er forutsetning. Derfor etablerte vi stabilt transfekterte cellelinjer CT1258 gir en pålitelig
in vitro
system for å analysere de viktigste aspektene ved vår hypotese.
Vi analyserte proliferative effekter av rikelig uttrykt rekombinant
HMGA2
på CT1258 celler. Derfor ble en stabil CT1258 cellelinje som uttrykker rekombinant EGFP-merket HMGA2 (CT1258-EGFP-HMGA2) generert ved hjelp av et uttrykk vektorkonstruksjon som inneholder den kodende sekvensen (CDS) av hjørnetann
HMGA2
genet mangler 5’UTR og 3’UTR og derfor ikke bak de direkte negative reguleringsmekanismer av
la-7 product: [31].
for å vurdere funksjonaliteten av rekombinante HMGA2 ekspresjonsvektoren og for å overvåke den biologiske aktiviteten av rekombinant uttrykte HMGA2, ble en GFP-tag legges til
HMGA2
CDS generere en HMGA2-GFP fusjonsprotein. For å utelukke at GFP-proteinet har en effekt på celleproliferasjon, en ytterligere stabil CT1258 cellelinje (CT1258-EGFP) som uttrykker GFP utelukkende ble generert.
HMGA2 Hotell og
la-7a
ble bestemt via kvantitativ real-time PCR i CT1258-EGFP-HMGA2 og CT1258-EGFP i forhold til innfødte CT1258 celler.
i tillegg er uttrykk for utvalgte direkte og indirekte HMGA2-mål som
HMGA1 product: [48],
SNAI1 product: [49],
SNAI2 Hotell og
CDH1
[49] ble analysert.
for å karakterisere spredning av de beskrevne tre cellelinjer, BrdU innlemmelse ble utført. Sammenlignende karyotype analyser av den nylig genererte og de innledende CT1258 cellelinjene ble også utført for å identifisere cytogenetisk endringer muligens oppstår under plasmid integrert inn i genomet av CT1258 under etablering av stabile rekombinante cellelinjer.
I sammendrag nye fluorescerende canine CT1258-EGFP-HMGA2 cellelinje gir et verdifullt verktøy for videre undersøkelser på HMGA2-mediert proliferative effekter og HMGA2 reguleringsmekanismer belyse utviklingen og patogenesen av hjørnetann prostatakreft. Som hunden representerer en unik naturlig modell for menneskelig prostatakreft, vil den innsikten om involvering av HMGA2 i hjørnetann prostatakreft gi fordeler for begge, mennesker og hunder, om utvikling av terapeutiske strategier og vurdering av behandlingen suksess.
Metoder
CT1258 cellelinje
de celledyrkningsforholdene, samt egenskapene til hunden prostata carcinom cellelinje CT1258 har tidligere blitt beskrevet av oss [45], [46 ].
pEGFP-C1-
HMGA2
Expression Plasmid
proteinkodende sekvens av hjørnetann
HMGA2
ble forsterket av PCR hjelp primerpar EcoRI_sA2_lo ( 5′-CGGAATTCCTAGTCCTCTTCGGCAGACT-3 «), BamHI_sA2_Up (5′-CGGGATCCCACCATGAGCGCACGCGGT-3»). De oppnådde PCR-produktene ble separert på en 1,5% agarosegel, utvinnes med QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), ligert i pEGFP-C1 vektor plasmid (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, USA) og sekvensert for bekreftelse. Transfeksjon med pEGFP-C1-
HMGA2
konstruere fører til uttrykk av en rekombinant EGFP-HMGA2 fusjonsprotein som er forventet å bli lokalisert i kjernen.
Generering av Fluorescent CT1258 cellelinjer
transfeksjon av CT1258 celler.
