Abstract
Bakgrunn
Den avvikende regulering av phosphatidylinositide 3-kinaser (PI3-K) /Akt, AMP-aktivert protein kinase (AMPK) og mammalian target of rapamycin (m-TOR ) signalveier i kreft har bedt betydelig interesse for undertrykkelse av disse banene til å behandle kreft. Koffeinsyre (CA) er blitt rapportert å ha viktige anti-inflammatoriske handlinger. Imidlertid, de molekylære mekanismer som CA-derivater inkludert koffeinsyre fenetyl ester (CAPE) og koffeinsyre fenylpropyl ester (CAPPE), utvise inhibitoriske effekter på proliferasjonen av human kolorektal kreft (CRC) celler som ennå ikke er klarlagt.
metodikk /hovedfunnene
CAPE og CAPPE ble evaluert for deres evne til å modulere disse signalveier og undertrykke spredning av CRC celler både
in vitro Hotell og
in vivo
. Anti-kreft effekt av disse CA derivatene ble målt ved hjelp av spredningsanalyser, cellesyklusanalyse, western blotting-analyse, reporter gen analysen og immunhistokjemiske (IHC) flekker analyser både
in vitro Hotell og
in vivo
. Denne studien viser at CAPE og CAPPE utviser en doseavhengig inhibering av proliferasjon og overlevelse av CRC-celler ved induksjon av G
0 /G
en cellesyklus-stans og styrking av apoptotiske reaksjonsveier. Forbruk av CAPE og CAPPE betydelig hemmet veksten av tykktarmssvulster hos mus xenograft modell. Virkningsmekanismen inkluderte en modulering av PI3-K /Akt, AMPK og m-TOR signale kaskader både
in vitro Hotell og
in vivo
. I konklusjonen, resultatene viser nye anti-kreft mekanismer CA derivater mot veksten av menneskelige CRC celler.
Konklusjoner
CA derivater er potente anti-kreft agenter som utvider AMPK aktivering og fremmer apoptose i menneskelige CRC celler. Strukturen i CA derivater kan brukes for rasjonell design av nye hemmere som retter seg mot menneske CRC celler
Citation. Chiang E-PI, Tsai SY, Kuo YH, Pai MH, Chiu HL, Rodriguez RL, et al. (2014) koffein Acid Derivatives hemme veksten av tykktarmskreft: Involvering av PI3-K /Akt og AMPK signalveier. PLoS ONE 9 (6): e99631. doi: 10,1371 /journal.pone.0099631
Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan
mottatt: 03.07.2013; Godkjent: 16 mai 2014; Publisert: 24 juni 2014
Copyright: © 2014 Chiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette materialet er basert på arbeid støttet delvis av Kunnskapsdepartementet, Taiwan, ROC under ATU plan, National Science Council bevilgning under avtaler NSC-100-2320-B-039-003, 100-2628-B005-002-MY4, 101-2320-B-039-054-My3, 101-2320- B-005-006-My3, 102-2911-i-005 -301, 101-2811-B-039-024, Department of Health Grant etter avtaler DOH 102-TD-B-111-004 og DOH-102- TD-C-111-005 og Kina Medical University (CMU) tilskudd i henhold til avtaler CMU101- Award -10, CMU100-ASIA-11, CMU101-ASIA-3, og CMU101-S-25. Eventuelle meninger, funn, konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i denne publikasjonen er de av forfatteren (e) og reflekterer ikke nødvendigvis visningen av Kunnskapsdepartementet, National Science Council, Department of Health, National Chung Hsing University, Taipei Medical University , Asia University, University of California Davis og Kina Medical University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de viktigste årsakene til kreft og kreftdødelighet i mange land [1], [2]. I USA alene, er ca 50 000 dødsfall knyttet til denne kreftformen hvert år [1], [2]. Mange studier har indikert at mutasjoner av phosphatidylinositide 3-kinase (PI3-K) /Akt og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) /ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) molekyler er ofte observert i forskjellige typer av kreft [3] , [4]. For eksempel, onkogen aktivering av PI3-K /Akt-molekyler forbedrer celleproliferasjon ved å øke cyklin D1 nivå [5], [6]. Det er vel kjent at den avvikende ekspresjon av cyklin D1 og Cdk4 proteiner er involvert i proliferasjon av CRC-celler [7]. Undertrykkelse av PI3-K /Akt og MAPK /ERK signalveier som fører til blokkering av celleproliferasjon og demonstrerer viktigheten av disse signal kaskader i kontrollen av begge cellesyklusprogresjon og cellevekst i løpet av utviklingen av kreft [4], [8] . Derfor er det PI3-K /Akt og MAPK /ERK signalveier spille dominerende rolle i å bestemme skjebnen til tumorvekst. Ondartede kreftceller løsner fra den primære svulsten og migrere over strukturelle barrierer, inkludert basalmembraner og området stromal ekstracellulære matriks (ECM) [9]. Tumorinvasjon og metastase kreve både en økning i ekspresjonen av matriks-metalloproteinaser (MMP) og nedbrytning av ECM [9], [10]. MMP’er er sinkavhengige endopeptidaser stand til å nedbryte ECM komponenter [11]. Enzymer slik som MMP-9 degradere ECM og skape en mikromiljøet som opprettholder tumorutvikling [10], [11].
AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) er et drivstoff-sensing molekyl som fungerer som en regulator av energibalanse [12]. AMPK har vist seg å være ubikvitært uttrykt i pattedyrceller, og for å være involvert i energihomeostase [13]. En økt adenosin monofosfat (AMP) /adenosin-trifosfat (ATP) forhold, noe som reflekterer en reduksjon i cellens energitilstand, fører til aktivering av AMPK-proteinet ved fosforylering [14]. Styrking av AMPK aktivering antas å være omvendt korrelert med risikoen for kreft [15]. Nyere studier har videre foreslått at aktiveringen av PI3-K /Akt og MAPK /ERK-signalmolekyler er forbundet med et redusert nivå av fosforylert (aktivert) AMPK i løpet av tumorprogresjon [16], [17]. Ytterligere undersøkelser konkluderte med at AMPK agonister er effektive ved behandling av kreft [15], [18], mens andre studier viste at lipogenic enzymet fettsyre syntase (FASN) blir regulert av energiinntak og spiller en avgjørende rolle i karsinogenese [19] . En fersk studie rapporterte at FASN uttrykk er korrelert med veksten og utviklingen av CRC [20]. Fosforyleringen (dvs. aktivering) av Akt ble vist å indusere ekspresjon av FASN og å utløse aggressive kreftform i kreftceller [21]. I motsetning til dette, behandling med en AMPK agonist, som fører til aktivering av AMPK, undertrykket ekspresjon av FASN og blokkerte vekst av kolorektal tumor [22] – [24]. Videre epidemiologiske studier videre indikert at AMPK (PRKAG2) enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) er forbundet med risiko for human CRC [25]. Således har AMPK-mediert energihomeostase tiltrukket seg interesse i denne reaksjonsvei som et middel for behandling av human kreft i tykktarmen.
Mange studier har vist at fenol-forbindelser funksjon som potente antioksidanter [26]. Blant dem, koffeinsyre (CA) er en ikke-vitamin fenoliske sammensatte funnet hovedsakelig i grønnsaker og frukt. I tillegg til dens antioksidantaktivitet, utøver CA anti-inflammatorisk virkning i flere typer celler [27], [28]. Nylige undersøkelser indikerte at koffeinsyre fenetyl ester (CAPE), et derivat CA naturlig isolert fra honeybee propolis, utøver også sin gunstige effekter gjennom antioksidant og anti-inflammatorisk aktivitet [29], [30]. Videre har det blitt demonstrert at CAPE hemmer proliferasjonen av kreftceller og fungere som et potensielt anti-cancermiddel [31], [32]. Imidlertid er det ingen rapport av de inhiberende virkninger av CA-derivater på AMPK reaksjonsveien og /eller FASN ekspresjon under progresjon av CRC. Videre kan mangel på konsistente resultater på tvers av en rekke studier og unnlatelse av å bestemme virkningsmekanismen av CA derivater forklare vanskeligheten i å demonstrere
in vivo
fordelene med CA derivat tilskudd mot CRC. Vi undersøkte derfor de hemmende effekter av ulike CA derivater på menneske CRC celler både
in vitro Hotell og
in vivo
