Abstract
Bakgrunn
KRAS, BRAF Hotell og
PIK3CA
mutasjoner er ofte observert i tykk- og endetarmskreft (CRC). Spesielt
KRAS
mutasjoner er sterke prediktorer for klinisk utfall av EGFR-målrettede behandlinger som cetuximab og panitumumab i metastatisk kolorektalcancer (mCRC). For mutasjon analyse, dagens metoder er tidkrevende, og ikke lett tilgjengelig for alle onkologer og patologer. Vi har utviklet en ny, enkel, følsom og fullt automatisert molekylær diagnostisk system (AMDS) for pasientnær testing (POCT). Her rapporterer vi resultatene av en sammenligningsstudie mellom AMDS og direkte sekvensering (DS) i påvisning av
KRAS, BRAF Hotell og
PI3KCA
somatiske mutasjoner.
Metodikk /Principal Å finne
DNA ble ekstrahert fra en skive av enten frosset (n = 89) eller formalinfiksert og parafin-innleiret (FFPE) CRC vev (n = 70), og deretter anvendt for mutasjonsanalyse av AMDS og DS . Alle mutasjoner (n = 41 mellom frossen og 27 blant FFPE-prøver) som detekteres av DS ble også med hell (100%) detekteres av AMDS. Imidlertid ble 8 frosne og 6 FFPE- prøvene detektert som villtype i DS-analysen vises som mutanter i AMDS analyse. Ved kloning-sekvense analyser, ble disse uharmoniske prøvene bekreftet som sanne mutanter. En prøve hadde samtidige «hot spot» mutasjoner av
KRAS Hotell og
PIK3CA
, og kloning analysen comfirmed at E542K og E545K ikke var på samme allel. Genotyping ringeprisene for DS var 100,0% (89/89) og 74,3% (52/70) i frosne og FFPE-prøver, henholdsvis for første forsøk; mens det av AMDS var 100,0% for begge prøvesettene. For automatisert DNA-ekstraksjon og mutasjon deteksjon av AMDS, frosne vev (n = 41) var vellykket oppdaget alle mutasjoner innen 70 minutter.
Konklusjon /Betydning
AMDS har overlegen følsomhet og nøyaktighet over DS, og er mye lettere å utføre enn konvensjonelle arbeidskrevende manuell mutasjonsanalyse. AMDS har stort potensial for POCT utstyr for mutasjonsanalyse
Citation. Kitano S, Myers J, Nakamura J, Yamane A, Yamashita M, Nakayama M, et al. (2013) A Novel Fully Automated Molecular Diagnostic System (AMDS) for tykktarmskreft Mutation Detection. PLoS ONE 8 (5): e62989. doi: 10,1371 /journal.pone.0062989
Redaktør: Anthony WI. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 08.01.2013; Godkjent: 27 mars 2013; Publisert: 09.05.2013
Copyright: © 2013 Kitano et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av forfatternes selskap (høytrykk PRINTING CO., LTD.). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Denne forskningen ble finansiert av forfatternes selskap (høytrykk PRINTING CO., LTD. ). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Den menneskelige
KRAS
onkogen er mutert i over 30% av CRC, og mer enn 3000 punktmutasjoner har blitt rapportert å tidspunkt [1]. De mest hyppige endringer er påvist i kodon 12 (~82% av alle rapporterte
KRAS
mutasjoner) og i kodon 13 (~17%), som begge er i ekson 2 av
KRAS
gen [2] og ser ut til å spille en viktig rolle i utviklingen av CRC [3].
BRAF
koder for et serin /thereonine kinase som aktiverer RAS-MAPK vei, og dens mutasjon har blitt funnet i 4-15% av CRC.
PIK3CA
koder for den katalytiske subenhet p110 alfa av PI3K [4], og mutert PIK3CA stimulerer AKT-reaksjonsveien, og fremmer cellevekst i forskjellige krefttyper, inkludert CRC [5].
PIK3CA
mutasjoner er blitt beskrevet i 10% -30% av CRC [6], og er forbundet med
KRAS
mutasjon. Det har vært en rapport at tilstedeværelsen av mutasjoner i
PIK3CA
,
KRAS
, eller
BRAF
i CRC viste dårligere pasient utfall [7], og blant pasienter som gjennomgår kurativ reseksjon av CRC,
PIK3CA
mutasjon er forbundet med kortere kreftspesifikk overlevelse [8]. Men den negative effekten av
PIK3CA
mutasjon kan være potensielt begrenset til pasienter med
KRAS
villtype tumor [8].
