Abstract
Androgen deprivasjon (AD) er en effektiv metode for å begynne å undertrykke prostatakreft (PC) progresjon. Imidlertid androgen-ildfast PC-celler uunngåelig kommer ut av androgen-responsive tumor, som fører til uhelbredelig sykdom. Nyere studier har vist AD induserer cellealdring, et fenomen som er celle-autonomt tumor-undertrykkende, men som gir tumor-fremme tilpasninger som kan lette ankomsten av senescence bestandig ondartede cellepopulasjoner. Fordi androgen-ildfast PC celler dukke clonally fra opprinnelig androgen-responsive tumor, søkte vi å undersøke om AD-induced senescence (ADIS) påvirker oppkjøp av androgen-ildfast atferd i androgen-responsive LNCaP og LAPC4 prostata kreft celler. Vi finner at gjentatt eksponering av disse androgen-responsive celler til alderdom fremkallende stimuli via syklisk AD fører til den raske fremveksten av ADIS-resistent, androgen-ildfast celler fra mesteparten senescent cellepopulasjon. Våre resultater viser at det ADIS fenotype er forbundet med tumor-fremmende egenskaper, særlig chemoresistance og forbedret pro-overlevelse mekanismer som for eksempel inhibering av p53-mediert celledød, som fremmer persistens av de senescent cellene. Vi finner videre at farmakologisk håndheving av p53 /Bax aktivering via Nutlin-3 før etablering av ADIS er nødvendig for å overvinne den tilhørende pro-overlevelse respons og fortrinnsvis utløse gripende celledød i stedet for senescence under AD. Dermed vår studie viser at ADIS fremmer utvekst av androgen-ildfast PC celler og er følgelig en suboptimal tumor-suppressor svar på AD
Citation. Burton DGA, Giribaldi MG, Munoz A, Halvorsen K, Patel A, Jorda M, et al. (2013) androgen deprivasjon-indusert Senescence Fremmer utvekst av Androgen-Ildfast prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (6): e68003. doi: 10,1371 /journal.pone.0068003
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 8 november 2012; Godkjent: 28 mai 2013; Publisert: 28 juni 2013
Copyright: © 2013 Burton et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av en Florida Biomed Bankhead Coley New Investigator Award, en University of Miami /Sylvester Comprehensive Cancer Center Pap Corps Utviklings Cancer Research Grant og University of Miami /Stanley Glaser Foundation award (til PR). MGG ble delvis støttet av en Sylvester Comprehensive Cancer Center Summer Lavere forskningspris. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC) er en av de vanligste kreftformen hos menn og en ledende årsak til kreft dødsfall. For avansert sykdom, er androgen deprivasjon hovedbehandlingsregimet som følge av den kritiske avhengigheten av prostatisk vev på androgener for proliferasjon og overlevelse [1]. Men den endelige veksten av androgen-ildfast svulster, som ikke lenger responderer positivt på androgen tilbaketrekking, reduserer pasienten forventet levealder for mindre enn to år fordi disse svulstene er dårlig respons på flere behandlinger [2], [3]. De molekylære mekanismene som gir opphav til disse androgen-refraktære tumorer er ikke godt forstått. Betydelig forskning har fokusert på androgenreseptoren (AR) signalering og impliserer AR relaterte avvik inkludert genamplifikasjon, ligand-uavhengig eller promiskuøse ligand-baserte aktivering og endret co-regulator uttrykk [2], [4] – [7]. Non-AR trasé antas å være involvert i androgen-ildfast spredning inkluderer bypass av AR-basert spredning kontroll via onkogen aktivering eller tumor suppressor downregulation, endret kromatin regulering av gentranskripsjon, forstyrrelser i cellesyklus kontroll maskiner og forhøyet uttrykk for steroidogenic enzymer [8 ] – [14]
Men mange studier som undersøker disse mekanismene undersøke dem i sammenheng med avansert prostatakreft modeller, og ikke ta opp de tidligste endringene som kreves for unndragelse av AD-indusert tumor undertrykkelse.. Dette er en viktig sak på grunn, til tross for sin høye initielle tumor-hemmende virkning [15], AD ikke dreper alle androgen-responsive prostatakreftceller, men snarere induserer en proliferativ arrest i en betydelig subpopulasjon [16]. Tatt i betraktning at androgen-ildfast celle populasjoner er preget av erverv eller forbedring av stress-beskyttende pro-tumorigene trasé [8], [10], [17], egenskapene til disse sprednings arrestert celler er sannsynlig å være viktig for å forstå hvordan androgen-ildfast subpopulasjoner oppstår. Faktisk er det sannsynlig at en undergruppe av disse arresterte cellene avslutte proliferativ stasis og bli non-respondere på AD. Til støtte for denne idé, er det blitt rapportert at prostatatumorer bestå av heterogene celleblandinger i form av androgen reaksjon [18], og at androgen-ildfast celler som oppstår som en valgt variant populasjon fra foreldre androgen-responsive celler [18], [19]. Videre, i samsvar med den kliniske fenotype, forlenget (mer enn 6 måneder)
in vitro
androgen-ablateres kultur av androgen-responsive prostatakreftcellelinjer som fører til den endelige utvekst av androgen abstinens-resistente kloner fra den innledningsvis veksten -arrested befolkning [8], [20]. Derfor belyse de molekylære mekanismene som ligger til grunn for AD-indusert vekst arrest er avgjørende for å definere etiologien av androgen-ildfast PC.
