Abstract
Vår tidligere studie fant at [6] -shogaol, en stor bioaktive komponenter i ingefær, metaboliseres i stor grad i kreftceller og mus. Det er uklart om disse metabolittene beholde bioaktivitet. Målet med denne studien er å syntetisere de store metabolitter av [6] -shogaol og evaluere deres inhibering av vekst og induksjon av apoptose i humane kreftceller. Tolv metabolitter av [6] -shogaol (M1, M2 og M4-M13) ble vellykket syntetisert ved hjelp av enkle og lett tilgjengelige kjemiske metoder. Veksthemming analyser viste at de fleste metabolitter av [6] -shogaol hadde målbare aktiviteter mot humane kreftceller HCT-116 og H-1299. Spesielt metabolitten M2 sterkt beholdt de biologiske aktivitetene til [6] -shogaol, med en IC
50 av 24.43 mikrometer i HCT-116 humane tykktarmskreftceller og en IC
50 av 25,82 mikrometer i H-1299 menneske lungecancerceller. Også utviser en relativt potent var tiol-konjugat M13, med IC
50 verdier av 45,47 og 47,77 mM mot HCT-116 og H-1299 celler, henholdsvis. Toksisiteten evaluering av de syntetiske metabolitter (M1, M2 og M4-M13) mot menneske normal fibroblast kolon celler CCD-18Co og menneske normal lungeceller IMR-90 viste en avgift metabolsk biotransformasjon av [6] -shogaol. Den mest aktive metabolitten M2 hadde nesten ingen toksisitet for CCD-18Co og IMR-90 normale celler med IC
50-årene av 99,18 og 98,30 mikrometer, henholdsvis. TUNEL (Terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking) analyse indikerte at apoptose ble utløst av metabolitter M2, M13, og sine to diastereomerene M13-1 og M13-2. Det var ingen signifikant forskjell mellom apoptotisk effekt [6] -shogaol og effekten av M2 og M13 etter seks timers behandling
Citation. Zhu Y, Warin RF, Soroka DN, Chen H, Sang S ( 2013) metabolitter av Ginger Component [6] -Shogaol Remain bioaktive i kreftceller og har lav toksisitet i normale celler: Kjemisk Syntese og biologisk evaluering. PLoS ONE 8 (1): e54677. doi: 10,1371 /journal.pone.0054677
Redaktør: Joseph J. Barchi, National Cancer Institute ved Frederick, USA
mottatt: 24 oktober 2012; Godkjent: 13 desember 2012; Publisert: 30 januar 2013
Copyright: © 2013 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir CA138277 og CA138277S1 til SS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for enorme innsatsen som er gjort mot utvikling av kreft terapi i løpet av de siste tiårene, er kreft fortsatt et stort folkehelseproblem over hele verden. Økende bevis har vist at behandling med bestemte stoffer eller hemmere rettet mot bare en biologisk hendelse eller en enkelt bane vanligvis mislykkes i kreftbehandling [1]. Konvensjonelle kjemoterapeutiske midler har vist seg å være forbundet med uakseptabel toksisitet. Nye tilnærminger til kontroll av kreft er kritisk nødvendig. Chemoprevention er en innovativ område av kreft forskning som fokuserer på forebygging av kreft gjennom farmakologisk, biologisk, og ernæringsmessige tiltak [2]. Samler studier har vist at kosttilskudd fytokjemikalier som finnes i planter og frukt, som er generelt ansett som ikke-giftige stoffer, kan aktivere eller blokkere flere viktige veier som er involvert i kreft celle overlevelse og vekst [1], [3], [4] . Kjemoprevensjon av spiselige fytokjemikalier er nå ansett å være et trygt, billig, lett akseptabelt og tilgjengelig tilnærming til kreft forebygging, kontroll og styring.