300.000 innfødte CT1258 celler ble sådd i 6-brønners plater 24 timer før transfeksjon og dyrket ved standardbetingelser ved bruk av medium 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Tyskland) supplert med 10% FCS (PAA Laboratories GmbH, Coelbe, Tyskland), og 2% penicillin /streptomycin (Biochrom AG, Berlin, Tyskland).
transfeksjon ble utført i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av 7,5 mL Mirus transitt-2020 reagens (Mirusbio LLC, Madison, WI, USA) i 250 mL serum-redusert Opti-MEM i-medium (Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) som inneholder 2,5 mikrogram av pEGFP-C1 (BD Biovitenskap Clontech, Palo Alto, CA, USA) eller rekombinant pEGFPC1-HMGA2 plasmid. Etter behandling ble cellene inkubert i 24 timer i kulturmediet. Opptaket og uttrykk av DNA ble verifisert ved fluorescens mikroskopi ved hjelp av en Leica DMI 6000B fluorescens mikroskop (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar Tyskland).
G418 selektivt antibiotika kill kurven analysen.
Før generasjon av fluorescerende CT1258 cellelinjer, titreringen av den riktige mengde av det selektive antibiotikum G418 (Geneticin; syn. Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) som kreves for valg av CT1258-celler ble utført med en kill kurve assay. Forskjellige konsentrasjoner G418 ble anvendt (0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 ug /ml) på 100000 opprinnelige CT1258 celler utsådd i brønnene til en 12-brønns plate. For valg av positive celler etter transfeksjon konsentrasjonen ble benyttet hvor ingen celle overlevde de øvre forholdene etter syv dager.
Valg av positivt transfekterte celler CT1258.
Fluorescent varianter av cellelinjen var CT1258 etablert for å konstitutivt uttrykke den forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) kodet av den tomme pEGFP-C1 plasmid og en EGFP-HMGA2 fusjonsprotein ved ekspresjon av rekombinante pEGFP-C1-
HMGA2
plasmid. For å etablere stabile cellelinjer CT1258, ble de transfekterte cellene valgt med det antibiotiske G418 (Life Technologies, Darmstadt, Tyskland).
å begynne med en konsentrasjon på 400 ug /ml G418 i mediet ble anvendt ved valg for stabil celler. En dag etter transfeksjon, ble kulturmediet 199 erstattet med medium 199 inneholdende G418. Deretter seleksjonsmediet ble skiftet hver 24 til 48 timer for de første to ukene som fører til valg av cellene som har stabilt inkorporert GFP-plasmidet med det kodede antibiotisk resistensgenet neomycin for seleksjon i pattedyrceller inn i deres genom DNA. Celler som ikke uttrykker konstruksjonen vil bli drept av G418. Konsentrasjonen av G418 ble senket til 300 mikrogram /ml etter tre måneder med konsistent seleksjon for vedlikehold av de genererte fluorescerende cellelinjer.
Fluorescensmikroskopi og Flow Cytometry (FCM)
GFP ekspresjon av fluorescerende cellelinjer CT1258-EGFP og CT258-EGFP-HMGA2 ble analysert etter G418-utvalget ved fluorescens mikroskopi og kvantifisert i en FACSCalibur flowcytometer (Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Tyskland) med FL-en kanal for å finne ut hvor stor prosentandel av GFP-positive celler. Cellene ble trypsinisert i 3-5 min, resuspendert i BD FACSFlow skjede Fluid (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) inneholdende 1 pM TO-PRO-3 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Tyskland), og ved en totalt antall av 1 x 10
4 arrangementene ble målt for hver prøve ved strømningscytometri. TO-PRO-3 er en langt-rød celle impermeant nukleinsyre flekk målt i FL-4-kanals tillater ultra deteksjon av dobbelt-trådet DNA fra døde celler. Analysen av flowcytometri data ble gjort ved hjelp av med Cell quest software (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA).
Immunocytochemistry
Inkludering av cellelinjene.