De molekylære egenskapene til AD-indusert vekst arrest inkluderer G1 /S-blokken, redusert cyklin-avhengig kinase aktivitet, hypofosforylerte Rb, og oppheving av den pågrepne fenotype via innføring av oncoproteinet, SV40 stort T-antigen [21]. Disse egenskapene er i overensstemmelse med AD-indusert arrest å være en form for mobilnettet senescence [22], og to nyere studier har rapportert at androgen-fratatt celler utvikle molekylære markører i samsvar med alderdom [23], [24]. Alle modeller av onkogen-drevet tumorigenesis har vist at onkogen-indusert alderdom fører til selektive presset som fremmer utvekst av senescence bestandig aggressive tumorcellepopulasjoner [25] – [27]. Men denne svulsten fremmende aspektet ved senescence har ikke, så vidt vi vet, er tidligere undersøkt for hormon tilbaketrekking-assosiert alderdom. Vi laget derfor vår studie for å fastslå om en tilsvarende paradigme, nemlig unndragelse av AD-indusert senescence (ADIS), opererer i generering av androgen-ildfaste prostata kreft celler fra foreldre androgen-responsive befolkningen. Følgelig, i denne studien, benyttet vi LNCaP og LAPC4 PC-cellelinjer, som er kjent for å besitte de store fremtredende trekk ved androgen-responsive prostatatumorceller inkludert robust androgen-reseptoren og prostataspesifikt antigen ekspresjon, økt proliferasjon som svar på androgener og proliferative opphør når androgen uttak, og manglende evne til å danne tumorer i kastrerte mus. Vi dyrket disse cellene i kull-strippet serum (CSS) holdige media å rekapitulere AD i kultur. Vårt mål var å karakterisere molekylære stier forbundet med ADIS og for å finne ut om vi kunne isolere senescence-resistente varianter i stand til å spre seg i henhold til AD.
Våre resultater viser at ADIS fører til anskaffelse av tumorfremmende egenskaper som forbedret pro-overlevelse mekanismer og chemoresistance. Betydelig, vedvarende tilstedeværelse av senescence-induserende stimuli via cyklisk AD muliggjør utvidelse av ADIS-resistente androgen-ildfast LNCaP og LAPC4 varianter innenfor en periode på flere uker. Disse variantene er delvis trykt med senescence-assosiert pro-overlevelse funksjoner til tross for at ADIS-resistente. Dermed våre funn støtter kollektivt en rolle for senescent fenotype i å skape vesentlig endring som fremmer fremveksten av androgen-ildfast tumorceller.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
All forskning omfatter mennesker har blitt godkjent av University of Miami Institutional Review Board. IRB-godkjent fraskrivelse av samtykke til denne protokollen.