Cetuximab og panitumumab er effektive epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) målrettet agenter for metastatisk kolorektalcancer (mCRC), men pasienter med tumorer har
KRAS
mutasjoner unntatt G13D [9] er generelt antatt å ikke dra nytte av disse midlene [10], [11]. Videre mutasjoner i
BRAF Hotell og
PIK3CA
har også blitt rapportert å påvirke effekten av EGFR-målrettede midler [12], [13]. Gitt den viktige verdien av disse mutasjonene i prediksjon av kliniske utfall i mCRC pasienter, vil en rask, pålitelig og følsom teknikk samtidig å oppdage dem være avgjørende for informert farmakoterapi. Så langt, selv om mange teknologier har blitt utviklet, er de begrenset av komplisert prosedyre, høye kostnader, lav gjennomstrømning eller andre problemer. For eksempel er direkte Sanger-sekvensering (DS) for tiden fortsatt betraktet som en gullstandard for detektering av disse mutasjoner. Imidlertid krever fremgangsmåten DS flere trinn, mangler en mulighet for automatisert analyse. Den har også en lang turn-around-tid, og er generelt forholdsvis dyre sammenlignet med andre metoder. Andre nylig utviklede metoder inkludert PCR-relaterte teknologier [14] – [17], sekvense plattformer [18], [19], og andre metoder som HRM (High Resolution smelte analyse) [20] analyse er mer følsomme og praktisk enn DS men de er også tid- og arbeidskrevende [21], og ikke lett tilgjengelig for de fleste klinikere, som ofte krever at svulsten prøven sendes til et referanselaboratorium, potensielt resulterer behandling forsinkelser.
Vi har utviklet en helautomatisk genetisk analysator AMDS som inkluderer prosesser for DNA-ekstraksjon /rensing, DNA forsterkning (PCR), mutasjonsdeteksjon ved Invader® kjemi [22], [23], og genotype tolkning. AMDS kan kalle en mutasjon status automatisk i 70 minutter etter tilsetning av en prøve (
f.eks., Etter hentet genomisk DNA eller vevsprøve homogenat) på kassetten. Her rapporterer vi en mulighetsstudie av AMDS for å oppdage somatisk
KRAS
,
BRAF Hotell og
PI3KCA
mutasjoner i CRC vev ved sammenligning med DS i en dobbeltblind måte. Vi først evaluert følsomheten av AMDS ved hjelp av en titrering analysen med kunstig konstruerte plasmid DNA. En klinisk studie resultatene ble deretter utført for å vurdere ytterligere nøyaktighet, spesifisitet og følsomhet av systemet sammenlignet med DS. I tillegg ble kloning-sekvensering analyse utført for å validere uharmoniske mutasjonsstatus mellom AMDS og DS. Allsidigheten til systemet i å oppdage mutasjoner fra vev med ulike fiksativ (Dypfryst og FFPE) ble også vurdert. I tillegg har vi testet evnen til systemet i en helautomatisk modus: fra DNA-ekstraksjon av mutasjon deteksjon, ved hjelp av en minimal mengde (mer enn 1 mg) av frosset vev CRC
Materialer og metoder
.
Plasmid DNA
de målrettede mutasjoner var 7 nonsynonymous punktmutasjoner (G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V og G13D) i ekson 2 av
KRAS
gen, ett synonymt punktmutasjon (V600E) i ekson 15 av
BRAF
genet og 5 nonsynonymous punktmutasjoner i ekson 9 spiral domene (E542K, E545K, E545G) og ekson 20 kinase domene (H1047L, H1047R) av
PIK3CA
genet, alle vanlige mutasjoner i menneskelig CRC. Disse mutanter og vill-typer ble PCR-amplifisert og klonet inn i plasmidet pCR®2.1 (Invitrogen, CA, USA), og de syntetiserte mutant og vill-type-maler ble verifisert ved sekvensering. Lengden av alle plasmid-DNA som inneholder det 300 bp målsekvensen var 4,2 kb. De syntetiserte Plasmid-DNA ble suspendert i TE-buffer og lagret ved -20 ° C før bruk.
