Abstract
MAb 4C5 er en celle ugjennomtrengelig, anti-HSP90 monoklonalt antistoff, opprinnelig produsert ved hjelp av hybridoma teknologi. Vi har tidligere vist at mAb 4C5 spesifikt gjenkjenner både α- og i mindre grad den β-isoformen av HSP90. I tillegg
in vitro Hotell og
in vivo
studier viste at ved å selektivt hemme funksjonen til celleoverflaten HSP90, mAb 4C5 hemmer kreft celle invasjon og metastase betydelig. Her beskriver vi tilberedning av mAb 4C5 inn i en mus-menneske chimera. Enda viktigere rapporterer vi at mAb 4C5 og følgelig dens kimære motstykke er helt blottet for tung kjede og består kun av en funksjonell kappa lett kjede dimer. Det chimeriske antistoff er vist å beholde den opprinnelige antistoffets spesifisitet og funksjonelle egenskaper. Således er det i stand til å inhibere funksjonen av overflate HSP90, noe som fører til redusert kreftcelle invasjon
in vitro
. Til slutt presenterer vi
in vivo
bevis som viser at kimære 4C5 hemmer betydelig metastatisk innskudd dannelsen av MDA-MB-453 celler i lungene av SCID-mus. Disse data antyder at et kimært kappa-lettkjede-antistoff muligens kunne være brukt som et anti-cancermiddel, for derved å innføre en ny type av antistoff-fragment, med reduserte mulige uheldige immunogene virkninger, inn i kreftbehandling
Citation:. Sidera K, El Hamidieh A, Mamalaki A, Patsavoudi E (2011) The 4C5 Cell-Ugjennomtrengelig Anti-HSP90 antistoff med Anti-Cancer aktivitet, består av et enkelt lys Chain Dimer. PLoS ONE 6 (9): e23906. doi: 10,1371 /journal.pone.0023906
Redaktør: Paul C. Driscoll, MRC National Institute for Medical Research, Storbritannia
mottatt: May 11, 2011; Godkjent: 28 juli 2011; Publisert: 01.09.2011
Copyright: © 2011 Sidera et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Heat shock protein 90 (HSP90) regnes som en svært attraktive narkotika-mål for kreftbehandling, siden de fleste av sine klient proteiner spiller sentrale roller i oppkjøp og /eller vedlikehold av ondartede fenotype [1] – [4]. Nylig har vi og andre identifiserte en pool av HSP90 på celleoverflaten [5] – [8], der det ble vist å delta i kreftcelleinvasjon og metastase [9] – [11]. Økende bevis fortsetter å forsterke oppfatningen av en omfattende fenomenet ekstracellulære HSP90 chaperoning, innblandet i kreft progresjon og metastatisk spredning [12] – [16] og dermed støtte utviklingen av inhibitorer som spesifikt retter seg mot celleoverflaten HSP90. MAb 4C5 er en celle-ugjennomtrengelig murint monoklonalt antistoff produsert ved hjelp av hybridom-teknologi [17], som spesifikt gjenkjenner både α og i mindre grad den β isoform av HSP90 [8]. MAb 4C5 ble opprinnelig vist å hemme cellemigrering prosesser
in vitro
under utviklingen av nervesystemet [18], [19] ved å påvirke aktin cytoskeletal re-arrangement og dannelse av bevegelige strukturer som lamellipodia [8], [20]. Senere bevis ble presentert som viser at ved å binde selektivt til overflaten pool av HSP90, mAb 4C5 reduserer melanomcelleinvasjon og metastase [11] betraktelig. Videre mAb 4C5 ble vist å inhibere interaksjonen mellom ekstracellulære HSP90 og vekstfaktor-reseptor-ErbB-2 i MDA-MB-453 brystkreftceller, noe som fører til nedsatt nedstrøms signalering og redusert kreftcelle motilitet og invasjon [21]. Til slutt ble mAb 4C5 vist seg å hemme en funksjonell interaksjon mellom utskilt HSP90 og inaktive former av metalloproteinaser 2 og 9, er nødvendig for enzymene «aktivering som er avgjørende for kreftcelleinvasjon og ekstravasering [14]. Disse kombinerte data antydet at den unike kapasitet mAb 4C5 å spesifikt hemme ekstracellulære pool av HSP90 uten å påvirke bredt spekter av viktige intracellulære roller i denne anstand kunne ha klinisk nytteverdi i behandling av humane kreftformer. Imidlertid ikke murine mAbs utgjør ikke ideelle terapeutiske midler, siden deres potensial immunogenisitet representerer en begrensning for deres kliniske anvendelse. Anvendelsen av musen mAb’er mot human terapi har blitt mulig ved bruk av rekombinant DNA-teknologi som har ført til utvikling av kimære og humaniserte antistoffer som utviser en nedsatt immunogenisitet [22] uten et betydelig tap i den affinitet, særlig i tilfelle av kimære antistoffer [23], [24].