Cell Kultur
LNCaP og LAPC4 celler (ATCC) ble dyrket i RPMI-1640 medium (Gibco, Invitrogen) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS; Gibco, Invitrogen) eller 5% trekull-strippet føtalt bovint serum (CSS; Gibco, Invitrogen) og 100 enheter /ml penicillin /streptomycin (Gibco, Invitrogen) ved 37 ° C i 21% oksygen /5% CO
2. For hvilende kulturer ble cellene dyrket som ovenfor men i fravær av noe serum.
Switch (SB) Metode for å generere Androgen-ildfast ADIS-resistente LNCaP Varianter
LNCaP-celler ble sådd ut på enten 10 cm retter (3 × 10
5 celler) eller 15 cm retter (1 × 10
6 celler) i RPMI 5% FBS for 36-48 timer før de byttet til RPMI 5% CSS. Media ble erstattet hver 3-4 dag i 14 dager, for å indusere ADIS, og etter det kulturene ble gjenopprettet til RPMI 5% FBS medium. Ved utvekst av synlige cellekolonier ble cellene trypsinert og utvidet for en eller to passeringer før prosedyren ble gjentatt.
Creation og stabil transduksjon av shRNA og Fluorescent Protein-uttrykke konstruerer
Den retrovirale pWZL -blast GFP konstruksjonen var en gave fra Dr. Robert Weinberg laboratorium. De shRNA vektorer ble samlet som tidligere beskrevet [28], [29]. Validerte eller svært scoret kandidat sekvenser fra TRC Broad Consortium shRNA bibliotek (https://www.broadinstitute.org/genome_bio/trc/publicSearchForHairpinsForm.php) ble valgt og subklonet inn i lentiviral pLKO.1 vektor med en puromycin motstand kassett. Oligonukleotider ble kjøpt fra Integrated DNA Technologies, Inc. ble Konstruksjoner sekvensert for å sikre nærvær av innsatsen. Kontrollen shRNA ble rettet mot GFP: 5′-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCA-3 «. Følgende mål sekvenser ble brukt:
shp53: 5’GACTCCAGTGGTAATCTACTT 3 «, etter
shp16: 5’GCATGGAGCCTTCGGCTGACT 3′
Shar konstruere [30] var en gave fra Dr. Kerry Burnstein ved University of Miami og var rettet mot følgende rekkefølge:. 5 «GAAAGCACTGCTACTCTTCAGCATTATTC 3»
Lentiviral eller retroviral produksjonen ble utført i HEK 293T celler og infeksjon av målceller ble utført som beskrevet tidligere [29]. Transduserte celler ble valgt i 2 ug /ml puromycin-holdige eller 10 ug /ml blastocidin-inneholdende medium (for SB5 GFP-celler) for en minimumsperiode på 5-7 dager (svarende til den tid det tar for untransduced celler å dø helt i valg media). For shRNAs, ble protein knockdown verifisert via Western blotting. GFP-ekspresjon i de SB5 cellene ble bekreftet ved epifluorescent avbildning og flowcytometrisk analyse.
Western blotting og antistoffer som brukes
Cellene ble høstet ved mekanisk skraping på is og ble lysert i en natriumfluorid (NAF ) buffer som inneholder natrium vanadat, PMSF, DTT og proteinase inhibitor. Proteinkonsentrasjoner ble målt ved hjelp av Bradford-reagens (Biorad). 30-50 ug totalt protein ble kjørt på en 4-12% Bis-Tris prefabrikert NuPage gel (Invitrogen) på Novex prefabrikerte gelsystemet og deretter overført til en seksjon av PVDF-membran (Immobilon, Millipore EMD) ved 30 V ved 4 ° C. Blotter ble farget i Ponceau reagent å bestemme selv lasting og transport, vasket i 0,1% TBST og deretter analysert med antistoffer mot disse proteinene: AR (sc-816, Santa Cruz Biotech), p53 (sc-126, Santa Cruz Biotech), p21 (sc-817, Santa Cruz Biotech) p16
INK4 (554079, BD Biosciences), cyclin A (sc-751, Santa Cruz Biotech), GAPDH (AB9485, Abcam) BCL-2 (sc-492, Santa Cruz Biotech), Bax (sc-493, Santa Cruz Biotech) Mcl-en (sc-819, Santa Cruz Biotech), Bak (06-536, Millipore), fosfor-Akt (4060, Cell Signaling) total Akt (9272, Cell signale~~POS=TRUNC) spaltet-PARP (9541, Cell Signaling), survivin (71G4B7, Cell Signaling), TAp63 (618902, BioLegend), p27 (sc-528, Santa Cruz Biotech), deltaNp63 (619002, BioLegend). Etter inkubasjon med de aktuelle videregående pepperrotperoksidase-konjugert antistoff (Amersham), ble blotter utviklet ved hjelp av ECL Plus (GE Healthcare) å utvikle løsningen. Etter immunoblotting ble membraner farget med Coomassie blått fargestoff (Sigma) for å normalisere for total protein lasting.
