Abstract
Samler bevis indikerer at en liten bestand av kreft stamceller (cscs) er involvert i iboende motstand mot kreftbehandling. Den hypoksisk mikromiljøet er en viktig stamcelle nisje som fremmer utholdenhet av cscs i svulster. Vårt mål var her for å belyse rollen av hypoksi og cscs i motstanden til gefitinib i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) med aktivering av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) mutasjon. NSCLC cellelinjer, PC9 og HCC827 som uttrykker
EGFR
exon 19 delesjonsmutasjoner, ble utsatt for høy konsentrasjon av gefitinib henhold normoksiske eller hypoksiske forhold. Syv dager etter gefitinib eksponering, ble en liten brøkdel av levedyktige celler detektert, og disse ble referert til som «gefitinib-resistente persisters» (GPR). CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4, og ALDH1A1-alle gener involvert i stemness-var sterkt uttrykt i GPR i PC9 og HCC827 celler, og PC9 GPR utstilt et stort potensial for tumorigenicity
in vivo
. Ekspresjon av insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF1) ble også oppregulert og IGF1 reseptor (IGF1R) ble aktivert på GPR. Viktigere, hypoksisk eksponering betydelig økt sfære formasjon, noe som reflekterer den selvfornyelse evne, og befolkningen i CD133- og Oct4-positive GPR. I tillegg hypoksi oppregulert IGF1 uttrykk gjennom hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF1α), og markert fremmet aktivering av IGF1R på GPR. Knockdown av IGF1 uttrykk betydelig redusert fosforylerte IGF1R-uttrykke GPR henhold hypoksiske forhold. Til slutt, hemming av HIF1α eller IGF1R av spesifikke hemmere betydelig redusert bestanden av CD133- og Oct4-positive GPR, som ble økt med hypoksi i PC9 og HCC827 celler. Sammen er disse funnene tyder på at hypoksi økte befolkningen i lunge cscs resistente mot gefitinib i
EGFR
mutasjonspositive NSCLC ved å aktivere IGF1R. Målrette det IGF1R veien kan være en lovende strategi for å overvinne gefitinib motstand i
EGFR
mutasjonspositive NSCLC indusert av lunge cscs og mikromiljøet faktorer som svulsten hypoksi
Citation. Murakami A, Takahashi F , Nurwidya F, Kobayashi jeg, Mina K, Hashimoto M, et al. (2014) Hypoksi Øker Gefitinib-Resistant Lung Cancer Stem Cells gjennom Aktivering av insulin-like Growth Factor 1 Receptor. PLoS ONE 9 (1): e86459. doi: 10,1371 /journal.pone.0086459
Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA
mottatt: 1 juli 2013; Godkjent: 13 desember 2013; Publisert: 28 januar 2014
Copyright: © 2014 Murakami et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Grant-in-Aids for Scientific Research nr 23591906 (Fumiyuki Takahashi) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kjøpet av resistens mot kreft narkotika er fortsatt et viktig hinder for å bedre prognosen for kreftpasienter. Resistens kan skje gjennom en rekke mekanismer, inkludert legemiddelutstrømningen fra kreftceller, utvidet legemiddelmetabolisme, sekundære mutasjoner i stoffet målet, og engasjement av alternative overlevelses trasé [1]. Disse mekanismene av ervervet resistens er vanligvis forårsaket av genetiske endringer i tumorceller, som vedvarer under kreftbehandling. Imidlertid har nyere studier viser også ikke-mutasjonsmekanismer legemiddelresistens, inkludert eksistensen av liten bestand av kreft stamceller (cscs) [2]. Cscs, som også er kjent som tumor-initiering celler og stilk-lignende kreftceller, uttrykte stamcellemarkører inkludert CD133, ABCG2, Bmi-en, og Oct4, og kan danne flytende kuler i serumfritt medium, en eiendom i forbindelse med stilk cellene [3] – [5]. Økende bevis indikerer at små bestander av cscs er egentlig mer motstandsdyktige overfor en rekke kreftmedisiner og er ansvarlig for motstanden mot kreft behandling, som ofte følger med svulst tilbakefall [6]. Dermed kan målretting cscs forbedre behandlingsresultatene og føre til utvikling av nye behandlingsformer for kreftpasienter.