Ginger, rhizome av
Zingiber officinale
, har vært en vanligvis brukes krydder og råolje medikament i mange år over hele verden. Ingefær er spioneringen for sin lindring av kvalme, anti-inflammatoriske egenskaper, og antatte anti-kreft aktivitet [5] – [7]. De viktigste farmakologisk aktive komponenter i ingefær er gingerols og shogaols (figur 1) [5]. Termisk behandling av gingerols gir shogoals som den primære bestanddeler av tørket ingefær [5], som ofte viser større anti-kreftfremkallende aktivitet enn sine forløpere. For eksempel, vår gruppe viste at [6] – [8] – og [10] -shogaols oppviste mye høyere anti-proliferativ potens enn [6] – [8] – og [10] -gingerols mot H- 1299 menneskelige lunge og HCT-116 humane tarmkreftceller [8]. Kim
et al
. rapportert at [6] -shogaol utstilt mye sterkere veksthemmende effekter i en-549 humane lungekreftceller, HCT-15 menneskelige tykktarmskreftceller, SK-OV-3 menneskelige eggstokkreft celler og SKMEL-2 menneskelige hud kreftceller enn [ ,,,0],4] -, [6] – [8] – og [10] -gingerols [9]. Sammen med våre samarbeidspartnere, har vi funnet ut at [6] -shogaol var mer effektiv enn [6] -gingerol i begrenser 12-
O
-tetradecanoylphorbol 13-acetat (TPA) stimulert tumorvekst i mus [10 ]. En nyere studie fant at [6] -shogaol indusert apoptose, caspaseaktivering, og Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spalting i begge SMMC-7721 human leverkreft celler og SMMC-7721 tumorxenotransplantater gjennom en endoplasmatiske retikulum (ER ) stress forbundet mekanisme [11].
En fersk studie fra vår gruppe har vist at [6] -shogaol metaboliseres i stor grad i mus og i kreftceller, der tretten metabolitter (M1-M13 ) ble påvist og identifisert [12]. Spormengde av metabolitter M6-M12 ble renset fra fekale prøver fra [6] -shogaol-behandlede mus, og deres strukturer ble karakterisert basert på analyse av
1 H,
13C, og 2-D NMR-data [12 ]. Strukturer av de resterende metabolitter (M1-M5 og M13) ble undersøkt basert på analyse av deres MS
n (n = 1-3) spektra og sammenlignet med autentiske standarder. Med sin α, β-umettet keton struktur, har vi funnet at [6] -shogaol kan reduseres for å generere metabolitter M6-M9 og M11. Vi fant også at [6] -shogaol er underlaget for tiol konjugering gjennom merkaptopurinsyre veien å danne metabolitter M1-M5, M10, M12 og M13. Siden de fleste av [6] -shogaol metaboliseres
in vivo Hotell og i kreftceller, er det kritiske spørsmålet om metabolitter av [6] -shogaol er bioaktive. Selv om mindre potent enn [6] -shogaol, kan de fortsatt bidra til den generelle biologiske aktiviteten til [6] -shogaol
in vivo
.
Dagens utfordring å studere bioaktivitet av metabolitter er deres manglende kommersielle tilgjengelighet. Med spormengder av metabolitter renset fra mus fekale prøver, kunne vi bare til å undersøke effektene av de to viktigste metabolittene M9 og M11 på veksthemming og induksjon av apoptose i humane kreftceller. Våre resultater viste at M9 og M11 er bioaktive forbindelser som kan hemme kreft celle vekst og induserer apoptose i humane lunge og tykktarmskreftceller, men med mindre styrke enn [6] -shogaol. Derfor er det riktig å utvikle kjemiske metoder for å syntetisere de metabolitter av [6] -shogaol og for ytterligere å undersøke deres anti-kreft aktivitet. Studien beskriver en kjemisk syntese av de tidligere identifiserte metabolitter av [6] -shogaol og en bioaktivitet analyse i kreftceller. Også undersøkt er toksisiteten av [6] -shogaol og dets metabolitter i normale humane lunge og kolon celler, noe som gir en sammenligning av [6] -shogaol toksisitet i en ikke-kreftmodell.
Resultatene
Kjemisk syntese av metabolitter av [6] -shogaol
Tolv metabolitter (M1, M2 og M4-M13) ble syntetisert vellykket fra [6] -shogaol ved hjelp av enkle og lett tilgjengelige semisyntetiske tilnærminger i gjeldende studien (figur 2 og 3). I korte trekk, omsetning av [6] -shogaol med L-cystein (Cys), N-acetyl-L-cystein (NAC) eller L-glutation (GSH), som genereres tiol-konjugater M2, M5, eller M13, respektivt (figur 2). Deretter ble reduksjon av tiol-konjugater M2 eller M5 av NaBH
4 ført til hydroksylerte konjugater M1 eller M4 henholdsvis (figur 2). Selektiv reduksjon av [6] -shogaol ved en kombinasjon av NaBH
4 og CeCl
3.7H
2O resulterte i M6 (figur 3) [13]. Hydrogenering av [6] -shogaol på Pd /C ga M11, etterfulgt av behandling med NaBH
4 for å frembringe M9 (figur 3). I tillegg demetylering av M11 ved hjelp av BBr
3 ga M8 (figur 3). Michael-reaksjon ifølge [6] -shogaol med NaOMe eller NaSMe produserte metoksy adduktet M7 eller M10 metyltio adduktet, henholdsvis (figur 3) [14], [15]. Herav ble det metyltio adduktet M10 behandlet med NaBH
4 for å gi M12 (figur 3). Siden både reduksjon av keton og Michael reaksjoner brukt i denne studien er ikke-stereo, metabolitter M1, M2, M4-M7, M9, M10, M12 og M13 er syntetisert som blandinger av diastereomerer.