CRC Prøve §
CRC vev i frossen prøveseksjoner (n = 89) og FFPE prøveseksjoner ( n = 70) som brukes i denne studien var fra human Tissue Resource Center ved University of Chicago. Alle prøver ble diagnostisert som kolon eller endetarmskreft med hematoxylin og eosin flekken. Alle vev ble primære CRC vev kirurgisk fjernet før andre kliniske behandlinger. Vev ble skiver til en omtrentlig størrelse på 1,0 cm
2 × 10 mikrometer av mikrotom. Skiver delen prøvene brukes for denne studien ble ikke utført av manuell mikrodisseksjon (MMD). Ingen ytterligere informasjon, inkludert demografiske og kliniske data ble forespurt for disse prøvene. Studien er gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board ved University of Chicago.
AMDS
AMDS er en helautomatisk genetisk analysesystem basert på en DNA-chip som har 23 reaksjonsbrønner inneholder reagenser for PCR og Invader® analyser (figur 1A og 1B). Når en bruker legger til en prøve (helblod, renset DNA eller vev homogenat) til DNA-rensepatronen og starter den vedlagte programvaren utfører AMDS DNA-ekstraksjon, overfører DNA til chip, utfører PCR og Invader® assay, leser resultatet , og viser bedømme resultat i ca 70 minutter. Assay strøm av mutasjons deteksjon er vist i figur 1C. I trinn 1, blir DNA ekstrahert og renset ved DNA-rensepatronen; i trinn 2, blir det rensede DNA fluidprøven overført til det DNA-Chip; i trinn 3, er InvaderPlus® (PCR og Invader® reaksjon kontinuerlig i samme rør) gjennomført; i det siste trinnet, rapporterer AMDS et genotyping resultat av prøven. InvaderPlus® ble utført under følgende betingelser: denaturering i 2 minutter ved 93 ° C, etterfulgt av 30 eller 35 sykluser av 31 sekunder ved 93 ° C og 16 sekunder ved 66 ° C, og Taq-polymerase deaktivering i 2 minutter ved 97 ° C , etterfulgt av 10 minutter av signaldeteksjon ved 61 ° C. Fluorescens signal av FAM (fluorescens aminoheksyl) ble overvåket i kanalen F1 ved 520 nm med eksitasjon av 490 nm, og fluorescens signal fra RED (Redmond Red) ble overvåket i kanal F2 ved 595 nm med eksitasjon av 580 nm.
(A), (B) AMDS system (DNA-chip, DNA-rensing patron og utarbeide) (C) analyse strømning av AMDS. (D) Prinsippet om Invader® kjemi (E) genotyping algoritme av AMDS. EP: Sluttpunkt tid, JP: Judging punkt tid, FNT: Fluorescens styrke Negative terskel, F (EP): Fluorescens styrke ved EP, F (JP): Fluorescens styrke ved JP, SR: Signal ratio, RPT: Positiv ratio terskel .
DNA-chip og DNA Purification Patron
Alle DNA chips og DNA-rensekassetter ble produsert i et rent rom på nivå med ISO klasse 8. Må reagenser blanding (1,99 mL ) for en DNA-brikke som inneholdt 0,1 ul 1 M MOPS-buffer (pH 7,7) (DOJINDO LABORATORIES, Kumamoto, Japan), 0,05 pl av 10 mM av hver deoksyribonukleosid-trifosfat (Roche, CA, USA), 0,96 ul 1 M trehalose (Hayashibara , Okayama, Japan) vandig løsning, 0,60 mL av 20 × oligo mix, 0,22 mL av 5,0 U /mL Hawk Taq polymerase (Roche, CA, USA), 0,04 mL av 15 000 U /mL Cleavase (Hologic, WI, USA) var dispensert og tørket i brønner på en DNA-brikke. 20 × oligo blanding ble fremstilt med 0,06 mL av 100 mikrometer frem primer, 0,06 mL av 100 mikrometer revers primer, 0,06 mL av 50 M av FAM-FRET (fluorescens resonans energi overføring) kassett (Hologic, WI, USA), 0,06 mL 50 mikrometer av RED-FRET kassett (Hologic, WI, USA), 0,06 mL DW (Destillert vann: Lonza, Basel-Stadt, Sveits), og et sett av 0,06 ul 10 uM invaderende oligonukleotid pluss 0,06 ul av 100 pM allelet sonde for både villtype og mutant type. Oligonukleotidsekvenser anvendt i denne studien er vist i tabell S1.