Stamcelle «nisjer» er definert som spesielle steder eller microenvironments som opprettholder egenskapene til stamcelleselvfornyelse og multipotency [ ,,,0],7], [8]. Solide svulster ofte inneholde områder med utilstrekkelig oksygentilførsel, en tilstand som kalles hypoksi, og flere nylige rapporter har antydet at hypoksi fremmer utholdenhet av cscs i tumorer [9]. Dette hypoksisk nisje er ansvarlig for vedlikehold CSC og spiller en rolle i å fremme terapeutisk motstand [10]. Dermed rettet mot hypoksiske mikromiljøet kan være en annen lovende strategi for effektiv kontroll av cscs [9].
Avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [11]. Somatiske mutasjoner i den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) genet, for eksempel en i-ramme slettingsmutasjon i exon 19, er forbundet med positiv respons til de EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer (EGFR-TKI), gefitinib og erlotinib [12]. EGFR kinase domene mutasjoner oppstå på et vesentlig høyere frekvens i svulster fra Østasiater pasienter sammenlignet med ikke-asiater [13]. Men i de fleste rapporter, progresjonsfri overlevelse av pasienter ikke overstige 12 måneder, og de fleste pasientene utviklet ervervet resistens [14]. I tillegg 25-30% av pasientene er egentlig motstandsdyktig mot EGFR-TKI som deres svulster er diagnostisert som skjuler aktiverende mutasjoner i
EGFR product: [15], [16]. De viktigste resistensmekanismer er identifisert til å omfatte videregående mutasjoner og en «onkogen kinase bryteren.»
EGFR
T790M mutasjon står for 50% av tilfellene, og
MET
forsterkning kan påvises i 20 % av pasienter med
EGFR
-mutant TKI bestandig NSCLC [17]. Imidlertid er mekanismene som er ansvarlige for å oppnå egenmotstand og andre ervervet resistens mot EGFR-TKI, samt å stille spørsmålet om cscs og hypoksiske nisjer bidra til EGFR-TKI motstand, er ikke fullt ut forstått.
IGF1R er et transmembran reseptor-tyrosin-kinase er ansvarlig for cellulær proliferasjon og overlevelse [18]. IGF1R er uttrykt i mange typer kreftceller, inkludert NSCLC [18], og forsterket aktivering av IGF1R er implisert i resistens mot kjemoterapi og målrettede terapier slik som EGFR-TKI [19], [20]. Flere nyere rapporter har antydet at IGF1R spiller en avgjørende rolle i overlevelse av noen cscs [21]. Kjemoresistent kolorektal kreft celler ble beriket for cscs og økt følsomhet for IGF1R hemming [21]. I henhold til Sharma et al., Medikamenttoleranse subpopulasjon følgende dødelig medikament eksponering viste seg å ha den CSC fenotype og uttrykt fosforylert IGF1R i flere testede cellelinje modellene, inkludert NSCLC-cellelinjen PC9. Cotreatment av PC9 celler med EGFR-TKI pluss IGF1R hemmer hindret fremveksten av narkotika-tolerant CSC fenotype [2]. Kollektive funnene tyder på en mulig rolle for IGF1R signalering i stoffet toleranse for cscs til EGFR-TKI. Imidlertid har sammenheng mellom hypoksi, cscs, og IGF1R signalering i EGFR-TKI motstand ikke avklart.
I denne studien undersøkte vi hvilken rolle hypoksi i utholdenhet av lunge cscs i gefitinib motstand i NSCLC med aktivering
EGFR
mutasjoner. Den NSCLC cellelinjer PC9 og HCC827, bærer en aktive
EGFR
mutasjon, ble utsatt for en høy konsentrasjon av gefitinib henhold normoksiske eller hypoksiske forhold. Vi fant at hypoksi økt gefitinib bestandig lunge cscs i
EGFR
mutasjon-positive NSCLCs ved å aktivere IGF1R. Den biologiske betydningen av hypoksi for utholdenhet av gefitinib bestandig cscs og forbedret aktivering av IGF1R ble undersøkt.