i dagens arbeid vi beskrive kloning og sekvensering av mAb 4C5 genene fra opprinnelses hybridom-cellelinje og den vellykkede konstruksjon av et funksjonelt mus-human kimær, som er vist seg å beholde egenskapene til foreldre antistoff. Enda viktigere rapporterer vi at mAb 4C5 er fullstendig blottet for tung (H) a-kjeden, og består av bare et funksjonelt immunoglobulin-kappa-lettkjede-dimer, og dens egenskaper kan rekapitulert i et rekombinant protein inneholdende kun dette lys (L) a-kjeden polypeptid. Til slutt, vi demonstrere potensialet terapeutisk effekt av denne romanen type antistoff fragment.
Resultater
MAb 4C5 er et antistoff fragment helt blottet for en tung kjede
elektro motilitet av mAb 4C5 studert under reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE viste at det ikke er en konvensjonell IgG-molekyl. Mer spesifikt, når rensede mAb 4C5 ble underkastet reduserende SDS-PAGE, etterfulgt av immunblotting med et anti-Fab, vi ikke observere den typiske 25 kDa og 50 kDa bånd tilsvarende L- og H-kjeden henholdsvis av en konvensjonell IgG-antistoff, men i stedet et enkelt bånd ved ca. 25 kDa (fig. 1A). Interessant nok en identisk 25 kDa båndet ble oppnådd etter immunblotting med et anti-kappa-L-kjede-antistoff (Fig. 1A). Følgelig, etter at ikke-reduserende elektroforese immunblotting med begge av disse standard-antistoffer, viser mAb 4C5 å være vesentlig mindre enn et konvensjonelt lgG1-molekyl, siden det migrerte ved omtrent 50 kDa. (Fig. 1A). Til slutt ble ingen immunreaktivitet detektert etter elektroforese av mAb 4C5 under både reduserende og ikke-reduserende betingelser, fulgt av immunoblotting ved å bruke en anti-Fcy (Fig. 1A). Disse kombinerte data indikerte at mAb 4C5 enten kan mangle en del av sin H-kjede, eller at det er helt fritt for H-kjeden. For ytterligere å utforske disse mulighetene vi neste utført northern blot analyse ved bruk av en IgG1 «H-kjeden probe. RNA avledet fra hybridomceller som produserer et intakt immunoglobulin IgG1 navngitt 2D10 tjente som positiv kontroll. I motsetning til den positive kontroll ble ingen radioaktivitet detektert etter hybridisering av RNA avledet fra mAb 4C5 hybridom og NSO myelom celler (negativ kontroll) (fig. 1B), noe som indikerer at mAb 4C5 kan helt mangle et H-kjedegenet. Dette ble ytterligere bekreftet ved H-kjede PCR amplifikasjon eksperimenter. For amplifikasjon av H-kjede cDNA av mAb 4C5, et panel på åtte mus universelle primere og en polyA + grunning henholdsvis rettet mot 5’and den 3 «ende av mRNA, ble testet i flere separate PCR-reaksjoner. Under alle forhold testet ingen amplifikasjon av en spesifikk H-kjeden produkt ble observert (data ikke vist). Disse kombinerte data antydet at mAb 4C5 er blottet for H-kjeden og vi gikk derfor til den rekombinante ekspresjon av antistoff-L-kjede alene for å undersøke egenskapene.