Cell Cycle Analysis
Ca 1 × 10
6 celler ble høstet via trypsinering. Celler ble vasket en gang i kald serumholdig medium, to ganger i kald PBS og deretter resuspendert i 200 ul PBS 2 mM EDTA. Omtrent 600 ul kald 70% etanol ble tilsatt dråpevis til cellene mens virvle dem ved middels hastighet. Celler ble holdt ved 4 ° C over natten for fiksering. Før analyse ble cellene spunnet ned ved 4 ° C ved 1000 rpm i 5 minutter, og etanolen forsiktig suget av. De resulterende cellepellets ble resuspendert i 0,5 ml PBS 2 mM EDTA og 10 pl varme-inaktivert av RNase A (10 mg /ml, Sigma). Deretter ble 25 ul propidiumjodid (PI) (1 mg /ml, Sigma) ble tilsatt til cellesuspensjonen. Celler ble inkubert ved 37 ° C i et vannbad i 30 minutter og umiddelbart analysert på en Accuri C6 strømningscytometer (BD) ved bruk av PI eksitasjon laser (FL2). Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen, ble bestemt på den CFLOW Plus cytometer programvare, CFLOW Analyse 202,1, ved å måle arealet under den aktuelle delen av profilen (som vist). Profiler ble relabeled i MS Excel for klarhet.
celleproliferasjon Målinger
For å finne ut celleproliferasjon priser av LNCaP celler i både FBS og CSS inneholder medier, 1 × 10
5 ble sådd i 6 cm plater og celletall, ved hjelp av en hemocytometer, ble gjennomført hver 24. time, i tre eksemplarer i løpet av en seksdagers periode ved hjelp av en hemocytometer. Frisk media ble tilsatt hver 2-3 dager. For redningsforsøk i fig. 1D, celler ble sådd i FBS media i 24 timer før du bytter til CSS media. Celler ble byttet tilbake til FBS media på angitte tidspunkter.
(A) Senescence forbundet beta-galaktosidase (SA-beta-gal) flekker etter angitt forhold og tidspunkter. FBS, føtalt bovint serum som indikerer androgen-fylt kultur; CSS, kull-strippet serum indikerer androgen- fratatt kultur. 9D FBS post-SEN betegne LNCaP celler som ble utsatt for 14 dager CSS kultur og deretter byttet til FBS medier for 9 dager. Kvantifisering av positivt fargede celler blir presentert til høyre for de representative bildene. (B) Ki67 markør pan-spredning flekker vises på angitte vilkår og tidspunkter. DAPI farging brukes til å markere cellekjerner med henblikk på å telle Ki67-positive celler. Andel av fargede celler tegnes på høyre side. (C) propidiumjodid cellesyklusanalyse, ved angitte tidspunkter og dyrkningsbetingelser. Legg merke til S-fase fraksjon faller fra 15,6% i FBS til 0,4% ved 10d CSS og til 0,8% etter gjenopprettelse til FBS media i 9 dager (9D FBS post-SEN). (D) spredningskurve for LNCaP celler dyrket i CSS for 3, 8 eller 14 dager før han ble byttet tilbake til FBS media. (E) Måling av de totale ROS-nivåer via flowcytometri i LNCaP-celler på dag 1, dag 4 og dag 7 av angitte dyrkningsbetingelser. Merk høyre skiftet topp i rødt tilsvarer økende ROS-nivåer i CSS-kultivert LNCaP celler i forhold til FBS-dyrkede celler. (F) DNA dobbel tråd pause (DSB) foci oppdaget via H2AX /53BP1 co-farging (grønn = H2AX, rød = 53BP1) for LNCaP celler dyrket under de angitte betingelser. Representative bilder for celler med forskjellige antall telte foci vises. Legg merke til at prosentandelen av celler med 5+ foci øker med varigheten av CSS kultur.