Materialer og metoder
Cell Kultur og reagenser
NSCLC cellelinjer PC9 og HCC827, som uttrykker
EGFR
exon 19 delesjonsmutasjoner (ΔE746-A750), ble brukt i denne studien. PC9 celler ble etablert i Tokyo Medical University (Tokyo, Japan), som beskrevet tidligere [22], og ble vennlig levert av Dr. Kazuto Nishio (Institutt for Genome Biology, School of Medicine, Kinki University, Osaka). HCC827 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellelinjer ble verifisert til å være mycoplasma-fri. Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Wako, Osaka, Japan) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin (100 U /ml og 100 ug /ml, henholdsvis), og ble dyrket i en fuktet 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C i en inkubator, hvori oksygen spenningen ble holdt ved enten 21% (normoxia) eller 1% (hypoksi). Gefitinib ble kjøpt fra JS Forskning Chemicals Trading (Wedel, Tyskland). YC-en og AEW541 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) og Selleck Kjemikalier (Houston, Texas, USA), henholdsvis.
Generering av gefitinib-resistente Persisters (GPR)
Det er totalt 2 × 10
5 celler ble sådd ut i ti 10-cm plater og lov til å følge i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med gefitinib ved en konsentrasjon på 1 pM, som er 30-50 ganger den etablerte IC
50-verdier, og inkubert i henhold til normoxia (21% O
2) eller hypoksi (1% O
2). Media ble erstattet med ferske medier som inneholder gefitinib hver 3. dag. Levedyktige celler som forble festet på fatet på dag 7 etter normoksiske eller hypoksiske forhold ble ansett for å være gefitinib bestandig persisters (GPR) eller hypoksisk gefitinib bestandig persisters (hypoksiske GPR), henholdsvis, og ble samlet inn for analyse. Den genetiske identiteten til GPR med foreldre cellene ble bekreftet ved hjelp av GenomeLab Menneskelig STR Primer satt fra Beckman Coulter (Fullerton, CA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner.
Kvantitativ Real-time PCR
Totalt RNA ble ekstrahert fra cellelinjer ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation kit (Ambion, Austin, TX, USA). cDNA ble generert fra en eller to mikrogram av RNA ved hjelp av First-Strand cDNA Synthesis kit (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) i henhold til produsentens protokoll. Kvantitativ real-time PCR (qPCR) ble utført ved hjelp av Fast SYBR Grønn Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) som tidligere beskrevet [22]. Følgende program ble kjørt: holding ved 95 ° C i 20 sekunder, forsterkning via 40 sykluser (denaturering 95 ° C i 3 sekunder, annealing, og forlengelse ved 60 ° C i 30 sek), med samtidig smelte-kurve analyse. Vi evaluerte elleve husholdningsgener (
ACTB, GAPDH, UBC, B2M, YWHAZ, SF3A1, 28S rRNA, EIF4A2, SDHA, Top1, etter og
ATP5B
) i eksperimentelle prøver å identifisere de mest stabilt uttrykte kontroll gener ved hjelp geNorm programvare (https://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/). Actin beta (
ACTB
) og succinatdehydrogenase komplekse, underenhet A flavoprotein (
SDHA
) ble identifisert som de mest stabile housekeeping gener i våre cellemodeller av qPCR analyse; Derfor
ACTB
eller
SDHA
ble brukt som internkontrollen
De primere som var spesifikke for genene var som følger:.