A. Elektroforetisk analyse av mAb 4C5, etterfulgt av immunblotting med et anti-muse-kappakjede, en anti-muse-Fab og anti-Fcy-antistoff. Intakt IgG1 immunoglobulin produsert av 2D10 hybridomcellene tjener som positiv kontroll. Under reduserende elektroforese etterfulgt av Western blot med anti-Fab-antistoff, er en enkelt 25 kDa-immunreaktivt bånd observert, i stedet for 25- og 50-kDa-bånd tilsvarende L- og H-kjeden henholdsvis av en intakt IgG1 . Dette 25 kDa båndet er identisk med det bånd som tilsvarer den kappa L-kjeden som vist ved western blot med anti-muse-kappa-kjede-antistoff. Under-ikke-reduserende elektroforese etterfulgt av Western blot med både anti-kappa og anti-Fab-antistoffer, er mAb 4C5 vist seg å migrere ved omtrent 50 kDa, og ikke på 150 kDa som forventet for et intakt lgG1-molekyl. Ingen mAb 4C5 immunreaktivitet blir detektert etter elektroforese under både reduserende og ikke-reduserende betingelser, etterfulgt av western blot med et anti-Fcy-antistoff. I tilfelle av lgG1-immunoglobulin under de samme betingelser en 50 kDa og 150 kDa bånd er observert, respektivt. B. ingen radioaktivitet detekteres etter northern blot analyse av 4C5 hybridom-avledet RNA med en H-kjede radiomerket probe. RNA avledet fra IgG1-produserende 2D10 hybridomceller og NSO myelomcellenes fungerte som positiv og negativ kontroll, henholdsvis.
Byggingen av kimære L- kjeden antistoff
Den første forsterkning av mAb 4C5 kappa-kjede-gen fra den første kjede-cDNA-templat ble utført ved anvendelse av universal mus L-kjede-primere ifølge Barbas [25]. PCR-produktet som svarer til den fulle lengden mAb 4C5 L-kjeden, ble deretter subklonet inn i pComb3H vektoren. Sekvensanalyse av rekombinant L-kjede (rec-4C5) viste at den tilhører kappakjede undergruppe I [26] (fig. 2).
nukleotid- og aminosyresekvenser av den L-kjede variable regionen mAb 4C5.
chimerisk L-kjede antistoff (lm-4C5) ble konstruert ved å erstatte musen LCκ kodende område med tilsvarende menneskelige LCκ innsats. Sekvensanalysen av flere rekombinante kloner bekreftet den vellykkede konstruksjon av kimære mus-humant antistoff.
Både rec-4C5 og ch-4C5 ble uttrykt i bakterie periplasmatiske rom og renset som beskrevet i materialer og metoder. De elektro motilities av de rensede antistoffer ble testet under reduserende og ikke-reduserende betingelser og ble funnet å være lik den tilsvarende motiliteten av det opprinnelige mAb 4C5-antistoff (Fig. 3A).
A.
Venstre panel:
SDS-PAGE av renset antistoff under reduserende betingelser, fulgt av Coomasie Brilliant Blue R-farging viste i alle tilfeller en tilnærmet 25 kDa båndet svarende til L-kjeden.
Høyre panel:
Under ikke-reduserende betingelser antistoffer er vist å migrere som en L-kjede dimer. B. Western blot av MDA-MB-453 cellelysater bruker mAb 4C5, rec-4C5, ch-4C5 og en kommersiell anti-HSP90α antistoff, som fungerer som positiv kontroll. I alle tilfeller et enkelt 90 kD immunreaktive bånd svarende til HSP90 observeres. C. Immunoutfelling i MDA-MB-453 cellelysater med anti-HSP90α, etterfulgt av immunblotting med enten de murine eller de rekombinante antistoffer. I alle tilfeller en enkelt immunreaktivt bånd observeres. D. Omvendt immunoutfellingsstudier eksperimenter i MDA-MB-453 cellelysater bruker mAb 4C5, rec-4C5 og ch-4C5, etterfulgt av western blot med anti-HSP90α. I alle tilfeller en enkelt immunoreactive Bandet er observert indikerer at begge rekombinante antistoffer gjenkjenne HSP90.