Nukleinsyre ble renset ved anvendelse av en DNA-rensing patron som inneholder et glassfilter. DNA blir adsorbert på silika i nærvær av et kaotropisk salt [24], [25]. Etter at renseprosessen, 270 ul av DNA-prøve inneholdende MgCl
2 (6,25 mM) og NaCl (15 mM) ble injisert inn i DNA-brikke.
Prinsippet InvaderPlus® Assay for mutasjonsdeteksjons
InvaderPlus® er Invader® kjemi-basert (figur 1D) mutasjonsdeteksjon analyse, hvor PCR og Invader reaksjonen utføres fortløpende i enkelt rør. Etter PCR-amplifisering trinnet blir DNA-polymerase varmeinaktivert, og Invader® reaksjon detekterer mutasjon i PCR-produktet. Invaderende oligo- nukleotid og allel-proben bindes til PCR-produkt som danner invasiv spaltning struktur (1). Dersom sekvensen til allel sonden er fullt samsvar med det PCR-produkt, skjærer Cleavase® sonden forårsaker frigjøring av armen. Den frigjorte arm binder seg til den komplementære sekvens av den FRET kassetten. Til slutt skjærer Cleavase® et FRET kassett, og skiller fluorescens fargestoff modifisert nukleotid (F) fra den gjenværende FRET kassett som inneholder slukkeren (Q) ved 3′-enden. Disse reaksjonene er syklet, og årsaken signalforsterkning. Tvert imot, når sekvensen til proben har en-base-mistilpasning med PCR-produktet ved sin 5 «ende, hvor den invaderende oligo- nukleotid-probe og allele ha en basisoverlappende struktur, kan Cleavase® ikke skjære allelet sonden. Som et resultat, blir den påfølgende reaksjonen ikke finne sted, og den FRET kassetten er intakte (2). To FRET kassetter er preget av bruk av ulike fluorescerende fargestoffer.
Algoritmen til Genotyping
Prinsippet og flytskjema for genotyping av AMDS er vist i figur 1E. Når Invader® analysen er ferdig, sammenligner genotyping programvare fluorescerende signalstyrken på EP (sluttpunkt tid) beskrives som F (EP), og FNT (fluorescerende styrke negativ terskel). Dersom F (EP) er mindre enn FNT prøven vurderes som negative (
e, g
, prøve D) for mutasjonen. Hvis F (EP) er ikke mindre enn FNT, så dens signalforholdet (SR), som er betegnet ved hjelp av følgende ligning, blir beregnet.
SR representerer en reaksjonseffektivitet på Invader® assay. Hvis SR av en prøve er større enn RPT (Ratio positiv terskel), blir prøven ansett som positive for den spesifikke mutasjoner (
f.eks
. Prøve A og B), men hvis ikke, blir prøven ansett som negativt (
f.eks
prøve C). Hver RPT for alle mutasjoner påvist i denne kliniske studien ble definert med 5% mutant 95% vill-type blanding plasmid DNA (tabell S2.).
Direkte Sequencing (DS)
For DS følgende primere ble brukt til å forsterke
KRAS
gen: 5′-GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3 «(F: Forward primer), 5′-GTGTGACATGTTCTAATATA GTCA-3» (R: Revers primer),
BRAF
genet: 5′-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3 «(F), 5′- AGCATCTCAGGGCCAAAAAT-3» (R) og
PIK3CA
genet: 5′-ATGATGCTTGGCTCTGG AAT-3 «(F), 5 «-GGTCTTTGCCTGCTGAGAGT-3» (R). Lengden på hver PCR-produktet ble
KRAS
: 214 bp,
BRAF
: 228 bp,
PIK3CA
EX9: 269 bp og
PIK3CA
EX20: 273 bp. PCR-produktene ble sekvensert ved anvendelse av syklus-Big dye terminator v1.1 /3,0 syklus sekvenserings-settet (Life Technologies, CA, USA) i henhold til fremstilling instruksjon. Sekvens reaksjoner ble deretter utsatt for elektroforese på en Applied Biosystems 3730 × l DNA Analyzer (Life-teknologi, CA, USA).