Cell Co-kultur Eksperimenter og analyse
For de co-kultur eksperimenter, 1 × 10
5 LNCaP-SB5-GFP-celler (som genereres fra SB0 LNCaP-celler som stabilt transdusert med pWZL-blåse GFP) ble sådd ut i fire eksemplarer i en 10 cm plate, enten alene eller ko-blandet med 1 x 10
5 umerket LNCaP SB0, SB5 eller LNAI celler. Celler ble opprinnelig belagt i 5% FBS komplett media (dag 0) og på dag 1, ble co-kulturer byttet til 5% CSS media og vedlikeholdes i 7 dager, med en CSS media hver tredje dag. Representative kulturer ble analysert i duplikat ved flowcytometri på en Accuri C6-cytometer på dag 1 for å sikre forholdsvis ekvivalente mengder grønne og ikke-grønne celler ble overlever i kultur. Ved hjelp av SB5-GFP-celler belagt alene, ble gating oppnådd på FITC kanalen for å separere de GFP-celler fra ikke-GFP-celler. Celler ble ytterligere gated å utelukke lave FSC /SSC partikler for å sikre at bare levende celle populasjoner ble analysert. På dag 7, strømningscytometri ble anvendt for å bestemme de relative prosentandeler av GFP-positive versus ikke-merkede cellepopulasjoner, så vel som det totale antall av GFP-positive (SB5) celler. Histogrammer og prikkplotter ble plottet ved hjelp av BD Accuri C6 Analyse programvare for Mac OSX. Alle målingene ble utført i duplikat i et minimum av to uavhengige eksperimenter.
Senescence-assosiert Beta-galaktosidase-aktivitet (SA-beta-gal)
SA-beta-gal-farging ble utført som beskrevet andre steder [31]. I korthet ble cellene vasket i PBS, fiksert i 0,2% glutaraldehyd i 5 minutter ved romtemperatur, vasket en gang i PBS og inkubert over natten i nylaget fargeløsning (1 mg /ml 5-brom-4-klor-3-indolyl- β-galaktosid (Sigma), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl
2, 5 mM K
3fe (CN)
6, 5 mM K
4Fe (CN)
6, 40 mM NaPi, pH 6,0). Den følgende dag ble cellene inkubert i ytterligere en time ved 37 ° C for å forsterke fargingen og deretter vasket og lagret i PBS ved 4 ° C. For å kvantifisere positiv farging, 100 celler ble telt for hver prøve i flere synsfelter for å oppnå et standardavvik. Forsøkene ble utført i hvert fall i to eksemplarer, i to uavhengige forsøk.
Ki67 Farging
For deteksjon av Ki67 farging ble cellene sådd ut i 2 x 10
4 celler per kammer og venstre for 36-48 timer før enten bytte til CSS, bikalutamid behandling eller fiksering for FBS bare prøver. Celler ble fiksert i 4% paraformaldehyd (16% lager, elektronmikroskopi fag) i 10 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av permeabiliseringen i 0,1% PBST (10 min ved RT), og blokkert i 1 time i 0,1% TritonX, 15% FBS , i PBS ved romtemperatur. Den Ki67-antistoff (Santa Cruz) ble fortynnet 1:50 i blokkeringsbuffer og inkubert ved 4 ° C over natten. Cellene ble vasket 5X, 10 minutter hver gang ved romtemperatur i blokkeringsløsning på en ristemaskin. Den riktige fluorofor-konjugert sekundært antistoff (geite-antimuse-FITC, Santa Cruz) ble tilsatt i en 1:100 fortynning i blokkeringsbuffer og inkubert i 1 time ved romtemperatur i mørket. Cellene ble vasket i 0,1 5X TritonX, 10 minutter hver gang på risteapparat ved romtemperatur i mørket. DAPI monterings medier (Vectashield) ble lagt før montering dekkglass. Immunofluorescent bildene ble kjøpt på et Nikon kamera festet til en oppreist Zeiss mikroskop.