. Resultatene viste at CA-derivater slik som CAPE og koffeinsyre fenylpropyl ester (CAPPE) signifikant hemmet celleproliferasjon i humane CRC-celler. CAPE og CAPPE indusert cellesyklus-stans ved undertrykkelse av PI3-K /Akt og mTOR signalveier. Videre CA derivater redusert mobilnettet ATP nivåer og undertrykt FASN uttrykk. Virkningsmekanismen var assosiert delvis med en styrking av AMPK veien. Resultatene av denne studien tyder på at CA derivater fungere som chemopreventive midler mot menneske CRC ved å modulere PI3-K /Akt, mTOR og AMPK signalveier både
in vitro Hotell og
in vivo
.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
Menneskelige tykktarmskreftceller HCT-116 og SW-480 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Walkers, MD). Følgende monoklonale antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc .: Anti N-cadherin (# 4061), PTEN (# 9559), anti-fosforylering PDK1 (Ser241; # 3061), total-PDK1 (# 3062), anti -phosphorylation Akt (S473; # 4060), total-Akt (# 9272), anti-fosforylering GSK3α (S21; # 9327), total-GSK3α (4337), anti-fosforylering GSK3p (S9; # 9323), total-GSK3p (# 9315), anti-fosforylering FOXO3 (T32; # 9464), total-FOXO3 (# 12829), total-TSC1 (# 6935), total-TSC2 (# 3990), total-LKB1 (# 3047), total- 14-3-3 (# 8312), anti-fosforylering ERK 1/2 (T202 /Y204; # 9101), total-ERK 1/2 (# 9102), anti-fosforylering AMPKα (t172; # 2535), total- AMPKα (# 5832), anti-fosforylering m-TOR (S2448; # 5536), total-m-TOR (2983), anti-FASN (# 3180), anti-NF-kB (p65) (# 3033), anti -Cdk4 (# 2906), anti-p21
waf /cip1 (# 2947), anti-Cyclin E (# 4132), anti-Cyclin D1 (# 2978), anti-c-myc (# 9402) og anti -Lamin A (# 2032) (Danvers, MA). Den anti- β-aktin (# A2066) antistoff og forbindelse C (spesifikk hemmer av AMPK) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Den aktive Akt (Myr-akt1, Addgene plasmid # 9008) og kontrollere tom vektor (pcDNA3, Addgene plasmid # 10792) ble hentet fra Addgene. Den tumor nekrose faktor-α (TNF-α) rekombinante protein var fra R 90% ble brukt til injeksjoner
Dyr, kosthold og CA Derivative supplementation
Voksen (3-4 uker gamle) BALB /C Ann. -Foxn1 naken mus (19-22 g) ble hentet fra National Laboratory Animal senter (Taipei, Taiwan). Musene ble opprettholdt under spesifikke patogen frie forhold i anlegg som er godkjent av National Laboratory Animal Center i samsvar med gjeldende regelverk og standarder (dyr protokoll nr. 102-142-N). Bruken dyr protokollen nevnt ovenfor er gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Kina Universitetssykehus. Dyret Studien ble gjennomført i henhold til nasjonale retningslinjer og godkjent dyr protokollen for å opprettholde dyrevelferd og lindre lidelse i forsøksdyr. Under hele forsøksperioden, ble mus matet en standard Lab 5010 Diet kjøpt fra LabDiet Inc. (St. Louis, Missouri, USA). Den standard diett inneholder råfett (13,5% totalt kost energi), protein (27,5%) og karbohydrat (59%), og hadde ingen påvisbare CA-derivater, som angitt av leverandøren. Mus som var blitt bedøvet med en inhalering av isofluorane ble plassert i ryggleie. Musene ble subkutant (s.c.) injisert med humane tarmkreft HCT-116-celler (1 x 10
6 /0,1 ml medium) inn i den høyre flanken av hver BALB /C Ann-Foxn1 naken mus. En godt lokalisert bleb ble ansett å være et tegn på en teknisk tilfredsstillende injeksjon.