Reagenser og betingelser: i.) L-cystein, NaHCO3 (katt), MeOH /H2O rt, 24 h; ii) NaBH4, MeOH, 0 ° C, 2 t; iii) N-acetyl-L-cystein, NaHCO3 (katt), MeOH /H2O rt, 72 h.; . Iv) L-glutation redusert, NaHCO3 (katt), MeOH /H2O, rt, 3 h
Reagenser og betingelser:. I) H2, Pd /C (10% w /w), THF, rt, 18 h; ii) BBr3, DCM, -78 ° C -rt, 2 t; iii) NaBH4, MeOH, 0 ° C -rt, 2 timer; iv) aq. 15% NaSCH3, THF, rt, 6 timer; v) Na, MeOH, 0 ° C -rt, 4 t; vi) NaBH4, CeCl3.7H2O, MeOH, -78 ° C, 30 min.
Vi har fullt preget strukturer av M5-M12 ved hjelp av sin 1-D og 2-D NMR og masse spektral dataene i vår tidligere studie [12]. Derfor ble strukturene av disse syntetiske forbindelsene bekreftet ved sammenligning av deres
1 H og
13C NMR-spektra med de til autentiske standarder oppnådd fra mus fekale prøver. Strukturer av de gjenværende syntetiske metabolitter (M1, M2, M4, og M13), som tidligere er utledet ved flertrinns massespektrometriteknikker [12], ble ytterligere bekreftet ved deres 1-D, 2-D NMR-spektra-data for den første gang.
M2 viste molekylformelen C
20H
31NO
5S på grunnlag av positive APCI-MS på
m /z
398 [m + H]
+ og dets
1 H og
13C NMR data. Molekylvekten av M2 var 42 masseenheter mindre enn den for N-acetylcystein konjugert [6] -shogaol (M5) [12] som angir M2 var cystein konjugert [6] -shogaol. Dette var i samsvar med det faktum at M2 ble gjort etter [6] -shogaol og L-cystein. Dette ble også støttet av den observasjon av fraværet av en acetylgruppe i
1 H og
13C NMR-spektra av M2. En kobling av en L-cysteinyl delen til [6] -shogaol rest på C-5 ble etablert av HMBC kryss topper mellom H
Cys-β (δ
H 3,18 og 2,84) og C-5 ( δ
C 42,3) (figur 1). Derfor M2 ble bekreftet å være 5-cysteinyl- [6] -shogaol.
M1 hadde molekylformel på C
20 H
33NO
5S på grunnlag av positiv APCI-MS ved
m /z
400 [m + H]
+ og sin
1 H og
13C NMR-data. Molekylvekten av M1 var 2 masseenheter høyere enn den for M2, som samsvarer med det faktum at M1 var en keton-reduserte produkt av M2, og også understøttet av utseendet av oksygenerte methines (to sett av protoner for diastereomerene ved δ
H 3,66 og δ
H 3,90, og δ
C 69,3) i sin
1 H og
13C NMR spektra. Nøkkel HMBC korrelasjon mellom H-3 (δ
H 3,66 og δ
H 3,90) til C-1 (δ
C 32,5) og C-5 (δ
C 43,8), samt H-1 (δ
H 2,68 og 2,58) til C-3 (δ
C 69,3) M1 (figur 1), etablert en hydroksylgruppe i C-3 på alkyl-sidekjeden av M1. HMBC kryss topper mellom H
Cys-β (δ
H 3,15 og 2,85) til C-5 (δ
C 43.8), og H-5 (δ
H 2,94) til C
Cys-β (δ
C 32,8), forutsatt at binding av den cysteinyl del og C-5-stillingen av M1 via en tioeterbinding. Således M1 ble bekreftet å være 5-cysteinyl-M6.