CD133
Forward, 5′-GGCCCAGTACAACACTACCAA-3 «
Omvendt, 5′-CGCCTCCTAGCACTGAATTGATA-3′
Oct4
Forward, 5′-GAGTGAGAGGCAACCTGGAG-3 «
Omvendt, 5′-GCCGGTTACAGAACCACACT-3′
Sox2
Forward, 5′-TACAGCATGTCCTACTCGCAG-3 «
Omvendt, 5′-GAGGAAGAGGTAACCACAGGG -3 «
Nanog
Forward, 5′-TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT-3′
Omvendt, 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG-3 «
CXCR4
Forward, 5′-ACGCCACCAACAGTCAGAG-3 «
Omvendt, 5′-AGTCGGGAATAGTCAGCAGGA-3′
ALDH1A1
Forward, 5′-GCACGCCAGACTTACCTGTC-3 «
Omvendt, 5′-CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG-3 «
IGF1
Forward, 5′-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3′
Omvendt, 5′-CGACTGCTGGAGCCATACC-3 «
immunfluorescens
PC9 eller HCC827 celler ble dyrket på Lab-Tek kammer II lysbilder (Nunc, Rochester, NY, USA) med eller uten en mikrometer eller to mikrometer gefitinib og under normoksiske eller hypoksisk betingelser i 72 timer, fiksert med 8% paraformaldehyd i 20 minutter, og permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i 3 min. Etter blokkering med 10% geiteserum i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 30 minutter ved romtemperatur, ble cellene inkubert ved 4 ° C over natten med følgende primære antistoffer: CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), OCT4 (i Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), IGF1 (Abcam, Cambridge, UK), og pIGF1R (Sigma-Aldrich). Proteiner ble synliggjort ved inkubering med sekundært antistoff merket med Alexa Fluor 488 geite-anti-kanin-IgG eller Alexa Fluor 594 geit-anti-mus IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Lysbilder ble montert ved hjelp Vectashield Mounting Medium DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Bilder ble innhentet på en Axioplan 2 imaging (Zeiss, Oberkochen, Tyskland) med AxioVision programvare (ZEISS). Bilder som brukes for sammenligninger av ulike celler og /eller behandlinger ble kjøpt med de samme instrumentinnstillinger og eksponeringstider og ble behandlet på samme måte. Antallet CD133-, Oct4-, og fosforylerte IGF1R-positive celler ble tellet; forholdet mellom positive celler ble beregnet i fem felt for hvert forsøk.
Sphere Forming analysen
encellede suspensjonskulturer ble utarbeidet med en tetthet på 2,5 × 10
3 celler per brønn i serumfritt medium DMEM /F12 (Gibco, Grand Island, NY, USA) supplert med kommersiell hormonblanding B27 (Gibco), EGF (20 ng /ml, Gibco), FGF (20 ng /ml; Invitrogen), og heparin ( 2 ug /ml), og utsådd i 6-brønners ultralave festeplater (Corning, Corning, NY, USA). PC9 foreldre celler og GPR ble inkubert i henhold normoksisk forhold, mens PC9 hypoksiske GPR ble inkubert i henhold hypoksiske forhold. Kultur medium ble erstattet hver 3 dager; antallet og størrelsen av kulene ble registrert og immunofluorescens-analyser ble utført 7 dager etter starten av kulturen perioden [23].
RNA interferens
Små interfererende RNA (sirnas) målretting IGF1 ( Stealth Velg RNAi siRNA) ble spesial syntetisert av Invitrogen. En negativ kontroll ble også kjøpt fra Invitrogen. PC9 eller HCC827 celler ble transfektert med 2 forskjellige spesifikke sirnas og en ikke-spesifikk kontroll ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble løsnet og fortynnet i fullstendig vekstmedium uten antibiotika og deretter sådd ut i hver av brønnene. RNAi dupleks og Lipofectamine RNAiMAX ble blandet i Opti-MEM®I (Gibco) redusert serummedium og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. RNAi duplex-Lipofectamine ™ RNAiMAX kompleksene ble tilsatt til brønnene som inneholdt cellene. Cellene ble deretter inkubert i 48 timer ved 37 ° C
Sekvensene av siRNA mot IGF1 var som følger:.
IGF1 # 1:5′-ACACCAUGUCCUCCUCGCAUCUCUU-3 «
IGF1 # 2:5′-UGCUGCUUCCGGAGCUGUGAUCUAA-3 «
Colony hemningsmetoden
PC9 celler (2 × 10
5) eller HCC827 celler (4 × 10
5) ble sådd ut i 10-cm plater og tillatt å holde seg i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert med 1 pM eller 2 uM gefitinib, og med eller uten 0,01 uM, 0,1 uM, uM eller en AEW541 henhold hypoksiske betingelser i 18 dager for PC9 celler eller 11 dager for HCC827 celler. Etter inkubasjon ble antall kolonier telles.
In vivo
tumorgenisitetsstudie
NOD /Shi-SCID /IL-2Rcnull (NOG) mus (7-uke- gammel, kvinne) ble kjøpt fra sentral~~POS=TRUNC for forsøksdyr (Kanagawa, Japan). Alle mus ble sendt til Juntendo universitetet og ble opprettholdt under patogen-frie forhold. Musene ble huset i et rom med kontrollert temperatur (25 ° C), fuktighet og lys (12-timers lys /mørke-syklus).