lm-4C5 gjenkjenner spesifikt HSP90
For å utforske spesifisitet av antistoffene, western blot analysen ble utført i MDA-MB-453 brystkreftcellelysatene ved hjelp av en kommersiell polyklonale anti-HSP90α antistoff (Chemicon International, USA), mAb 4C5, rec-4C5 og ch-4C5. I alle tilfeller ble det observert en enkelt identisk immunoreaktivt bånd (Fig. 3B), som bekrefter at både rec-4C5 og 4C5-ch beholde spesifisiteten av fars mAb 4C5. Dette resultatet ble ytterligere bekreftet ved immunoutfelling eksperimenter utført i forhåndserte MDA-MB-453 cellelysater ved anvendelse av anti-HSP90α, etterfulgt av immunblotting med mAb 4C5, rec-4C5 eller CH-4C5. I alle tilfeller ble en enkelt immunreaktivt bånd observert, noe som indikerer at den chimeriske L-kjede spesifikt gjenkjenne HSP90 (Fig. 3C). Det samme resultat ble oppnådd da immunoutfelling ble utført ved anvendelse av mAb 4C5, rec-4C5 og 4C5-ch, etterfulgt av western blot med anti-HSP90α-antistoff (Fig. 3D). I alle forsøkene en irrelevant mus IgG ble brukt som negativ kontroll.
ch-4C5 er celle-ugjennomtrengelig og påvirker ikke funksjonen til intracellulære HSP90
For å undersøke om lm-4C5 binder til overflaten HSP90, ble ikke reparerte MDA-MB-453 celler inkubert med enten rec-4C5 eller ch-4C5 mens i kultur. Således antistoffene hadde tilgang bare til den ytre overflaten av cellene. Etter inkubering ble cellene behandlet for indirekte immunofluoresence ved hjelp av et fluorescent-merket sekundært antistoff. Den observerte typisk punctata immunofarging bekreftet celleoverflaten merking (fig. 4A). Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av anti-HSP90α og mAb 4C5 (Fig. 4A). Det er verdt å merke seg at på samme måte som mAb 4C5, CH-4C5 samt rec-4C5 også gjenkjenner det intracellulære lageret av HSP90 som demonstrert ved immunofluoresence etter fiksering og permeabiliseringen av MDA-MB-453-celler (Fig. 4B). Til slutt, binding av antistoffer til å leve MDA-MB-453-celler ble målt ved forskjellige tidsintervaller. Som vist på fig. 4C, på samme måte som mAb 4C5, rec-4C5 og ch-4C5 ble ikke internalisert og forble bundet på celleoverflaten i opptil 24 timer i kultur.
A. Immunofluoresence merking av MDA-MB-453 celler ved hjelp av både rec-4C5 og ch-4C5. Den Punktum immunolabeling indikerer overflaten pool av HSP90. Negative kontroller ble utført under anvendelse av et antistoff mot det intracellulære protein β tubulin (data ikke vist). Skala: 20 mikrometer B. Immunofluoresence påvisning av intracellulær HSP90 i faste MDA-MB-453-celler, permeabilisert med 0,1% Triton X-100. I likhet med den murine antistoff, rec-4C5 og ch-4C5 gjenkjenne den intracellulære pool av HSP90. Skala: 20 mikrometer C. For påvisning av antistoff intern ble levende celler inkubert med antistoffer for ulike tidsintervaller, deretter fast, permeabilized og fluorescensmerkede. Ingen internalisering av mAb4C5, rec-4C5 og ch-4C5 er observert selv etter 24 timer inkubasjon. I motsetning til den anti-HSP90α antistoff kan påvises intracellulært etter 24 timers inkubering. Skala: 20 mikrometer D. MDA-MB-453 cellelysater, behandlet med mAb 4C5, ble rec-4C5, ch-4C5 og anti-HSP90α analysert ved western blot hjelp antistoffer mot ErbB2, Akt, hån og HSP90α. Actin fungerte som en lasting kontroll. Tilstedeværelse av mAb 4C5, rec-4C5 og ch-4C5 ikke påvirke nivåene av kinaser i forhold til kontrollene. I motsetning cellen gjennomtrengelige anti-HSP90α antistoff betydelig redusert nivåene av ErbB2, Akt og hån.