M4 viste molekylformelen C
22 H
35NO
6S på grunnlag av positiv APCI-MS ved
m /z
442 [M + H]
+ og sin
1 H og
13C NMR-data. Molekylvekten av M4 var 2 masseenheter høyere enn den til M5 (5-
N
-acetylcysteinyl- [6] -shogaol), i samsvar med det faktum at M4 var en keton-reduserte produkt av M5. Dette ble også støttet av utseendet av oksygen methines (to sett med protoner for diastereomerene ved δ
H 3,70 og δ
H 3,88, og δ
C 69,3) i sin
1 H og
13C NMR-spektra, forsvinningen av det forventede keton-karbonyl-gruppe i [6] -shogaol, og de sentrale HMBC korrelasjoner observeres på H-3 (δ
H 3,70 og δ
H 3,88) til C-1 ( δ
C 32,5) og C-5 (δ
C 43,8), såvel som H-1 (δ
H 2,67 og 2,58) til C-3 (δ
C 69,3) i sin HMBC-spektrum (figur 1). Den acetyl gruppe ble vist festet til a-NH
2 av cysteinyl delen av HMBC korrelasjon oppdaget på H
Cys-α (δ
H 4,54) til CH
3CO (δ
C 174,0). I tillegg HMBC kryss topper mellom H
Cys-β (δ
H 3,00 og 2,80) og C-5 (δ
C 43,8), forutsatt at koblingen av en acetylcysteinyl del og C-5-stillingen av M4. M4, derav ble bekreftet å være 5-
N
-acetylcysteinyl-M6.
M13, har den molekylære formel C
27H
41N
3O
9S på grunnlag av positiv APCI-MS ved
m /z
584 [m + H]
+ og dens NMR-data ble tatt opp av [6] -shogaol og redusert L-glutation (GSH) .
1H
1 H COSY krysstopper funnet på H
Glu-α /H
Glu-β /H
Glu-γ, i kombinasjon med viktige HMBC korrelasjoner mellom H
Glu-α (δ
H 3,65) for å Glu α-COOH (δ
C 174,0) så vel som H
Glu-γ (δ
H 2,55 og 2,51) for å Glu γ-CON ( δ
C 175,2), anerkjent strukturen i en glutamyl rest (Glu) (figur 1). Strukturen til cysteinyl rest (Cys) ble etablert ved
1H-
1 H COSY kryss topper ved H
Cys-α /H
Cys-β i kombinasjon med HMBC korrelasjon mellom H
Cys-β (to sett av protoner ved δ
H 3,05 til 2,95 og 2,84 til 2,80) til Cys α-CON (δ
C 175,2) (figur 1). Deretter tilkobling av glutamyl residuet med cysteinyl rest ble opprettet mellom Glu γ-COOH og Cys α-NH
2 gjennom en amidbinding, ved HMBC korrelasjoner finnes på H
Cys-α (δ
H 4,50) til Glu γ-CON (δ
C 175,2). Festingen av en glycinyl -gruppe til cysteinyl residuum ble funnet mellom Cys α-COOH og Gly α-NH
2, ved HMBC korrelasjoner observeres på H
Gly-α (δ
H 3,80) til Cys α -CON (δ
C 175,2). Dermed blir GSH residuet ble utvilsomt identifisert som γ-glutamyl-cysteinylglycin. Følgelig kobling av GSH delen til [6] -shogaol resten ble etablert på C-5 gjennom en tioeterbinding av HMBC korrelasjoner funnet på H
Cys-β (to sett av protoner ved δ
H 3.05- 2,95 og 2,84 til 2,80) til C-5 (δ
C 42,2). Derfor M13 ble bekreftet å være 5-glutathiol- [6] -shogaol.