Ad libitum
tilgang til mat og vann fra springen var lov i hele studieperioden. For å evaluere
in vivo
karsinogent potensial, 1 x 10 celler eller 1 × 10
2 celler PC9 foreldre celler og normoksiske og hypoksiske PC9 GPR ble blandet med Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) og injiseres i begge flankene av Nog mus. Svulstdannelse ble evaluert 22-50 dager etter injeksjon.
Etikk
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med de grunnleggende retningslinjer for forsvarlig gjennomføring av dyreforsøk og relaterte aktiviteter i akademisk forskning institusjoner under jurisdiksjonen til departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (merknad nr 71, 2006), og ble godkjent av komiteen for forsøk med dyr av Juntendo University med godkjenning nr 240182.
Statistisk analyse
Verdier ble sammenliknet med en to-tailed Student
t
-test. Å sammenligne flere grupper, ble en enveis variansanalyse (ANOVA) test brukt. Statistisk analyse av kulen størrelse ble utført ved anvendelse av Kruskal-Wallis test. Forskjeller mellom midlene ble ansett som statistisk signifikant når p. 0,05
Resultater
Isolering og Gene Expression Analyse av gefitinib bestandig Persisters (GPR) avledet fra NSCLC cellelinjer huse en Aktivering
EGFR
mutasjon
NSCLC cellelinje PC9, bærer en aktive
EGFR
mutasjon, ble behandlet med en mikrometer gefitinib. Som beskrevet i en tidligere rapport [2], kan en liten brøkdel av levedyktige celler overlever og forbli 7 dager senere, mens de fleste celler var døde innen noen få dager (figur 1B). Vi henvist til disse cellene som gefitinib bestandig persisters (GPRS). Selv om GPR var ekstremt hvile, GPR gjenopptatt prolifererende under høy konsentrasjon av gefitinib (figur 1C) og til slutt viste normal proliferasjon (figur 1D). En tilsvarende befolkning på GPR ble oppdaget i den andre NSCLC cellelinje testet, HCC827 huse en følsom
EGFR
mutasjon, ved behandling med en mikrometer gefitinib (data ikke vist).
Først, 2 × 10
5 PC9-celler ble sådd ut i 10-cm plater og tillatt å holde seg i 24 timer (A). Cellene ble deretter behandlet med 1 pM gefitinib. Fresh media holdig gefitinib ble erstattet hver 3. dag. Syv dager etter eksponering gefitinib, en liten brøkdel av levedyktige celler forble (B), gjenopptok prolifererende 18 dager senere (C), og fortsatte å proliferere og med 30 dager senere (D). A. Representant mikroskopisk bilde av foreldre PC9 celler. B, C, D. Representative bilder av PC9 GPR utsatt for en mikrometer gefitinib for 7, 18, og 30 dager ble fotografert, henholdsvis.
Den genetiske identiteten til GPR med foreldre celler ble bekreftet ved hjelp av en PCR-basert analyse (GenomeLab Menneskelig STR Primer satt fra Beckman Coulter) som undersøker et sett av 12 korte tandem repetisjoner. Analyse av genomisk DNA fra foreldre celler og GPR av PC9 og HCC827 celler er vist i figur S1 i Information S1. STR profiler av foreldre celler og GPR er samme. I tillegg GPR av PC9 og HCC827 celler beholdt
EGFR
ekson 19 mutasjon (ΔE746-A750), som vurderes ved direkte sekvensering (data ikke vist). Samlet utgjør disse funnene bekrefter at GPR ikke oppstå fra forurensende celler. Verken
EGFR
T790M mutasjon eller
MET
genamplifisering ble observert i GPR både PC9 og HCC827 celler (data ikke vist). Tyrosin kinase Src ble ikke aktivert i GPR både PC9 og HCC827 celler sammenlignet med ubehandlede foreldre celler (Figur S2 i Information S1). EGFR og HER3 ble aktivert på foreldre PC9 og HCC827 celler, men uttrykk ble undertrykt markert på GPR av begge cellelinjer (figur S2 i Information S1).