Cell suspensjoner av dyrkede cellelinjer ble fiksert i 4% formalin. Celle pellets som oppnås ved sentrifugering ble dyppet i parafin og kuttet i 3-4 mikrometer skiver for immunocytokjemisk farging.
immunocytokjemisk farging.
For antigen gjenfinning, mikrobølgeovn oppvarming av parafinsnitt i 0,01 M sitronsyre buffer (pH 6,0 i 20 minutter) (Quartett, Berlin, Tyskland) ble utført. Hemming av endogen peroksidase-aktivitet ble oppnådd ved neddykking i 0,5% H
2o
2 (v /v) i metanol (20 min). Etter drenering blokkeringsserum seksjonene ble inkubert med et polyklonalt geit anti-humant HMGA2 antistoff (R Merck, Darmstadt, Tyskland). Seksjonene ble kontra med Mayers hematoksylin og montert. Negative kontroller ble utført ved å erstatte de primære antistoffer ved hjelp av normalt geiteserum. For å etablere immunocytokjemiske flekker reaksjoner, ble parafinsnitt fra en hjørnetann muntlig plateepitelkarsinom brukt.
RNA Isolation og cDNA syntese
Total RNA av EGFP og EGFP-HMGA2 uttrykke samt innfødte CT1258 celler ble isolert ved hjelp av NucleoSpin miRNA (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland) kit i henhold til produsentens instruksjoner inkludert en på kolonne DNase digest å fjerne potensielle genomiske DNA forurensninger.
de respektive cDNA syntese med mRNA som templat ble utført ved anvendelse av 250 ng total-RNA fra hver prøve og den QuantiTect Reverse Transcription Kit å følge produsentens protokoll (Qiagen, Hilden, Tyskland).
for revers transkripsjon av mirnas 30 ng total RNA for hver prøve, er TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit og revers transkripsjon primer utstyrt med TaqMan mikroRNA analysene ble brukt. Alle trinn ble utført etter produsentens protokoll (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland).
HMGA1, HMGA2, SNAI1, SNAI2 Hotell og
CDH1
Real-time PCR
for relativ kvantifisering av
HMGA2, HMGA1, SNAI1, SNAI2 Hotell og
CDH1
transkripsjonsnivåer i forhold til den endogene genet kontroller
GUSB Hotell og
HPRT1
PCR-amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av Eppendorf Mastercycler ep realplex real-time PCR System (Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland).
2 ul av hver cDNA svarende til 25 ng av total RNA ble amplifisert i et totalt volum på 20 ul ved hjelp av TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) med 600 nM av hver primer og 200 nM fluorogene probe for canine
HMGA1, HMGA2
genekspresjonsanalyser (tidligere utgitt av oss i Joetzke et al. [18]. Kommersielt tilgjengelige TaqMan genekspresjon analyser ble benyttet for analyse av hjørnetann målene
SNAI1 plakater (Cf02705362_s1),
SNAI2 plakater (Cf02701218_u1) og
CDH1 product: (Cf02697525_m1) så vel som for de endogene kontroller, canine
GUSB plakater (Cf02622808_m1) og hund
HPRT1 plakater (Cf02626258_m1) (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland).
PCR-betingelsene var som følger: a. 2 min ved 50 ° C og 10 min ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser med 15 sek ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C
Alle prøvene ble målt i triplikat og for hvert forsøk ikke-templat-kontroller og ikke-revers transkriptase kontrollreaksjoner ble inkludert. En forløper effektivitet analyse av alle PCR-analyser brukt i denne studien ble utført ved å anvende den samme mal i forskjellige fortynningstrinn som dekker et størrelsesorden fem (cDNA svarende til 100 til 0,001 ng RNA). PCR-reaksjonene for alle analyserte målgener viste sammenlignbare effektivitet som sikrer et passende relativ real-time PCR-analyse. For analyse basert på ΔΔCT metode innfødte CT1258 celler ble definert som kalibrator.