Etter vaksinasjonen, ble musene delt inn i tre undergrupper (n = 6 per gruppe). CA derivater ble gitt til forsøksdyr med sonde gang om dagen på et totalvolum 0,15 ml. Kapp og CAPPE grupper som hver fikk en daglig oral dose av CA derivater oppløst i maisolje (4% w /w) 50 nmol /kg av BW en gang per dag. Svulsten Kontrollgruppen fikk maisolje (4% vekt /vekt) en gang per dag bare. Normale mus uten tumor- inokuleringen ble anvendt som den negative kontroll. Tumorvolumet ble beregnet ved følgende formel: 0,524 L1 (L2)
2, hvor L1and L2 representerer den lange og korte aksen av tumoren, respektivt. BW ble bestemt en gang i uken. Ingen signifikante forskjeller i matinntak og kroppsvekt ble funnet i denne studie. Ved slutten av forsøksperioden ble dyrene avlivet ved CO
2 innånding; tumorvev ble deretter skåret ut, veiet og frosset umiddelbart. Disse tumorvev ble seksjonert og farget med Mayers hematoxilin- eosin (H E) for undersøkelse ved lysmikroskopi. De gjenværende vev i lever, lunge, milt, bukspyttkjertel og tarm ble også skåret ut, veiet og frosset for videre eksperimenter. Blodprøver ble tatt fra hjertet i en 1-ml vakutainer rør i nærvær eller fravær av heparin og sentrifugert i 10 minutter ved 1000 g for å oppnå plasma eller serum, respektivt.
Histopatologisk og immunhistokjemisk farging av tumorvev
Frosne tumorvev ble kuttet i 5 mikrometer seksjoner og umiddelbart fast med 4% paraformaldehyde. Seksjonene ble farget med Meyers Hematoxylin-Eosin (H E) for lysmikroskopi. Negative kontroller viste ikke noen farging. Tre hot spots ble undersøkt i en blindet måte per svulst delen (høy effekt felt 200 ×) fra seks ulike svulster i hver gruppe. For immunhistokjemisk farging, ble frosne vevssnitt ble behandlet med 0,3% hydrogenperoksid for å blokkere endogen peroksyd aktivitet. Ikke-spesifikke protein binding ble blokkert med 10% normalt geiteserum (NGS) i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med enten anti-FASN eller anti-PCNA primære antistoffer (1:300). Vevssnitt ble vasket med 0,1 M fosfatbuffer saltvann (PBS) og inkubert med biotinyated immunoglobin G (1:300 sekundært antistoff) ved romtemperatur i 1 time. Vevssnitt ble farget med avidin-biotin kompleks (ABC), diaminobenzidin (DAB) og hydrogenperoksyd. Cellekjerner ble farget med hematoksylin. Imaging ble utført på 200 × forstørrelser. Bilder av tumorsnitt ble kjøpt på et Olympus BX-51 mikroskopet med en Olympus DP-71 digitalt kamera og bildesystem (Olympus, Tokyo, Japan).
Utarbeidelse av protein utvinning
Menneskelig CRC HCT-116-celler ble dyrket i 10% FBS kulturmedium i nærvær av CAPE eller CAPPE i 2 timer eller 24 timer. Cellelysater (cytoplasmatiske og nukleære proteiner) fra tykktarm kreft celler ble utarbeidet etter den kjernefysiske Protein Extract Reagent Kit inneholder en proteasehemmer og fosfatase inhibitorer i henhold til produsentens instruksjoner. Etter sentrifugering i 10 minutter ved 12 000 x g for å fjerne cellerester, ble supernatantene beholdt som en cytoplasmisk ekstrakt. Krysskontaminering mellom kjernekraft og cytoplasma fraksjoner ble ikke oppdaget (data ikke vist).
Påvisning av Plasma MMP-9 av Enzyme-Linked immunosorbent assay (ELISA)
MMP-9 plasmanivå var målt med ELISA henhold til produsentens instruksjoner (R 0,05. De forskjellige symboler (# for CAPE_Akt, § for CAPE_compound C, ▴ for CAPPE_Akt, og ▪ for CAPPE_compound C) representerer en statistisk signifikant forskjell sammenlignet med hver tilsvarende CA derivative- behandlet kontrollgruppe i hver doserings undergruppe, henholdsvis, ved P 0,05. (B-C) cytoplasmatiske proteiner var forberedt på Western blotting-analyse ved hjelp av monoklonale antistoffer mot anti-fosforylering Akt (S473), total-Akt, anti-fosforylering AMPKα (t172) og total-AMPKα.