For å identifisere mekanismen bak gefitinib motstand i vår celle modell, vi først analysert genuttrykk i foreldre celler og GPR bruker qPCR. Den antatte lunge CSC markør CD133 ble sterkt uttrykt i GPR i PC9 og HCC827 celler (Figur 2A), noe som tyder på en stemness fenotype. For ytterligere å avgjøre om GPR kunne avsløre hva som kjennetegner cscs i våre cellemodeller, vurderte vi uttrykket av gener som regulerer og opprettholde stamcelleforskningen fenotype. Interessant, genekspresjon av Oct4, Sox2, og Nanog, som også er kjent for å være involvert i omprogrammering mus eller humane somatiske celler til udifferensierte, pluripotente stamceller, ble signifikant økt i GPR i PC9 celler, som viser økninger på 3,4 ganger 5,4 fold, og 6,9-fold, henholdsvis i paren PC9-celler (figur 2A). Videre er ekspresjon av CXCR4 og ALDH1A1, også vist seg å være forbundet med CSC-fenotype, ble oppregulert (figur 2A). Lignende resultater ble oppnådd for HCC827 GPR (figur 2A).
En annen kjent stamcelle gener som ABCG2, Bmi-en, og CD117 (c-Kit), ikke ble oppregulert i GPR (data ikke vist).. Kvantitativ RT-PCR ble utført med primere spesifikke for CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4, og ALDH1A1, som er stemness gener i PC9 eller HCC827 foreldre celler og GPR. B. Kvantitativ RT-PCR ble utført med primere spesifikke for IGF1 og IGF1R i PC9 eller HCC827 foreldre celler og GPR. Data ble normalisert til aktin uttrykk. * P 0,01, ** p 0,001, *** p. 0,0001
En tidligere rapport viste også at IGF1R var fosforylert og aktivert i EGFR-TKI-tolerante celler i PC9 celler og at IGF1R en inhibitor, AEW541, kunne hindre fremveksten av disse resistente celler [2]. Vi undersøkte IGF1 og IGF1R uttrykk ved hjelp qPCR i vår celle modell. IGF1 uttrykk ble dramatisk oppregulert i PC9 GPR forhold til PC9 foreldre celler, som viser økning på 49,8 ganger (figur 2B). IGF1R uttrykk ble noe økt i GPR (figur 2B). Lignende resultater ble oppnådd for GPR i HCC827 celler (figur 2B).
Samlet utgjør disse funnene tyder på at den lille bestanden av NSCLC celler som ble høyanriket for genekspresjon av stemness og IGF1 overlevde og kunne fortsette voksende henhold behandling en høy konsentrasjon av gefitinib.
Sphere dannende Evne og tumorgenisiteten av GPR ble oppregulert og Sphere dannelse av GPR økt etter eksponering for hypoksisk betingelser
for å ytterligere evaluere stemness av GPR, Sphere forming analyser gjenspeiler selvfornyelse aktivitet og
in vivo
tumorigenitet studiene ble utført. Evnen til å danne sfærer var signifikant høyere i PC9 GPR enn i parentale celler (figur 3A). Viktigere, hypoksi betydelig økt antall kuler av PC9 GPR (figur 3A). Sfære størrelse av PC9 GPR henhold hypoksiske betingelser var betydelig større enn for parentale celler (figur 3B). Immunofluorescence Resultatene viste at kuler av GPR var positive for CD133, Oct4, og fosforylert IGF1R (figur 3C). I tillegg injiseres vi 1 x 10 celler eller 1 × 10
2 celler av foreldre PC9 celler og normoksiske og hypoksiske GPR i begge flankene av nog mus og sammenlignet karsinogent potensial
in vivo
. Tumor forekomst av normoksiske og hypoksiske GPR i mus var høyere enn i foreldre celler (tabell 1). Spesielt, normoksisk og hypoksiske GPR dannet tumorer i to og fem av 16 nog mus ved 1 x 10 celler /injeksjon, henholdsvis, selv om foreldrecellene ikke danner tumorer (tabell 1). Forskjellen i tumordannelse mellom foreldrenes cellegruppe og hypoksiske GPR gruppe med injeksjon av 1 x 10 celler var statistisk signifikant (* p = 0,040). Samlet utgjør disse funnene tyder på at GPR beriket for stemness markører har karakteristiske trekk ved stamcelle fenotype og at hypoksiske mikro oppregulert og vedlikeholdes stamcelle egenskapene til GPR, slik som sfæren dannende evne og tumorigenicity.