Titrering Study hjelp Plasmid DNA og Genomisk DNA
For å evaluere mutasjonsdeteksjon følsomhet av AMDS ble en titrering studie av plasmid-DNA utføres. Titrering prøver (mengden av plasmid DNA: 1 fg /brønn, 10 fg /brønn og 100 fg /brønn) ble fremstilt som vist i figur 2A. Prøveblandingene inneholdt 30 pl av plasmid-DNA, 12 pl 500 mM NaCl, 18 ul av 100 mM MgCl
2, og 240 ul av D.W. Hver plasmid DNA-prøve inneholder 100 ng /brønn av laks testiklene enkelttrådet DNA (Sigma-Aldrich, MO, USA). Også bidrag tilbake bakken signal ble sjekket med Novagen® menneskelig kvinne genomisk DNA (EMD biosiences, CA, USA) (1 ng /brønn, 10 ng /brønn og 100 ng /brønn).
(A ) Plasmid DNA titrering studien. Plasmid DNA ble konstruert for totalt 13 ulike mutanter og seks villtype (
KRAS
: 1,
BRAF
: 1,
PIK3CA
: 2). (B) Klinisk ytelse studien. 70 FFPE- skiver vev og 89 Frosne skiver vev ble testet. Genomisk DNA ble ekstrahert fra FFPE skiver vev ved Epicentre® QuickExtract ™. Genomisk DNA ble renset fra frossen skiver vev ved QIAamp® DNA Micro kit. Også, som er omgitt av stiplede linjer, ble 1 mg av frosne skiver vev homogenisert og brukes for helautomatisk mutasjonsanalyse. (C) Titrering studie av
KRAS
G13D mutasjonsdeteksjon av DS. De electropherograms ble tatt for forskjellige mutant-vill blanding av plasmid-DNA (10 fg /reaksjon). (D) Titrering studie for
KRAS
G13D mutasjonsdeteksjon av AMDS. Grafen viser de sammenslåtte InvaderPlus® reaksjons data (n = 3) for annen mutant-vill blanding for
KRAS
G13D deteksjon av AMDS (◊; mt 100%, ○; mt 50%, △; mt 25% , Υ; mt 5%, *, mt 1%, + 0,5% og ×; mt 0%). Mengden av plasmid-DNA ble 10 fg /brønn. (E) elektroferogrammet av forover og revers analyse av samme prøve (ID = 56 754). (F) InvaderPlus® reaksjon av en prøve (ID = 56754) ved AMDS.
Klinisk Ytelse Study
Den eksperimentelle design for klinisk studie av AMDS ytelse er vist i figur 2B . Genomisk DNA fra prøven frosne seksjoner (n = 89) ble ekstrahert og renset ved QIAmp® DNA Micro kit (Qiagen, CA, USA), og justert til 10 ng /mL. Prøven lastet inn i DNA-brikken inneholdt 30 pl av 10 ng /mL genomisk DNA, 12 pl 500 mM NaCl og 18 pl 100 mM MgCl
2, og 240 ul av D.W. Genomisk DNA fra FFPE- seksjoner (n = 70) ble hentet med QuickExtract ™ FFPE DNA Extraction Kit [Epicentre® (en Illumina® selskap), WI, USA] i henhold til produsentens instruksjoner, og forberedt som en × 50 fortynning prøven. Laster prøve for DNA chip inneholdt 30 ul hentet DNA (× 50 fortynning), 12 pl 500 mM NaCl, 18 mL 100 mM MgCl
2, 240 mL DW
Kloning analyse
Kloning analyse ble utført for prøver (n = 14) som hadde uharmoniske mutasjonsstatus mellom AMDS og DS. Sett lengder av PCR produktene var 214 bp (
KRAS
), 228 bp (
BRAF
), 269 bp (
PIK3CA
EX9) og 273 bp (
PIK3CA
EX20). Primersekvensene er vist i Tabell S3. PCR-produkter ble fremstilt ved hjelp av GoTaq® DNA-polymerase og PrimeSTAR® GXL-DNA-polymerase. PCR-produktene ble spaltet med restriksjonsenzym, og fragmentene ble innsatt i pUC118 /Hincll og pMD19 /EcoRV. Innsatte kloner ble gjenkjent av blå-hvit screening. Plasmid DNA ble forsterket av ILLUSTRASJON TempliPhi DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, England). DS ble utført av Applied Biosystems 3730 × l DNA Analyzer.