La-7a
,
RNU6B
Real-time PCR
Relativ kvantifisering av hjørnetann
la-7a Hotell og
RNU6B
miRNA transkripsjonsnivåer ble utført ved hjelp av Eppendorf Mastercycler ep realplex real-time PCR System (Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland). 1,33 mL av hver cDNA ble amplifisert i et totalt volum på 20 pl ved bruk av TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland), No AmpErase UNG og TaqMan mikroRNA analyser for
la-7a plakater (Assay ID: 000377) og
RNU6B plakater (analyse ID:. 001 093) (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland)
PCR var som følger: 10 min ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser med 15 s ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C.
Alle prøver ble målt i fire eksemplarer og for hvert forsøk ikke-templat-kontroller og ikke-revers transkriptase kontrollreaksjoner ble inkludert.
A presedens effektivitet analyse av miRNA PCR-analyser som ble brukt i denne studien ble utført ved å bruke samme mal i ulike utvannings trinn, viser sammenlignbare effektivitet. For analyse basert på ΔΔCT metode kontrollgruppen ble definert som kalibrator gir i forhold real-time PCR med
la-7a
som mål genet.
Real-time PCR Statistical Analysis
Statistisk analyse av de relative real-time PCR resultatene ble utført påføre hypotesetesten med programvareverktøy REST 2009, versjon 2.0.13 (Qiagen, Hilden) [50]. REST avgjør om det er en betydelig forskjell mellom prøver og kontroller som tar hensyn til reaksjons effektivitet og bruk av randomisering teknikker. En p-verdi på ≤0.05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Cell Proliferation Assay
Spredning av innfødte CT1258 celler i forhold til den etablerte fluorescerende CT1258-EGFP og CT1258-EGFP-HMGA2 -cellelinjer ble evaluert ved anvendelse av en kolorimetrisk BrdU celleproliferasjon ELISA (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Denne analysen måler inkorporeringen av tymidinanalogen 5-brom-2-deoksyuridin (BrdU) i nylig syntetisert DNA i replikerende celler ved ELISA ved anvendelse av et anti-BrdU monoklonalt antistoff.
A totale antall 15.000 celler /brønn fra hver CT1258 cellelinje ble podet i åtte forskjellige brønner og dyrket ved de tidligere beskrevne betingelser. BrdU ble tilsatt etter 24 timer og inkubert i to timer. Analysen spredning ble utført i henhold til produsentens protokoll (Celleproliferering ELISA, kolo, Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Reaksjonsproduktene ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 370 nm (referansebølgelengde 492 nm) med et maksimum på 27 enkelt leser i løpet av et tidsrom på 30 min ved anvendelse av et scanning multi-brønn spektrofotometer utstyrt med analyseprogramvare Gen 5 (Synergy HT multi -modus mikroplateleser, BioTek Instruments Inc., Bad Friedrichs Tyskland). Absorbansverdiene Resultatene direkte relateres til mengden av DNA-syntese og herved til antall prolifererende celler.
Resultatene er angitt som middelverdier uttrykt som absorbansverdier Max V [delta 370-492] og presentert som gjennomsnitt ± standardavvik . Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av OriginPro 8 programvare (OriginLab Corporation, Northampton, USA). Shapiro-Wilk test ble anvendt for å teste om dataene er normalfordelt. Basert på resultatet av Shapiro-Wilk test, ble en paret utvalgs t-test utført for å vurdere betydningen av proliferative forskjeller mellom CT1258-EGFP, CT1258-EGFP-HMGA2 og innfødte CT1258 celler. Forskjeller ble ansett som statistisk signifikant for * p≤0.05, ** p≤0.001 til 0,01 og *** p. 0,001
kromosom Forberedelse
For kromosom utarbeidelse av CT1258-EGFP og CT1258- EGFP-HMGA2 celler colcemid (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) ble tilsatt ved en sluttkonsentrasjon på 0,1 ug /ml i 90 minutter før høsting. Deretter ble cellene inkubert i 20 minutter i hypotonisk medium (1: 6; medium 199: H
2o, (medium 199: Life Technologies GmbH, Darmstadt, Tyskland)) og til slutt fiksert med metanol /iseddik (3- :1) følgende rutinemetoder [51]. Suspensjonen ble sluppet på is-kald lysbilder og tørket i 5 dager ved 37 ° C, etterfulgt av GTG-striper som ble utført som tidligere beskrevet av [52]. Resultatene ble behandlet og registrert med BandView, 6,0, flerbestands, Applied Spectral Imaging, Israel. Karyotype beskrivelse fulgte nomenklatur foreslått av Reimann et al. [53].