Separasjon av M13 isomerer på preparativ HPLC resulterte i to diastereoisomerer, M13-1 og M13-2, som hadde svært lik
1H og
13C NMR spektra. De største forskjellene var
1 H signalene for H
Cys-βb (δ
H 2,73 i M13-1 vs. 2,81 i M13-2) og H-4a (δ
H 2.76 i M13 -1 vs. 2,70 i M13-2) og
13C signaler for C-4 (δ
C 49,9 i M13-1 vs. 49,6 i M13-2) og C-5 (δ
C 42,0 i M13-1 vs. 42,4 i M13-2) (figur 4). I deres NOESY spektra, vi observerte sammenhengene mellom H
Cys-βb (δ
H 2,73) og H-5 (δ
H 3,10) i M13-1 og H
Cys-βa ( δ
H 2,97) og H-5 (δ
H 3,10) i M13-2, noe som tyder på at H-5 i M13-1 hadde den samme konfigurasjon som den for H
Cys-βb og H- 5 i M13-2 hadde den samme konfigurasjon som den for H
Cys-βa (figur 4). Det er kjent at H
Cys-α i GSH rest har
R
konfigurasjon (figur 4). Koblingen konstant (
J
= 5,0 Hz) H
Cys-βa (δ
H 2,97) med H
Cys-α (δ
H 4,49) er mye mindre enn at (
J
= 8,7 Hz) H
Cys-βb (δ
H 2,81) med H
Cys-α, noe som tyder på at H
Cys-βa (δ
H 2,97) har samme
R
konfigurasjon som for H
Cys-α og H
Cys-βb har
S
konfigurasjon. Derfor konfigurasjoner av H-5 i M13-1 og M13-2 ble forsøksvis tildelt som
S Hotell og
R
henholdsvis (figur 4).
veksthemmende effekt mot kreft hos mennesker og normale celler
To humane kreftcellelinjer, HCT-116 og H-1299, ble behandlet med [6] -shogaol eller syntetiske metabolitter M1, M2 og M4-M13 , med konsentrasjoner i området fra 0 til 80 uM. Celleviabilitet analyser benytter MTT resulterte i åtte aktive metabolitter, M2, M5, M6, M8-M11, og M13, mot tykktarmskreftceller HCT-116, med IC
50 verdier av 24.43, 54.26, 68.77, 58.76, 82.22, 78,16, 83,97 og 45,47 mikrometer, henholdsvis (figur 5), og åtte aktive metabolitter, M2, M5, M6 og M9-M13, i lungekreftceller H-1299, med IC
50 verdier av 25,82, 72,62, 61,28, 82,50, 60,63, 66,50, 69,91, og 47,77 uM, henholdsvis (figur 6). Blant dem, M2, cystein konjugert metabolitt av [6] -shogaol, ble funnet å være mest potente mot både HCT-116 og H-1299-celler med IC
50 verdier på 24,43 og 25,82 uM, henholdsvis, noe som var sammenlignbart til foreldre [6] -shogaol, med en IC
50 av 18.20 mikrometer i HCT-116 celler og en IC
50 av 17,90 mikrometer i H-1299 celler. Den nest mest aktive metabolitten var 5-glutathionyl- [6] -shogaol (M13), med IC
50 verdier av 45.47 og 47.77 mikrometer i HCT-116 og H-1299 celler, henholdsvis. 5-
N
-acetylcysteinyl- [6] -shogaol (M5) også utstilt merkbar bioaktivitet med IC
50 verdier av 54.26 mikrometer i HCT-116 celler og 72,62 mikrometer i H-1299 celler. Denne metabolitten har imidlertid vist redusert aktivitet sammenlignet med den for 5-cysteinyl- [6] -shogaol (M2), noe som tyder på at acetylering på α-NH
2 i den cysteinyl-delen minsker aktiviteten til M2. Videre er reduksjonen av et keton-gruppen i alkyl-sidekjeden resulterte i liten eller ingen aktivitet mot kreftceller HCT-116 og H-1299, som observert fra M1 og M4 versus M2 og M5, samt M6, M9 og M11 versus [6] -shogaol, indikerer den reduktive biotransformasjon av [6] -shogaol og dets metabolitter var først og fremst å inaktivere.
Bar o, ikke signifikant; +, P 0,05; *, P 0,01; **: P 0,0001. Alle statistiske tester er uparet Student t-test, 2-tailed, sammenlignet med DMSO eller den tilsvarende [6] -shogaol konsentrasjon.