Fullt automatisert somatiske mutasjoner Påvisning av AMDS
Omtrent 1 mg av frosne prøven seksjoner (n = 41) ble homogenisert i 20 sekunder av glass homogenisator, og 200 ul DW ble lagt til. Homogenatet ble overført til DNA rensing patron av AMDS, og helautomatisk mutasjonsdeteksjon prosess for
KRAS Hotell og
PIK3CA
mutasjoner ble gjennomført. De frosne prøver som næret
BRAF
V600E mutasjon ble ikke tatt med i denne studien på grunn av den begrensede mengden av DNA.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført for statistisk styrke og κ koeffisient tester [26] som ble brukt til å sammenligne forekomsten og graden av samsvar i deteksjon av
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
mellom DS og AMDS.
Resultater
Sammenligning Mutation følsomhet~~POS=HEADCOMP mellom AMDS og DS i Plasmid DNA Titrering Study
for å vurdere følsomheten av AMDS, vi brukte serielt utvannet plasmid DNA som inneholder forskjellige forhold av mutant og vill type
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
gener. Når prøven inneholdt mindre enn 25% av mutant-DNA, mutasjonen toppen i DS elektroferogrammet var ikke i stand til å skilles fra bakgrunnen (figur 2C). I kontrast, AMDS tydelig oppdaget
KRAS
G13D mutasjoner i et 5% nivå (maksimum 0,5%) som vist figur 2D.
Sammenligning Sensitivity of Mutation Detection mellom AMDS og DS i klinisk ytelse Study
mutasjonsdeteksjon ytelse ble sammenlignet mellom AMDS og DS med to sett prøver; Dypfryst vev (n = 89) og FFPE-prøver (n = 70) fra pasienter (n = 153) med CRC. Sammenkoblede fryste og FFPE prøvene var tilgjengelig for seks pasienter, og resten av prøvene var fra uavhengige pasienter. Sammenligningen ble utført på en dobbel-blindet måte. Som vist i tabell 1-3, alt
KRAS
,
BRAF Hotell og
PI3KCA
mutasjoner oppdages av DS i enten frosset (totalt antall mutasjon, n = 41, 46,0 %) eller FFPE (n = 27, 38,5%) prøver ble også med hell (100%) som detekteres av AMDS. Det var ingen prøver som ble bestemt som mutanter i DS mens oppdaget som villtype i AMDS. I prøvene detektert som vill-typer av DS, men AMDS var i stand til å gjenkjenne flere mutanter i frossen tilstand (n = 8, 9,0%) og FFPE (n = 6, 8,6%) prøver. Som vist i tabell 4, mutasjoner i både
KRAS Hotell og
PIK3CA
ble oppdaget av AMDS i 6 pasienter (6/153, 3,9%). Spesielt blant disse coexisting mutasjoner, alle
PI3KCA
mutasjoner var spesielt E545K, mens
KRAS
mutasjoner varierte.
Bilder
Resultater av DS og AMDS for en diskordant eksempel er vist i figur 2E og 2F. Denne prøve ble troverdig bestemt som en mutant ifølge DS bare med forover primer analyse. På grunn av dårlig sekvense signal på revers primer analyse ble denne prøven betraktet som en vill-type. I motsetning til dette, AMDS hadde en klar mutasjon signal. Alle andre uharmoniske resultater (8 i frosset vev, 6 i FFPE- vev) hadde svært lignende mønstre (data ikke vist).
Validering av uharmoniske data ved kloning og sekvense
Alle prøver som hadde uharmoniske mutasjonsstatus mellom AMDS og DS ble validert ved kloning analyse (figur 3A, B). Nøyaktigheten til kloning ble også evaluert med feilrate (ER) er definert som den frekvens av base endringer i den innsatte området mellom de plukkede koloniene som følgende ligning; ER = antall endringer /[(lengde av innsatsen) x (antall vellykkede klon sekvens)] x 100. De analyserte klonet regioner ikke har en hot spot for mutasjon annet enn målrettede poeng. Derfor baseendringer fra konsensussekvensen ble betraktet som misreadings ved DNA-polymerase. ER av PrimeSTAR® GXL (0,03 til 0,06%), som har 3 «→ 5» exo-nukleaseaktiviteten, var betydelig lavere enn for GoTaq® (0,16 til 0,29%). Frekvensen av alle mutasjoner av interesse (figur 3A, B) var mye høyere enn ER (
p
= 1,04 x 10
-6), som indikerer at mutasjoner i disse prøvene var sanne mutasjoner, og den uoverensstemmelse mellom de to metodene ble tilskrevet den nedre følsomheten av DS. I denne studien, utvalgsstørrelse var god nok siden høy grad av makt i
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
mutasjonsdeteksjon (
P
= 0,96, 0,97 og 0,94 henholdsvis) av AMDS (tabell 1-3). κ koeffisient tester av
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA plakater (κ = 0,91, henholdsvis 0,67 og 0,70) mutasjoner indikerte lav grad av sammenfall mellom AMDS og DS.