PC9 parentale celler, GPR og hypoksiske GPR ble fremstilt med en tetthet på 2,5 x 10
3 celler per 2 ml per brønn i serumfritt medium supplert med vekstfaktorer og sådd inn i 6-brønners ultra-lav festeplatene. PC9 foreldre celler og GPR ble inkubert i henhold normoksisk forhold, mens PC9 hypoksiske GPR ble dyrket under hypoksiske forhold. Kulturmedium ble matet hver 3. dag. Antallet og størrelsen av sfærer ble registrert og immunofluorescens ble utført 7 dager etter starten av kulturen perioden. Sfærer ble fiksert og inkubert med primære antistoffer mot CD133, Oct4, eller fosforylert IGF1R (pIGF1R), og deretter med sekundært antistoff merket med Alexa Fluor 594 geit-anti-mus IgG (rød) eller Alexa Fluor 488 geit-anti-kanin-IgG (grønn) . Cellekjerner ble farget med DAPI (blå). Bilder ble innhentet på en Axioplan 2 imaging system med AxioVision programvare. A. Antall kuler ble betydelig økt i PC9 GPR sammenlignet med i foreldre celler, og ble ytterligere økt i PC9 hypoksiske GPR. * P 0,01, # p 0,05. B. Sphere størrelse av PC9 hypoksiske GPR var signifikant større enn for foreldrecellene. # P 0,05. C. Immunofluorescent bilder av kontrollceller av PC9 (til venstre) og kuler av GPR (til høyre) for CD133, Oct4, og pIGF1R.
Befolkning av CD133- og Oct4-positive GPR ble Økt Under hypoksiske betingelser
for å undersøke hvilken rolle hypoksi på generering og utholdenhet av gefitinib bestandig stamcelle befolkningen, evaluert vi CD133- og Oct4-positive GPR henhold normoksiske og hypoksiske forhold ved hjelp av immunfluorescens. Som vist i figur 4A og 4B, hypoksi betydelig økt populasjon av CD133- og Oct4-positive GPR i PC9 og HCC827 celler.
A, B. PC9 eller HCC827 celler, som vokser på Lab-Tek kammers objektglass med eller uten en eller to uM gefitinib og under normoksiske og hypoksiske betingelser i 72 timer, fiksert, og inkubert med primære antistoffer mot CD133 (A) og Oct4 (B), og deretter med sekundært antistoff merket med Alexa Fluor 594 geit-anti-mus IgG (rød). Cellekjerner ble farget med DAPI (blå). Bilder ble innhentet på en Axioplan 2 imaging system med AxioVision programvare. Bilder som brukes til å sammenligne foreldre celler, GPR, og hypoksiske GPR ble anskaffet ved hjelp av de samme instrumentinnstillinger og eksponeringstider og ble behandlet på samme måte. Tallene for CD133 og Oct4-positive celler ble tellet, og forholdet mellom disse cellene ble beregnet i fem felt i hvert eksperiment. ** P 0,001, * p 0,01, # p. 0,05
IGF1R ble aktivert på GPR Under hypoksiske betingelser, og knockdown av IGF1 Redusert befolkning på CD133- og Oct4-positive hypoksisk GPR
for å undersøke effekten av hypoksi på aktivering av IGF1R, undersøkte vi genuttrykket av IGF1 i GPR ved qPCR samt fosforylering av IGF1R på GPR bruker immunfluorescens henhold normoksiske og hypoksiske forhold. Som vist i figur 5A, IGF1 mRNA-ekspresjon var mye høyere i PC9 GPR enn i paren PC9-celler og ble oppregulert ved eksponering for hypoksiske betingelser. Viktigere var fosforylert IGF1R uttrykt på PC9 GPR, og eksponering for hypoksi markert oppregulert befolkningen i fosforylerte IGF1R-uttrykke PC9 GPR (figur 5B).