Betydningen av ch-4C5 celletetthet ble undersøkt ved å overvåke nivåene av en undergruppe av intracellulær HSP90 klient proteiner. Til dags dato mer enn 100 intracellulære HSP90-klient proteiner er blitt identifisert. Cellepermeabel HSP90-inhibitorer indusere nedbrytningen av disse proteinene, fordi deres stabilitet avhenger av intracellulær HSP90 funksjon [3]. Siden våre data antydet at mAb 4C5 og senere REC-4C5 og ch-4C5 er celle ugjennomtrengelig, undersøkte vi deres evne til å påvirke stabiliteten i tre veldefinerte HSP90 klient proteiner, Akt, hån og ErbB-2. Etter inkubering av MDA-MB-453-celler med forskjellige konsentrasjoner av mAb 4C5, rec-4C5 og 4C5-ch, ble nivåene av Akt, Craf og ErbB2 overvåket ved western blotting. Som vist i figur 4D disse antistoffene ikke påvirket likevektsnivåer av hvilken som helst av kinaser studert. I motsetning til dette når cellene ble inkubert med cellegjennomtrengelige anti-HSP90α, ekspresjonsnivåene av disse kinaser ble signifikant redusert (fig. 4D).
CH-4C5 hemmer kreftcelle invasjons
Tidligere studier har vist at mAb 4C5 inhiberer MDA-MB-453 brystkreft og B16 B10 melanom celle invasjon i en sårtilheling analyse [11], [21]. For å bekrefte at lm-4C5 viser samme funksjonelle eiendom, vi utførte
in vitro
sårtilheling analyser ved hjelp av MDA-MB-453 og B16 F10 kreftceller. Kontrollkulturer ble dyrket enten i dyrkningsmedium alene, eller i kulturmedium inneholdende 200 ug /ml av det irrelevante antistoffet BM88. Ingen statistisk signifikant forskjell ble observert mellom de to typer av kontroller som brukes. Middelverdien av de to typer kontroll ble ansett som 100% for sårheling. Som vist på fig. 5A, B nærvær av CH-4C5 i kulturmediet betydelig redusert forlenger av MDA-MB-453 kreftcelle invasjon innenfor overføringsgapet etter 24 timer, sammenlignet med kontrollkulturer. Mer spesifikt, er tilstedeværelsen av CH-4C5 resulterte i en 46% inhibering av lukking av sår, som var lik den som ble oppnådd når anti-HSP90α, samt mAb 4C5 og rec-4C5 ble inkludert i kulturmediet (Fig. 5A , B). Barene i fig. 5B representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± SEM. Innenfor et enkelt eksperiment, ble hver tilstand testet tre ganger. Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av B16-F10-melanomceller og økende konsentrasjoner av ch-4C5 som ga en doseavhengig hemming av celle invasjon (fig. 5C, D). Det er viktig å merke seg at i den til sårheling analysen virkningen av CH-4C5 er rettet mot celleinvasjon og ikke celleproliferasjon som bedømt av en uavhengig MTT-analyse (data ikke vist). Dette er i samsvar med tidligere publiserte data som viser at nærværet av mAb 4C5 i kulturmediet av B16-F10 [11] og MDA-MB-453 [21], ikke påvirker celleproliferasjon, siden lav BrdU-inkorporering ble observert med noen åpenbar forskjeller i fravær eller nærvær av antistoffet.
A. Sårheling analysen. Fotografier representerer fase kontrast oppnådd på null tid (venstre panel) og 24 timer (panel høyre) etter scratch formasjon, viser MDA-MB-453 cellemigrasjon enten i kontrollkulturer eller kulturer, inkludert anti-HSP90α, mAb 4C5, aner 4C5 eller ch-4C5. Skala: 200 mikrometer. B. kvantitative virkning av antistoffer på lukking av såret. Tilsetning av 200 ug /ml av anti-HSP90α og mAb 4C5 i kulturmediet resulterte i en 48% og 55% reduksjon for sårheling, henholdsvis sammenlignet med kontrollkulturer som ble vurdert som resulterer i 100% lukking av sår. Tilsetning av 200 ug /ml rec-4C5 og 4C5-ch i kulturmediet resulterte i en 46% og 46% hemning av sårheling, respektivt. Statistisk signifikans av forskjeller ble bestemt ved Students t-test. Tilstedeværelsen av anti-HSP90α, mAb 4C5, rec-4C5 eller ch-4C5 hadde en statistisk signifikant effekt på lukking av sår (p 0,01 i hvert tilfelle). C. Fase-kontrast oppnås ved tid null (venstre panel) og ved 24 timer etter ripedannelse (høyre panel), som viser B16 B10 melanom celle invasjon i en sårtilheling assay i