(A) Kloning analyse resultat av frossen vev. (B) Kloning analyse resultat av FFPE- vev .; PCR ble utført for frossen ID = 56756, ID = 63440 og FFPE ID = 41947, ID = 7053306 prøver med PrimeSTAR® GXL DNA polymerase. Andre prøver ble utført med PCR GoTaq® DNA-polymerase. Potensiell mutasjonsfrekvens i en prøve = (antall mutant sekvens) /(antall vellykkede sekvens). Hvis frekvensen er høyere enn ER, ble prøven ansett som positiv mutasjon. Merk: Det ble ikke bekreftet om mutasjonsraten av en prøve kunne kvantifiseres ved kloning analyse. (C) Venn-diagram av
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
mutasjoner. I denne grafen, er disse frekvensene av mutasjonen ikke beregnet for prøver, men for pasienter. 6 prøver ble tatt fra samme vev og klargjort for både frosset og FFPE skive. Den AMDS analyser for disse 6 prøvene viste samme resultat for både frossen og FFPE skive.
Figur 3C oppsummerer frekvensene av mutasjoner i alle pasienter (n = 153) basert på AMDS deteksjon. Mutasjon priser av
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
var 28,7% (44/153), 2,5% (4/153) og 10,1% (16/153) hhv. Hyppigheten av sameksisterende mutasjoner i
KRAS
eller
PIK3CA
var 3,9% (6/153).
AMDS og DS ble sammenlignet for sin robusthet i mutasjonsdeteksjon fra DNA-prøver fremstilt ved anvendelse av forskjellige metoder. Den kommersielle Qiagen DNA-rensesett (QIAmp® DNA Micro kit) ble anvendt med frosne vev, og en annen kommersiell DNA-ekstraksjon kit (Quick Ekstrakt ™) ble anvendt med FFPE-vev. Genotyping ringeprisene for DS var 100,0% (89/89) og 74,3% (52/70) i frosne og FFPE-prøver, henholdsvis for første forsøk; mens det av AMDS var 100,0% for begge prøvesettene. Figur 4A viser et tilfelle av G13D-mutasjon deteksjon, i hvilken prøven ble tatt fra den samme pasient og behandlet i både frosne og FFPE-skiver. Mens den frosne prøve har en klar elektroferogrammet, viste FFPE prøven støyende signaler. Atten prøver ble testet på nytt for DS, og 10 av disse lyktes. Men 8 prøvene var ikke i stand til å bli analysert i både forover og bakover etter flere forsøk. Ut av disse 8 prøver, kunne 7 prøver ikke analysert for
BRAF
mutasjoner, og en prøve ble ikke analysert for både
KRAS Hotell og
PIK3CA
mutasjoner. I kontrast, AMDS perfekt kalles disse prøvene som villtype for
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
gener.
CRC vev ble forberedt for begge frosset og FFPE format. Disse prøvene ble analysert ved både DS og AMDS. DS klarte å ringe genotype av FFPE vev på grunn av bråkete electrophenogram. Den samme prøven ble gjen sekvensert, og kalles som
KRAS
villtype. (B) AMDS analyseresultater med forskjellig totale mengde av plasmid DNA. Solid symboler (•, 100 fg /brønn, ▪, 10 fg /brønn, ▴; 1fg /brønn) indikerer signal av prøver som inneholdt 5% mutant, og tomme symboler (○; 100 fg /brønn, □, 10 fg /brønn, △, 1 fg /brønn) indikerer g plasmid DNA omtrent inneholde 210 eksemplarer. (C) AMDS analyseresultater med forskjellig mengde av villtype-genomisk DNA. (○; 100 ng /brønn, □, 10 ng /brønn, △, 1 ng /brønn).