Resultater
Fluorescensmikroskopi og FCM
fluorescens mikroskopi.
CT258 celler transfektert med den ikke-rekombinante pEGFP-C1 ekspresjonsvektor viste grønn fluorescens hele cytoplasma grunn EGFP uttrykk (fig. 1B), mens umodifiserte innfødte CT1258 celler viste ingen EGFP fluorescens (fig 1A.)
A:. Fallende lys bilde av den karakteristiske vekstmønster av innfødte CT1258 celler . B: Sammenslåtte bilde av EGFP uttrykker CT1258-EGFP celler; EGFP er lokalisert i cytoplasma. C: Sammenslåtte bilde av CT1258-EGFP-HMGA2 celler som uttrykker atom lokalisert EGFP-HMGA2 fusjonsprotein. D-F: Flowcytometrisk analyser av EGFP uttrykk i tre CT1258 cellelinjer som er avbildet i dot-plott som viser side scatter (SSC) vs. EGFP fluorescens. Ingen GFP fluorescens er detekterbar i native CT1258-celler (d), 84,1% av EGFP-positive celler som er til stede i CT1258-EGFP-cellelinje og (F) 97,0% EGFP-positive celler i CT1258-EGFP-HMGA2. Per prøve 1 × 10
4 hendelsene ble analysert.
Transfeksjon av CT1258 med pEGFPC1-HMGA2 resulterte i uttrykket av en rekombinant canine EGFP-HMGA2 fusjonsprotein som utelukkende kunne påvises i kjernen av de transfekterte cellene (fig. 1C).
FCM.
for bestemmelse av EGFP positive celler ved FCM ble begge fluorescerende cellelinjer i forhold til innfødte ikke-transfekterte CT1258 celler (fig. 1D ). Dead, TO-PRO-3 positive celler ble eliminert ved gating før EGFP positivitet analyse. Cellene ble målt for CT1258 i tre hundre og nittende passasjen, for CT1258-EGFP i den 27. passasje, og for CT1258-EGFP-HMGA2 i 113th passasjen.
vitalitet av cellelinjene varierte fra 85% til 93 % (data ikke vist). En gjennomsnittlig prosentandel av 84,1% EGFP-positive celler fra den totale cellepopulasjon av G418 valgt CT1258-EGFP-cellelinjen (fig. 1E), og 97,0% EGFP-positive celler for CT1258-EGFP-HMGA2 cellelinje (fig. 1F) ble fastslått .
Immunocytochemistry
om lag 50% av CT1258-EGFP cellelinjen hadde atom merking for HMGA2 (fig. 2B). I ca 70-80% av CT1258-EGFP-HMGA2 celler sterk merking for HMGA2 ble oppdaget, som var utelukkende tilstede i kjernen (figur 2C.)
A:. Native CT1258 celler, B: CT1258-EGFP celler, C: CT1258-EGFP-HMGA2 celler. Omtrent 50% av de innfødte CT1258 cellelinje og CT1258-EGFP celler viste en HMGA2-positiv atom merking. I ca 70-80% av CT1258-EGFP-HMGA2 celler, en sterk og eksklusivt atom merking for HMGA2 var synlig.