nærvær av 200 ug /ml CH-4C5. Skala: 200 mikrometer. D. kvantitative virkning av økende konsentrasjoner av ch-4C5 på invasjonen nivået av B16 B10 melanomceller. Nærvær av 50 ug /ml CH-4C5 resulterte i 15% inhibering av invasjon, mens tilsetning av 100 ug /ml og 200 ug 4C5 /ml ch resulterte i 21% og 43% inhibering av migrering, henholdsvis sammenlignet med kontrollkulturer som var betraktes som resulterer i 100% lukking av sår. E. Visualisering av døde celler ved hjelp av trypan blått fargestoff. I lm-4C5 behandlede kulturer, er celledød forekomst lik den som ble observert i kontrollkulturer. I motsetning til dette, i kulturer som ble behandlet med anti-HSP90α antistoff, blir et mye større antall celler farget med Trypan blå, som indikerer en økt forekomst av celledød Scale bar, 30 um. F. Kontroll og ch-4C5 behandlede celler ble fiksert permeabilized og farget med fluorescensmerkede phalloidin. Scale bar 40 mikrometer G. Høyere forstørrelse viser phalloidin flekker (F-aktin). Ch-4C5 effektivt blokkerer spredning av lamellipodia. Skala: 16 mikrometer
På dette punkt skal det bemerkes at den hemmende effekten av anti-HSP90α antistoff på MDA-MB-453 invasjon hastigheten var i stor del på grunn av økt celledød. som bedømt ved trypanblått-farving, som selektivt farger døde celler (fig. 5E). I kontrast, når kulturer ble behandlet med mAb 4C5 og ch-4C5, forekomsten av celledød var lik den som ble observert i kontrollkulturer (Fig. 5E). Dette resultatet støtter videre at ch-4C5, i motsetning til den celle-gjennomtrengelige anti-HSP90α antistoff, er celle-ugjennomtrengelig og ikke påvirker det intracellulære lageret av HSP90, noe som er viktig for celleoverlevelse.
Endelig er disse kulturer ble undersøkt med hensyn til aktin re-arrangement dynamikk ved hjelp av fluorescensmerkede phalloidin. MDA-MB-453-celler utsatt for ch-4C5 var mindre spredning sammenlignet med celler i kontrollkulturene, og deres morfologi var indikasjon på ikke-motile celler. Videre, når visualisert ved høyere forstørrelse, av lamellipodia i behandlede kulturer var mindre utviklet mindre og spredt ut i forhold til lamellipodia i kontrollkulturer (fig. 5 F, G). Disse resultatene er i samsvar med tidligere publiserte data om effekten av mAb 4C5 på aktin re-arrangement og lamellipodia utvikling [21].
lm-4C5 reduserer MDA-MB-453 metastatisk deponering i lungene av SCID mus
neste søkt å undersøke
in vivo
effekten av lm-4C5 på metastatisk oppførselen til MDA-MB-453 kreftceller. For dette formål, MDA-MB-453-celler ble forbehandlet eller ikke, med 200 ug /ml CH-4C5 og deretter merket med fluorescerende fargestoff Dio og injisert intravenøst i SCID-mus via halevenen. Tolv timer etter injeksjonen, ble musene avlivet, og de metastatiske forekomster av MDA-MB-453-celler ble sporet og evaluert i lungene til både kontroll- og CH-4C5-behandlede grupper. Som vist på fig. 6A, en betydelig reduksjon i avsetningen av MDA-MB-453-celler ble detektert i CH 4C5-behandlede mus sammenlignet med kontrolldyrene. Mer spesifikt, kvantifisering av metastatisk avleiringer viste en 38% hemming i lm-4C5 behandlede mus sammenlignet med kontroll mus (Fig. 6B).
Kontroll eller ch-4C5 behandlet MDA-MB-453 celler ble merket med fluorescerende fargestoff Dio og injisert i SCID-mus som beskrevet i Materialer og Metoder. Evaluering av metastatisk innskudd ble utført flere timer senere. A. Representative frysesnitt av lungene av kontroll og ch-4C5 behandlet mus. Pilene viser MDA-MB-453-celler farget med Dio til stede i lungevevet. En betydelig reduksjon i avsetningen av kreftceller ble observert i lungene til ch-4C5 behandlede mus. Skala: 100 pm B. kvantitative virkning av ch-4C5 på metastatisk avsetning av MDA-MB-453 celler i lungene, viste en 38% inhibering sammenlignet med kontrolldyrene. Stolpene representerer gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter ± SEM. Statistisk signifikans av forskjeller ble testet av Student t-test (p 0,01).