A. Kvantitativ RT-PCR ble utført med primere spesifikke for IGF1 i PC9 eller HCC827 foreldre celler, GPR, og hypoksiske GPR. Data ble normalisert til aktin uttrykk. ** P 0,001. B. PC9-celler, dyrket på Lab-Tek kammers objektglass, med eller uten 1 mM gefitinib og under normoksiske og hypoksiske betingelser i 72 timer, faste, og inkubert med primære antistoffer mot fosforylert IGF1R (pIGF1R) og deretter med sekundære antistoffer merket med Alexa Fluor 488 geit-anti-kanin-IgG (grønn). Cellekjerner ble farget med DAPI (blå). Bilder ble oppnådd ved å bruke en Axioplan to system bildebehandling med AxioVision programvare. Bilder brukes til å sammenligne PC9 foreldre celler, GPR, og hypoksiske GPR ble kjøpt med de samme instrumentinnstillinger og eksponeringstider, og ble behandlet på samme måte. Antallet pIGF1R-positive celler ble tellet, og forholdet mellom disse cellene ble beregnet i fem felt i hvert eksperiment. ** P 0,001. C. IGF1 uttrykk ble slått ned i PC9 eller HCC827 hypoksiske GPR ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA) i Lab-Tek kammer lysbilder. Immunfluorescens farging for pIGF1R, CD133, eller Oct4 ble deretter utført. To spesifikke sirnas og en ikke-spesifikk kontroll ble anvendt. Numrene på pIGF1R-, CD133- og Oct4-positive celler ble tellet, og forholdet mellom disse cellene ble beregnet i fem felter for hvert eksperiment. ** P 0,001, * p. 0,01
For å klargjøre den biologiske betydningen av IGF1 i gefitinib motstand i vår hypoksisk celle modell, vi slått ned IGF1 uttrykk i hypoksiske GPR av PC9 og HCC827 celler ved hjelp to forskjellige spesifikke sirnas (# 1 og # 2, fig S3 i Information S1). Som vist i figur 5C, knockdown av IGF1 betydelig redusert fosforylerte IGF1R-uttrykk GPR, og redusert CD133- og Oct4-positive GPR henhold hypoksiske betingelser. Disse funnene tyder på at IGF1 spiller en rolle i aktivering av IGF1R og vedlikehold av gefitinib bestandig cscs.
Hypoksi Regulerer IGF1 Expression gjennom HIF1α, og Hemming av HIF1α eller IGF1R Redusert CD133- og Oct4-positive GPR Under hypoksi
for ytterligere å undersøke effekten av hypoksi på oppregulering av IGF1 og aktivering av IGF1R, downregulated vi hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF1α) uttrykk i hypoksiske GPR ved hjelp av spesifikke HIF1α inhibitor YC-en. Behandling med YC-1 hemmet HIF1α uttrykk betydelig i både PC9 og HCC827 celler under hypoksi på en doseavhengig måte (figur S4 i Information S1). Som vist i figur 6A, inhibering av HIF1α av YC-1-behandling også undertrykkes IGF1 uttrykk i hypoksiske GPR, og betydelig redusert IGF1R fosforylering på GPR under hypoksi. Videre YC-en behandling betydelig redusert bestanden av CD133- og Oct4- positive hypoksiske GPR. Til slutt behandling med IGF1R inhibitoren AEW541 betydelig redusert populasjonen av CD133- og Oct4-positive GPR på en doseavhengig måte etter gefitinib eksponering under hypoksiske betingelser (figur 6B). I tillegg ble antallet kolonier bestående av GPR undertrykkes i betydelig grad ved AEW541 henhold hypoksiske betingelser (figur 6C). Samlet utgjør disse funnene sterkt at hypoksi regulerer IGF1 uttrykk gjennom HIF1α, og at oppregulert IGF1 induserer aktivering av IGF1R og øker gefitinib bestandig cscs i
EGFR
mutasjon-positive NSCLC celler under hypoksi.
A. HIF1α uttrykk ble undertrykt i PC9 eller HCC827 hypoksiske GPR ved behandling med 50 M, 100 mikrometer, og 200 mikrometer YC-1 i Lab-Tek kammer lysbilder. Immunfluorescens farging for IGF1, fosforylert IGF1R (pIGF1R), CD133, og Oct4 ble deretter utført. Figur S1. Figur S2. Figur S3. Figur S4.