For å bestemme om den apoptotiske effekt som observeres i figur 8A og 8B var konstant over tid, vi inkuberes [6] -shogaol, M2 og M13 i HCT-116 celler for bare 6 timer (Figur 8C). Etter 6 timers inkubasjon med [6] -shogaol eller metabolitter M2 eller M13, var vi i stand til å oppdage betydelig høyere nivåer av apoptose for alle 3 forbindelser i forhold til DMSO i HCT-116 celler. Interessant var det ingen signifikant forskjell mellom de apoptotiske virkning av [6] -shogaol og virkningene av M2 ved 20 og 40 uM og M13 ved 40 uM. M13 var signifikant mer potent enn [6] -shogaol ved 20 uM. Eksponering av HCT-116-cellene til M13 isomerer M13-1 og M13-2 viste også et høyere nivå av apoptose, men isomerene «apoptotiske effekt var betydelig dårligere i forhold til [6] -shogaol for begge konsentrasjoner som benyttes. Disse resultater viser at apoptose utløses av [6] -shogaol metabolitter M2, M13, M13-1 og M13-2, og er den mekanismen som er ansvarlig, i det minste delvis, for celledød observert tidligere.
diskusjon
det er nå vel akseptert at naturlige forbindelser gir mulighet til å blande seg inn i tidlige stadier av kreft eller hindre utvikling helt [16]. Men disse forbindelsene har sine begrensninger, for eksempel rask
in vivo
omsetning, begrensede mengder i matvarer, og deres eventuelle giftighet ved høyere doser [17]. Det er bemerkelsesverdig at anti-kreft effekt for disse forbindelsene kan observeres i kohortstudiene til tross for en kort halveringstid og hurtig metabolisme gang inntatt [18]. Ofte kan tilstedeværelsen av den forbindelsen bare vurderes ved kvantifisering av metabolitter, noe som tyder på at disse metabolittene sirkulerer i kroppen i en viss tid og potensielt samhandle med biologiske prosesser [19]. Følgelig, en hypotese som forklarer bioaktiviteten av naturlige forbindelser er at metabolittene selv holde og bære en del av eller alt av den opprinnelige forbindelse s bioaktivitet. Denne studien utforsket denne muligheten med [6] -shogaol, den viktigste komponenten i tørket ingefær, og dets metabolitter.
Vår tidligere studie har vist at [6] -shogaol metaboliseres i stor grad i mus og i kreftceller og mer enn 90% av [6] -shogaol omdannet til dets metabolitter [12]. Vi har også lagt merke til at human normal celle IMR-90 til en viss grad metabolisert [6] -shogaol på en lignende måte til kreftceller (data ikke vist). Som et resultat, kan rask metabolisme av [6] -shogaol tilbyr muligheten for sine stabile metabolitter å bli involvert i biologiske prosesser hvis de eide bioaktivitet. For å verifisere denne hypotese, er det avgjørende å oppnå metabolitter i en stabil form. Isolasjon fra sitt opprinnelige miljø ikke ville være praktisk og mest sannsynlig ville ikke gi de mengder som trengs for eksperimentell biologi. En kjemisk syntese er mye mer ønskelig, reproduserbar, og effektiv. Vi har renset M6-M12 i svært begrensede mengder (0,5 til 17 mg) fra fekale prøver samlet inn fra [6] -shogaol behandlede mus [12]. For å ha tilstrekkelig mengde til å ytterligere studere bioaktiviteten av [6] -shogaol metabolitter, beskriver vi kjemifremgangsmåten tillater syntesen av de store metabolitter av [6] -shogaol i denne studien. Tolv metabolitter av [6] -shogaol (M1, M2 og M4-M13) ble syntetisert med hell av praktiske tilnærminger. Strukturene av syntetiske metabolitter ble verifisert ved anvendelse av 1-D og /eller 2-D NMR-data, samt massespektra.
Vi sammenlignet med veksthemmende virkninger av de syntetiske metabolitter med [6] -shogaol i to human kreftceller og to humane normale celler. Våre resultater viste at to metabolitter, M2 og M13, besatt de mest sammenlignbare veksthemmende effekter [6] -shogaol mot kreftceller. Viktigst, viste M2 en diskriminerende effekt, som det ikke synes å være giftig mot normale celler. Denne effekten ble ikke oppdaget med [6] -shogaol. M13 viste også mindre toksiske effekter mot normale celler i forhold til [6] -shogaol. I tillegg, M5, M6 og M8-M12 hadde også bestemt potens mot vekst av kreftceller, men viste ingen toksisitet overfor normale celler med IC
50-verdier som er større enn 100 um (figurene 5 og 6). Våre resultater viser tydelig at metabolitter av [6] -shogaol forbli bioaktivt mot kreftceller, men er mye mindre toksiske enn [6] -shogaol til normale celler. Dette bekrefter vår hypotese at metabolittene selv holde og bære en del av eller alt av den opprinnelige forbindelse er bioaktivitet.