H2AX /53BP1 Farging
H2AX /53BP1 farging ble utført som beskrevet andre steder [28]. Kort sagt ble 20,000 celler utsådd pr kammer (BD Falcon, 4-kammer kulturglass) i RPMI 5% FBS og byttet til RPMI 5% CSS 24 timer senere. H2AX /53BP1 farging ble utført ved de angitte tidspunkter. Celler ble fotografert under identiske oppkjøps forhold på en Leica DMI 6000 B invertert digitalt mikroskop med et vedlagt DFC350 FX kamera og FW4000 jeg fluorescens programvare. Bare samlokalisert H2AX /53BP1 foci ble regnet som positivt og et minimum av 100 celler ble scoret over flere felt.
Drug Behandling av LNCaP celler
LNCaP celler ble dyrket i passende media (5 % FBS eller CSS) inneholdende docetaxel (1 nM), flavopiridol (0,5 uM), eller bortezomib (1 uM) i 72 timer, og flytende og trypsinert festede celler ble samlet og analysert ved hjelp av Trypan blå farging. LNCaP-SB0 og LNCaP-SB5-celler ble dyrket i medium (RPMI + 5% FBS) inneholdende docetaxel (1 nM) i 72 timer og analysert ved hjelp av Trypan blå farging. Minst 3 uavhengige forsøk ble gjort i duplikat og statistiske forskjeller mellom medikamentbehandlede celler ble bestemt av tosidige Student
t
-test med p. 0,05 ansett som signifikant
Reverse-transkriptase PCR
Total RNA ble isolert fra LNCaP celler dyrket i FBS og CSS media i 14 dager, med RNAqueous-4PCR Kit (Ambion). Totalt 1 mikrogram renset RNA ble revers-transkribert ved hjelp av en tilfeldig primer, følger med i pakken, for å få cDNA via High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). CDNA ble anvendt som et templat for PCR-amplifikasjon ved anvendelse av AmpliTaq Gold ® 360 Master Mix (Applied Biosystems) og primerene var som følger
GAPDH forover primer:.
5 «GACCCCTTCATTGACCTCAAC 3»
GAPDH revers primer:
5 «CTTCTCCATGGTGGTGAAGA 3»
IL8 frem primer:
5 «TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA 3»
IL8 revers primer :
5 «AACCCTCTGCACCCAGTTTTC 3»
reaksjons~~POS=TRUNC ble kjørt på 1,5% agarosegel med etidiumbromid. GAPDH ble anvendt som en intern normalisering kontroll.
Måling av celledød
behandlede og kontrollceller ble høstet, resuspendert i PBS og fortynnet 1:01 i 0,4% trypanblått (Invitrogen). Dead (blå) og lever ikke-farget cellene umiddelbart telles ved hjelp av en hemacytometer. Prosentandelen av døde celler ble bestemt ut fra minst tre uavhengige eksperimenter utført i duplikat.
Måling av Cellular ROS Levels
Analysen ble utført som beskrevet tidligere [28]. Kort sagt ble de angitte cellene ved tilsvarende sammenflyt oppsamlet gjennom trypsination, vasket i iskald 1X Hanks bufret saltoppløsning (HBSS) og inkubert med nyfremstilt 5- (og 6-) -chloromethyl-2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetat ( CM-DCF-DA, Molecular Probes /Invitrogen, C6827) i 20 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter vasket og resuspendert i 1 x HBSS før påvisning av FITC signal gjennom fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Flowcytometrisk analyse ble gjennomført på en Accuri C6 cytometer (BD Biosciences). X-aksen representerer FITC kanal (FL1) fluorescensintensiteten i log-målestokk og y-aksen representerer antall celler. Forsøkene ble utført i hvert fall i to eksemplarer, med representative profiler blir vist.
Crystal Violet Farging
Om lag 3 × 10
5 celler ble sådd på 10 cm retter som inneholder RPMI pluss 5% FBS for 36-48 timer før du bytter til RPMI pluss 5% CSS. Media var oppdateres hver 3-4 dager. For krystallfiolett-farging, ble mediet aspirert og cellene vasket en gang i 1 x PBS, ble 1% krystallfiolett oppløsning tilsatt til hver skål og igjen å sette flekker i 2 minutter ved romtemperatur. Flekken ble fjernet og hver rett skylt to ganger i avionisert vann. Retter ble deretter nedsenket i vann i 20-30 minutter for å lekke overflødig flekken og redusere bakgrunns, og venstre for å lufttørke over natten før telling kolonier eller ta bilder. Forsøkene ble utført i duplikat
Statistical Analysis
Statistisk signifikans av resultatene ble bestemt ved å beregne standardavvik fra gjennomsnittet, og ved en tosidig t-test, med p. 0,05 anses signifikant.