Relativ
HMGA2
Real-time PCR Expression analyse
Alle real-time PCR resultatene ble analysert basert på ΔΔCT metode. Uttrykket Forholdet mellom
HMGA2
mRNA i CT1258-EGFP celler ble funnet å være 0,88 /0,92 i forhold til
HPRT1 /GUSB
uttrykk i forhold til nivået sett i innfødte CT1258 celler (Fig. 3 ). I kontrast til
HMGA2
uttrykk i CT1258-EGFP-HMGA2 celler var 7,0 /8,0 ganger økt (i forhold til
HPRT1 /GUSB
) sammenlignet med de respektive uttrykk i native CT1258 celler (Fig . 3).
Relativ
HMGA2 /HPRT1 Hotell og
HMGA2 /GUSB
uttrykk i native CT1258, CT1258-EGFP og CT1258-HMGA2-EGFP celler. Feilfelt er standardavvik. * P≤0.05 viser en statistisk signifikant uttrykk deregulering av
HMGA2
i CT1258-HMGA2-EGFP celler i forhold til opprinnelig CT1258.
Relativ
La-7a
real-time PCR Expression Analysis
la-7a
uttrykk nivå i CT1258-EGFP og CT1258-EGFP-HMGA2 celler var 2,0 og 3,1 ganger høyere (i forhold til
RNU6B
) i forhold til den registrerte uttrykk i native CT1258 celler (fig. 4).
Relativ
la-7a Twitter /RNU6B uttrykk i native CT1258, CT1258-EGFP og CT1258-HMGA2-EGFP celler. Feilfelt er standardavvik. Ingen statistisk signifikant uttrykk deregulering av
la-7a
i CT1258-EGFP og CT1258-HMGA2-EGFP ble oppdaget i forhold til innfødte CT1258 celler. Statistiske signifikant p-verdi ble definert som ≤0.05.
Relativ
HMGA1
Real-time PCR Expression Analysis
HMGA1
nivå var 1,5 og 1,7 ganger økt (i forhold til
HPRT1 Hotell og
GUSB
) i CT1258-EGFP-HMGA2. I CT1258-EGFP celler en sammenlignbar økt uttrykk ikke kunne påvises (1,0 /1,0 i forhold til
HPRT1 Hotell og
GUSB
) sammenlignet med de innfødte celler (Fig. 5).
Relativ
HMGA1 /HPRT1 Hotell og
HMGA1 /GUSB
uttrykk i native CT1258, CT1258-EGFP og CT1258-HMGA2-EGFP celler. Feilfelt er standardavvik. * P≤0.05 viser en statistisk signifikant økt uttrykk for
HMGA1
i CT1258-HMGA2-EGFP celler i forhold til opprinnelig CT1258 og CT1258-EGFP.
Relativ
SNAI1, SNAI2 Hotell og
CDH1
real-time PCR Expression Analysis
Relativ
SNAI1
uttrykk til housekeeping gener
HPRT1 /GUSB
ble funnet å være 0.8 /0.8 henholdsvis CT1258-EGFP og 1 /1,2 i CT1258-EGFP-HMGA2 sammenlignet med innfødte celler CT1258 (figur S1).
relativ
SNAI2
uttrykk (i forhold til
HPRT1 /GUSB
) ble funnet 1,5 /1,6 i CT1258-EGFP celler og 1,4 /1,6 i CT1258-EGFP-HMGA2 celler sammenlignet med CT1258 (figur S2).
CDH1
var knapt uttrykt i alle cellelinjer med Ct-verdier høyere enn 36, og dermed en analyse av ΔΔCT metoden var ikke mulig.
real-time PCR Statistical Analysis
hypotesetest av den relative real-time PCR resultatene ble utført ved hjelp av REST verktøy 2009, versjon 2.0.13 (Qiagen, Hilden) [50]. De statistiske analysene ble utført separat for CT1258-EGFP og CT1258-EGFP-HMGA2 celler i forhold til opprinnelig CT1258.