robusthet mutasjonsdeteksjon for et bredt spekter av prøven konsentrasjoner ble også testet for AMDS. Figur 4B viser resultatet av plasmid-DNA eksperimentet. 5% av mutante DNA-signal hadde klart skille fra bakgrunner for området 1 fg /brønn til 100 fg /brønn av total plasmid-DNA, som svarer til 10 kopier til 1000 kopier av mål-mutant-DNA pr reaksjon. Kopiantallet av en fg /brønn plasmid-DNA (210 kopier) er ekvivalent med 0,63 ng /brønn av genomisk DNA. Mengden av genomisk DNA (ekstrahert frosne vev) som anvendes i den kliniske studien ytelsen var 10 ng /brønn, og som faller innen området av de ovenfor angitte forsøk. Imidlertid, for å kontrollere bakgrunnssignalnivå, men ytterligere forsøk med flere mengder av humant genomisk DNA ble utført. Figur 4C viser at bakgrunnssignalene er stabile og nesten identisk med plasmid DNA eksperimentet (figur 4B) i området fra 1 ng til 100 ng per brønn.
Feasibility Study of en helautomatisk
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
Mutation Påvisning av AMDS
i dette eksperimentet, råolje utvinning av frosne vevsprøver (n = 41) ble utført ved manuell knusing , og den rå homogenatet ble deretter anvendt som en prøve for helautomatisk mutasjonsanalyse av AMDS.
resultatene av helautomatiske mutasjonsanalyse var helt overensstemmende med de tidligere studiene kliniske resultater (tabell 5). I tillegg AMDS var i stand til å oppdage alle mutanter (3/41) at DS ikke kunne oppdage. Dermed AMDS kunne oppdage alle
KRAS plakater (14/41, 34,1%) og
PIK3CA plakater (8/41, 19,5%) mutasjoner selv fra disse Homogenatprøvene (~ 1 mg vev).
Diskusjoner
Denne studien evaluerte AMDS i to serier (Frozen og FFPE) av primære CRC vev til sammen 159 prøver. Våre data foreslo AMDS har større følsomhet og allsidighet enn DS. Den overlegne evnen til systemet vårt kan skyldes den høye følsomheten ( 0,5%) og troskap av Invader® kjemi som inneholder signalforsterkning evne [22], [23]. Dette er av særlig viktighet for mutasjon deteksjon når mutant nivået er ekstremt lav. Resultatene er vist i figur 4B og 4C foreslår AMDS kan opprettholde en 5% mutasjon deteksjonsfølsomhet med et svært bredt spekter (100 holder) av prøven konsentrasjon. Videre Kotoura
et al
. tidligere rapportert at PCR effektiviteten av DS og real-time PCR-basert analyse på FFPE-DNA-prøver blir påført ved hjelp av DNA-fragmentering [27]. Som vist på figur 3 og figur 4A, ble resultatene av mutasjonsanalyse via AMDS understøttes av klonings resultater, og det AMDS viste en betydelig overlegenhet til DS i sin følsomhet over lang rekke DNA-mengde og forskjellige fiksering tilstand.
i tillegg er AMDS systemet lyktes i en helautomatisk påvisning av
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
mutasjoner med homogenis frosne CRC prøver, noe som er en fordel for å analysere verdifulle prøver som biopsi vev. Mutasjonen deteksjon Fremgangsmåten fra AMDS er meget enkel og krever ikke eksperimentell teknikk og erfaring.
En av de viktige ting er at i det kloning analysen, ble det observert at vanligvis anvendes kommersielt Taq DNA-polymerase har en ikke- så lavt eR, mens PrimeSTAR® GXL DNA polymerase med en 3 «→ 5» exo-nukleaseaktiviteten (korrektur) har mindre eR. Derfor, når svært høy følsomhet er nødvendig for et assay, slik som mutasjon deteksjon av celle-frie DNA i blodprøver (serum eller plasma), Hi-Fi-DNA-polymerase bør brukes.
Som resultat av evalueringen for den kliniske CRC vev (n = 159) ved hjelp av AMDS, mutasjonsmønstre oppdaget i våre prøver er veldig konsekvent med hva som tidligere har rapportert [28] – [30]. Vi har observert svært interessant sameksistens av multiple mutasjoner mellom de tre gener. For eksempel, 6 av 153 prøver (3,9%) besatt dobbel (en for trippel) mutasjoner, som støtter hypotesen om synergis tumorigenesis mellom
KRAS Hotell og
PIK3CA product: [29], [31] . I tillegg var det to prøver som besatt både
KRAS
G13D og
PIK3CA plakater (E545K og /eller E542K) mutasjoner.