Konklusjoner
Resultater og Kjennetegn på ADIS i LNCaP og LAPC4 Cells
for å bekrefte om den observerte proliferative arrest på AD skyldes induksjon av mobilnettet senescence , vi utnyttet godt karakterisert androgen-sensitive cellelinjen LNCaP som det har funksjonelle versjoner av både store senescence-formidling trasé, p53 og p16
INK4a [32], [33]. Videre er sammenfallende med kliniske modeller av prostatakreft, LNCaP-celler viser spontane utvekster av androgen-ildfast varianter etter langvarig kultur i androgen-fattige medier [20], [34]. Følgelig kultiveres vi LNCaP-celler i CSS-inneholdende medium (heretter referert til som CSS kultur) for å etterligne AD og vurderes fremveksten av cellulære senescence markører.
Vi fant at i tillegg til den forventede proliferative arrest (fig. S1A ) og anskaffelse av en nevroendokrin morfologi [35] (fig. 1A), CSS-kultivert LNCaP celler også utviklet andre distinkte markører for cellealdring (fig. 1) [36]. Disse inkluderte økt senescence-forbundet beta-galaktosidase (SA-beta-gal) aktivitet (Fig. 1A), redusert farging for den pan-spredning markør, Ki67 (Fig. 1B) og G1 /S cellesyklus arrest (Fig. 1C ). Etter 7 dager i kultur CSS, 50% celler oppviste følgende egenskaper og etter 10 dager i CSS, som brøkdel steg til 80% av hovedpopulasjon (figur 1A-B.). Behandling med anti-androgen, bikalutamid, også indusert proliferativ opphør og utseendet av en senescent fenotype bestemt ved hjelp av SA-beta-gal-farging og et G1 /S arrest (fig. S1). I motsetning til dette var minimal celledød observert ved CSS eller bikalutamid behandling som bedømt ved en visuell mangel på avrundede, ufestede celler og spaltet PARP uttrykket (data ikke vist). Betydelig når cellene ble gjenopprettet til androgen-fylt føtalt bovint serum (FBS) media etter 14 dagers CSS kultur, hovedpopulasjon beholdt senescent markører (vist i tilfellet av gjenopprettelse til replete FBS dyrking i 9 dager, betegnet som 9D FBS post -sen), noe som indikerer at spredning arrestasjonen er permanent snarere enn forbigående (fig. 1A-C).
for ytterligere å skille CSS kultur-indusert spredning arrest fra den midlertidige fenomenet celle quiescence, vi dyrket LNCaP celler i serumfritt medium, kjent for å indusere quiescence [37], i 7 dager i parallell med celler dyrket i CSS media. Deretter byttet vi begge sett med celler tilbake til FBS medier i 4 dager. Mens LNCaP-celler utsatt for serumfritt kulturopptas proliferasjon ved restaurering til full media, tilsvarende en økning i den markør spredning, cyklin A, ble det av CSS-dyrkede celler som ikke gjøre det (fig. S2). Som LNCaP cellene gjennomgår ingen ytterligere populasjonsdoblinger gang plassert under androgen-ute kultur (Fig. S1 A), men ta opp til 4 dager for å vise betydelig oppkjøp av senescence markører (Fig. 1A, B), ønsket vi å finne ut om denne spredningen arrest var reversibel før 4 dager med androgen uttømming. For å gjøre dette, ble LNCaP celler byttet tilbake til androgen-fylt media på 3, 8 eller 14 dager etter CSS kultur (Fig. 1 D). Vi fant ut at cellene byttet tilbake til FBS media på dag tre var lett kunne gjenoppta spredning. Til sammenligning celler byttet til replete media ved dag 8 ikke gjenoppta full spredning, men en undergruppe av disse cellene var i stand til å fortsette å dele, noe som tyder på en delvis irreversibelt arrestert cellepopulasjon. I samsvar med våre resultater i fig. 1A-B, ingen spredning ble observert når cellene ble byttet tilbake til full media etter 14 dager i kultur CSS (Fig. 1D). Dermed samlet våre resultater bekrefter at AD induserer de viktigste funksjonene i mobilnettet senescence i LNCaP celler.