(A) menneske~~POS=TRUNC CRC SW-480-celler ble dyrket i RPMI-1640-medium med CAPE og CAPPE (i konsentrasjoner på 0, 5, 10, 20, 50 og 100 uM) i nærvær eller fravær av forbindelse C (10 uM) for 24 timer. Transfections av konstitutivt aktiv Akt (Myr-akt1) og tom vektor (pcDNA3) ble gjennomført før behandling av CA derivater. Den celleformering ble målt ved MTT-analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene er gjennomsnitt ± SD (standardavvik) av tre uavhengige eksperimenter. De forskjellige symboler (??? for CAPE og ▵ for CAPPE) representerer en statistisk signifikant forskjell i forhold til CA derivatet -untreated kontrollgruppen i hver gruppe, henholdsvis på P 0,05. De forskjellige symboler (# for CAPE_Akt, § for CAPE_compound C, ▴ for CAPPE_Akt, og ▪ for CAPPE_compound C) representerer en statistisk signifikant forskjell sammenlignet med hver tilsvarende CA derivative- behandlet kontrollgruppe i hver doserings undergruppe, henholdsvis, ved P 0,05. (B-C) cytoplasmatiske proteiner var forberedt på Western blotting-analyse ved hjelp av monoklonale antistoffer mot anti-fosforylering Akt (S473), total-Akt, anti-fosforylering AMPKα (t172) og total-AMPKα.
CAPE og CAPPE hver indusert G
0 /G
en cellesyklus arrest i CRC celler
for å finne ut om CA derivat-mediert hemming av celleproliferasjon skyldtes en arrest på et visst stadium av cellesyklus, ble effekten av CAPE og CAPPE studert videre i HCT-116 og SW-480 celler. Celler behandlet med CAPE eller CAPPE ble utsatt for flowcytometrisk analyse etter at deres DNA ble farget med PI. Histogrammer av strømningscytometriske data er vist i figur 4A. CAPE og CAPPE vesentlig indusert cellesyklus-stans i G
0 /G
en fase i en doseavhengig måte (P 0,05). Ved en konsentrasjon på 50 uM, CAPE og CAPPE betydelig øket cellesyklus-stans av HCT-116 celler i løpet av G
0 /G
1 fase med opp til 56% og 61%, respektivt, mens i kontrollgruppen prosentandelen av celler i G
0 /G
1 fase var bare 34% (figur 4B). Ved en konsentrasjon på 50 uM, CAPE og CAPPE betydelig øket cellesyklus-stans av SW-480 celler i løpet av G
0 /G
1 fase med opp til 44% og 57%, respektivt, mens i kontrollgruppen prosentandelen av celler i G
0 /G
1 fase var bare 37% (figur 4C). Disse økningene i G
0 /G
en arrestasjon var for det meste på bekostning av S og G
2 /M fase cellepopulasjoner. CAPPE synes å indusere G
0 /G
en cellesyklus arrest mer effektivt enn CAPE i menneskelige CRC celler. Således er det sannsynlig at CAPE og CAPPE hemmet celleproliferasjon i humane CRC cellene gjennom en cellesyklus-stans i G
0 /G
1 fase.
Humant CRC-celler ble synkronisert i RPMI- 1640 medium med 0,05% FBS i vevskulturskåler over natten. For å måle fordelingen av cellesyklus, celle ble dyrket i nærvær eller fravær av CAPE og CAPPE (0, 10, 50 og 100 uM) dyrket i 10% FBS RPMI-1640-medium i ytterligere 24 timer. (A) måling av cellepopulasjon ved forskjellige cellesyklusfaser ble utført ved anvendelse av strømningscytometri-analyse, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Dataene indikerer (B) HCT-116 celle (C) SW-480 cellepopulasjon prosent på ulike celle faser under behandling av CAPE eller CAPPE i menneskelige CRC celler. Humane CRC (D) HCT-116-celler (E) SW-480-celler ble behandlet med enten CAPE eller CAPPE (i konsentrasjoner på 0, 5, 10, 20, 50 og 100 uM) i 10% FBS RPMI-1640 i 24 timer . Nukleære proteiner ble fremstilt for Western blot-analyse ved anvendelse av monoklonale antistoffer mot cyklin D1, Cdk4, PCNA, og lamin A antistoffer, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Nivåene av gjenkjenning representerer mengder av cyclin D1, Cdk4 og PCNA i kjernen av menneskelige CRC celler. Resultatene (gjennomsnitt ± SD) representerer folder endring i kontrollgruppen og er representative for tre forskjellige eksperimenter. De immunoreaktive band blir merket med en pil. De midlere integrert tettheten av disse proteinene justert med den interne kontrollen lamin A-proteinet er vist i nederste raden.