Apoptose er en mekanisme ofte er ansvarlig for induksjon av celledød i respons på indre eller ytre stress. For å få innsikt i virkningsmekanismen av metabolittene, utførte vi en TUNEL analyse i HCT-116 celler ved hjelp av M2, M6, M13 og sine to isomerer, M13-1 og M13-2 og sammenlignet deres aktiviteter som for [ ,,,0],6] -shogaol. Den viste at både M2 og M13, men ikke M6, er i stand til å indusere apoptose i kreftceller både HCT-116 humane tykktarmkreftceller og H-1299 humane lungekreftceller (figur 8A og 8B). For M13, apoptose-induksjon kunne ikke godt kan tilskrives en isomer eller den andre, noe som tyder på at stereokonfigurasjonen ikke er viktig for bioaktiviteten av denne forbindelsen. Vi har observert at både M2 og M13 kan utløse apoposis i HCT-116 celler på et nivå lik den i [6] -shogaol ved 6 timers tidspunkt (figur 8C). Men etter 24 timers eksponering for metabolittene, andelen av TUNEL-positive celler var stort sett uendret på 20 mikrometer for både M2 og M13 mens effekten av [6] -shogaol var bemerkelsesverdig økt. Den induserende effekt av M2 på apoptose ved en konsentrasjon på 40 uM dramatisk økt ved 24-timers tidspunktet i forhold til den av 6 timers tidspunktet, som var signifikant høyere enn den til M13 ved en 40 uM konsentrasjon. Vi observerte også en konsentrasjonsavhengig effekt av [6] -shogaol og dens metabolitter for kreftcelle apoptose, hvor en økning i konsentrasjon av en forbindelse som resulterte i en tilsvarende økt prosentandel av apoptotiske celler. Til sammen viser disse resultatene tyder på at det er sannsynlig at aktiveringen av andre mekanismer som er involvert i å utløse cancercelledød synes imidlertid apoptose å være en av de viktigste aktiverte trasé for [6] -shogaol metabolitter å indusere kreftcelledød.
Det er alltid en utfordring å separere stereoisomerer. Blant alle de syntetiserte metabolitter, M13 var det bare diastereomerene blanding som vi var i stand til å skille ved hjelp av ikke-kiral preparativ HPLC kolonne. Våre resultater viste at M13 som blandingen av M13-1 og M13-2 hadde litt bedre vekst- hemmende effekter på kreftceller enn de to diastereomerer alene og M13-1 og M13-2 hadde lignende aktivitet, skjønt M13-2 var litt mer potent enn M13-1. Enda viktigere, vi observere M13 som metabolitt av [6] -shogaol i form av en blanding av M13-1 og M13-2 i HCT-116 humane tarmkreftceller (data ikke vist). Det ville være verdt å skille de to diastereomerer av M2, den mest aktive metabolitten av [6] -shogaol, ved anvendelse av en chiral kolonne, og ytterligere å bestemme virkningen av stereokonfigurasjonen på aktiviteten av denne forbindelsen i fremtidige studier. Vi har nylig identifiserte M2 som en metabolitt av [6] -shogoal i mennesker (upubliserte data). Derfor er det viktig å finne ut om M2 eksisterer som en blanding av to diastereomerer i mus og i mennesker.
Konklusjonen er at den foreliggende studien tillatt oss å vise at metabolitter av [6] -shogoal kan gjøre rede for bioaktivitet av moderforbindelsen, og spesielt utløser molekylære reaksjonsveier som er ansvarlige for cancercelledød på en lignende måte. Det tyder på at anti-kreft aktivitet til forbindelser så som [6] -shogoal kan ha blitt delvis fremstilt feil i fortiden. Hva var opprinnelig tenkt å være en effekt av naturlig stoff kan ha vært en direkte følge av rask metabolisme av det sammensatte, som gjør det mindre i stand til å utløse molekylære mekanismer. Imidlertid ville apparition av dets metabolitter i målet vev deretter supplere, opprettholde eller erstatte helt det bioaktive effekten av den opprinnelige forbindelsen. Supplerende
in vivo
studier vil være nødvendig for å få et endelig svar på det spørsmålet, men som nå studien presenteres her åpner nye muligheter for forskning for studiet av bioaktive metabolitter av [6] -shogaol.
Materialer og metoder
Material
[6] -Shogaol ble renset fra ingefær ekstrakt i vårt laboratorium [8].