ADIS fenotype vi observerer i LNCaP celler ble innledet av progressivt økende totale cellulære ROS-nivåer, observert så tidlig som en dag etter bytte celler til CSS media (fig. 1E), så vel som av utseendet av progressivt større antall samlokalisert gamma-H2AX og 53BP1 foci (fig. 1F). Disse foci er en indikasjon på en monterings DNA-skade respons (DDR), antagelig som følge av vedvarende ureparerte skader DNA [28], [38]. Den ADIS-assosiert økning i ROS-nivåer og DNA skade foci er i samsvar med den kjente etiologi av mobilnettet senescence [36], noe som ytterligere forsterker som AD genererer oppstrøms påkjenninger kjent for å utløse cellealdring.
ADIS medieres av p16
INK4a Pathway og Associated med bekjempelse av p53 Pathway
To store tumor suppressor veier, p53 /p21
Cip1 /Waf1 og p16
INK4a, typisk megle senescence [39], [ ,,,0],40]. Avhengig av celletype eller stressfaktorer er senescent fenotypen forbundet med aktivering av en eller begge disse banene [39], [41]. Men selv om begge veier er aktivert, kan man fremherskende for å håndheve senescent fenotypen [28], [40]. Følgelig vi analysert LNCaP cellene ved å øke varigheten av CSS kultur ved sondering totale proteinlysatene fra disse prøvene for nivåer av senescence-medierende proteiner, p16
INK4a og p53 /p21
Cip1 /Waf1. Som forventet, ble redusert AR uttrykk med økende varighet av CSS kultur (fig. 2A). Selv
a priori
, eksistensen av en vedvarende DDR (Fig. 1F) ledet oss til å forvente at p53 /p21 veien ville være involvert, fant vi i stedet at ADIS var assosiert med økt uttrykk av p16
INK4a (fig. 2A). Overraskende nivåer av p53 og dens effektor cellesyklusregulerende proteiner, p21
Cip1 /Waf1, redusert med økende varighet av CSS kultur (Fig. 2A). Videre tillegg av 10 nM dihydrotestosteron (DHT) til CSS media var i stand til å forebygge både den observerte nedgangen i AR og cyclin A nivåer og ADIS-forbundet endringer i p16
INK4a og p53 uttrykk (Fig. S3A). Dette funn bekrefter disse molekylære endringer oppstår spesielt på grunn av fravær av androgen i kulturmediet.
(A) Immunoblotting ble utført på tilnærmet 35 pg av de angitte proteinprøvene med antistoffer mot betegnet proteiner. Coomassie blå farging ble anvendt for å normalisere for totalt protein lasting. Legg merke til at AR uttrykk avtar som forventet ved CSS kultur. Trenden med p53, p21 og p16 protein uttrykk opprettholdes etter restaurering av androgen-fylt kultur post-senescence (post-SEN) indikerer permanency av endringene. (B) Immunoblotting vise effektene av shRNA-mediert knockdown av p16 på ADIS. Merk forhøyede AR og cyclin A nivåer i shp16 cellene under CSS kultur i forhold til kontroll eller shp53 knockdown celler. (C) Virkning av p16 undertrykkelse på SA-beta-gal-farging. De angitte celler ble dyrket i CSS i 14 dager og deretter byttet til FBS- inneholdende media i ytterligere 9 dager. Legg merke til den observerte reduksjonen i SA-beta-gal-farging i shp16 celler. * P. 0,05
Betydelig forble høy p16
INK4a uttrykk nivåer og p53 /p21 holdt seg lav i bulk befolkningen selv etter androgen-fylt kultur ble restaurert (Fig 2A.). Denne observasjonen understøtter permanens av senescens-assosierte molekyl kretser aktiveres av androgen-belastede kulturen til tross for den delvise gjenvinning av AR ekspresjonsnivåer (fig. 2A). Forhøyet p16
INK4a nivåer sammen med forhøyet SA-beta-gal farging, redusert spredning og redusert AR og cyclin A uttrykk ble også observert etter CSS kulturen i androgen-responsive, men p53-mutant [32] LAPC4 cellelinje (fig. S4A-D). 5A.