Diskusjoner
I denne studien beskriver vi kloning og sekvensering av en anti-HSP90 monoklonalt antistoff , oppkalt mAb 4C5. Enda viktigere, viser vi at mAb 4C5 er ikke en konvensjonell IgG-molekyl, men i stedet er det helt blottet for en H-kjede og bare består av en kappa-lettkjede-dimer. Dette funnet ble opprinnelig understøttet ved hjelp av SDS-PAGE-elektroforese i henhold til denaturerende og ikke-denaturerende betingelser, noe som viser at mAb 4C5 vandrer ukonvensjonelle ved omtrent 26- og 50-kDa, respektivt. I tillegg, når total-RNA isolert fra mAb 4C5-produserende hybridom-cellelinje ble utsatt for Northern blot-hybridisering ved anvendelse av en IgG1 «H-kjede cDNA radio-merket probe, ingen radioaktivitet kunne påvises. Etter avtale med de ovennevnte resultater, når vi forsøkte å forsterke H-kjeden cDNA ved hjelp av universelle mus H-kjeden primere vi ikke kunne isolere et H-kjeden produkt under alle forhold som ble testet. Til slutt ble den uvanlige naturen av mAb 4C5 bekreftet utover enhver tvil, ettersom det rekombinante kappa L-kjede uttrykkes i bakterier ble vist å beholde alle egenskapene til fars antistoffet, inkludert antigen-binding og
in vitro-hemming av
kreftcelle invasjon.
Dette monoklonale antistoff ble opprinnelig produsert ved immunisering av mus med en hjerne-avledet membranfraksjon fra 15 dager gamle rotteembryoer [17], og det ble vist å spesifikt gjenkjenne og hemme funksjonen av overflaten HSP90 i løpet av cellemigreringsprosesser [8]. I tillegg ble mAb 4C5 vist seg å redusere hastigheten av invasjon og metastase av kreftceller. Nærmere bestemt ble det vist at dette antistoff inhiberer melanomcelleinvasjon og metastase [11], så vel som interaksjonen av overflate HSP90 med det ekstracellulære domenet av ErbB-2, fører til svekket nedstrøms signalering og deretter redusert hastighet på
in vitro
brystkreftcelle invasjon [21]. Enda mer nylig, plater et al. [14] gitt
in vitro Hotell og
in vivo
bevis som viser at mAb 4C5 indirekte hemmer aktiveringen av pro-gelatinaser MMP-2 og MMP-9, som er nødvendig for kreftcelle invasjon, bloduttredelse og metastasering. Disse kombinerte data ytterligere understøttet ideen om at mAb 4C5 kan være nyttig som en cancer terapeutisk og orientert våre studier mot bestemmelse av aminosyresekvensen og rekombinant ekspresjon av dette antistoff.
Det er vel kjent at museantistoffer har begrenset bruke for
in vivo
terapi hos mennesker på grunn av deres immunogenisitet. I mange tilfeller er dette problemet har blitt overvunnet ved hjelp av genteknologiske metoder for å produsere kimære mus-humane og fullstendig humaniserte antistoffer. Tatt i betraktning den ukonvensjonelle arten av mAb 4C5 i kombinasjon med det faktum at i løpet av humanprosessen antistoffet affinitet ofte reduseres, vi neste rekonstituert det murine mAb 4C5 inn i en funksjonell mus-humant kimært versjon som, i likhet med fars antistoff binder seg til overflate HSP90, er celle ugjennomtrengelig og hemmer kreftcelle invasjon. Det kimære antistoff som ble konstruert ved å erstatte Cκ- regionen av fars murine antistoffet med det tilsvarende humane CK-region ble vist å beholde spesifisiteten og affiniteten av fars mus-antistoff.
Det har vært et alminnelig akseptert konsept som antistoffmolekylet krever både H- og L-kjeder til sin fulle aktivitet [27]. Dessuten er den H-kjeden antas å være den dominerende bidragsyter til den frie energi av antigen bindings mens bidraget til L-kjeden er ment å være begrenset [28], [29]. Den sistnevnte Tanken er videre støttet av det faktum at cameloids besitter en klasse av fullstendig funksjonelle antistoffer fullstendig mangler L-kjeder, og som består av H-kjede-dimerer [30], [31]. I sammenheng med disse funnene, H-kjeder alene ble vist å interagere med en rekke antigener som på en spesifikk måte (om enn med lavere affinitet enn det intakte antistoffer), noe som har ført til anvendelsen av ett domene antistoffer avledet fra H-kjedene [32] i forskning, bioteknologi samt human-terapi. I det siste har det vært sporadiske rapporter om antigen bindende etter L-kjeder. De første eksempler på gratis inmmunoglobulin lette kjeder berørte de såkalte Bence-Jones proteiner. Disse ble rapportert som L-kjeden dimerer uttrykt av multiple myelomceller, samlet fra urinen til humane pasienter [33]. Videre ble store mengder L-kjedene funnet å akkumulere i de ekstracellulære væsker og vev hos pasienter med L-kjede-utskillende tumorer [34]. En kappa-lettkjede-dimer med CD4-antigen spesifisitet avledet fra en hybridom cellelinje ble beskrevet i 1987 av Ledbetter et al. [35] og i 1994 Mei Sun et al [36] rapporterte at et renset L-kjede fra et monoklonalt antistoff mot vasoaktivt intestinal polypeptid (VIP) viste sekvens-spesifikk og av høy affinitet binding til VIP. Følgelig Nishimura et al. [37] rapporterte fremstilling av et rekombinant λ lettkjede som oppviser en betydelig høyere aktivitet av binding til antigenet sammenlignet med det intakte antistoff. Videre har disse forfattere presentert bevis for at det rekombinante lettkjede kan tjene som et potensielt nyttig redskap for klinisk anvendelse, for eksempel radio-immunoimaging og radio-immunterapi av lungekreft. Det er også rapportert at antistoff-L-kjede-dimerer fremstilt av en mus hybridom reagere med humane melanom vev [38]. I 1998 Pereira et al. [39] har vist at en enkelt L-kjede variabel sekvens inneholder alle de faktorer som bestemmer nødvendige for kardiolipin binding, med en affinitet som er lik den til det intakte antistoff. I den senere tid Dubnovitsky et al. [40] rapporterte at den rekombinante V
L-domene fra et monoklonalt antistoff mot ferritin bevart sin antigenbindende funksjon med en affinitet som kan sammenlignes med den for full-lengde foreldre antistoff.
I det foreliggende arbeidet vi har vist at ch-4C5 er fullstendig blottet for en tung kjede og består av en L-kjede dimer. CH-4C5 har en høy spesifikk aktivitet som demonstrert ved immuno og immunofluoresence eksperimenter ved hjelp av brystkreftceller. Videre og på samme måte som den faderlige antistoff lm-4C5 utstillinger funksjon-blokkerende egenskaper som bedømmes av
in vitro
sårbehandling analysen. Til slutt, ved hjelp av et
in vivo-assay
vi har demonstrert at ch-4C5 reduserer metastatisk avsetning av MDA-MB-453 brystcancerceller inn i lungene av SCID-mus.
Disse resultatene gir en nytt perspektiv for klinisk anvendelse av L-antistoffer i kreftbehandling. Rekombinante L-antistoffer har en rekke fordeler i forhold til intakte antistoffer og V
H antistoffer når de er beregnet for human-terapi, det vil si relativt lett og reproduserbar produksjon, kvalitetskontrollen og raskere clearance fra sirkulasjonen. Til slutt fra et klinisk synspunkt, gir overflaten HSP90 en ny og meget lovende ekstracellulære stoffet mål for effektiv behandling av metastatisk kreft. I denne sammenheng, evne til CH-4C5 for selektivt å hemme funksjonen av overflaten pool av HSP90, som indikert ved
in vitro
og
in vivo
data presentert i den nåværende arbeid, uten å forstyrre HSP90 intracellulær funksjon, gjør dette antistoffragment en potensiell kreft terapeutisk.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyrestudier ble gjennomført i henhold til nasjonale og internasjonale retningslinjer og ble spesielt godkjent av etisk komité i Hellenic Pasteur Institute (Permit No: K /533, Veterinærdirektoratet District of Attiki). SCID-mus ble opprinnelig kjøpt fra Jackson Laboratory, oppdrettet og holdes under bestemte patogen frie forhold på forsøksdyr Enhet for den hellenske Pasteur Institute.
