Abstract
Muskel sløse som oppstår med kreft kakeksi er forårsaket av en ubalanse i satsene for muskel protein syntese og degradering.
Apc
Min /+
mus er en modell av kolorektal kreft som utvikler kakeksi som er avhengig av sirkulerende IL-6. Men IL-6 regulering av muskelprotein omsetning i initiering og progresjon av kakeksi i
Apc
Min /+
mus er ikke kjent. Kakeksi progresjon ble undersøkt i
Apc
Min /+
mus som enten var vekten stabil (WS) eller hatt innledende (≤5%), middels (6-19%), eller ekstrem (≥20% ) kroppsvekt tap. Initiering av kreftkakeksi reduseres% MPS 19% og en ytterligere -50% med ytterligere vekttap. Muskel IGF-1 mRNA-ekspresjon og mTOR mål ble undertrykt med progresjon av vekttap, mens muskel AMPK fosforylering (Thr 172), AMPK aktivitet, og raptor fosforylering (Ser 792) ble ikke øket med initiering av vekttap, men var indusert som kakeksi kommet. ATP avhengig protein degradering økte i initiering og progresjon av kakeksi. Men ATP uavhengig protein degradering ble ikke økt til kakeksi hadde kommet forbi den innledende fasen. IL-6-reseptor-antistoff administrering forhindret kroppsvekttap og undertrykket muskelproteindegradering, uten noen virkning på muskel% MPS eller IGF-1 assosiert signalering. Oppsummert er det MPS% reduksjon under initiering av kakeksi forbundet med IGF-1 /mTOR signale undertrykkelse, mens muskel AMPK aktivering og aktivering av ATP uavhengig protein degradering forekommer senere i utviklingen av kakeksi. IL-6-reseptor-antistoff behandling blokkert kakeksi progresjon gjennom undertrykkelse av muskelproteindegradering, mens ikke redde undertrykkelse av muskelproteinsyntese. Demping av IL-6 signal var effektiv i å blokkere utviklingen av kakeksi, men ikke tilstrekkelig for å reversere prosessen
relasjon:. Hvitt JP, Baynes JW, Welle SL, Kostek MC, Matešić LE, Sato S, et al. (2011) Forskrift Skeletal Muscle Protein Omsetningen i løpet av progresjon av kreft kakeksi i
Apc
Min /+
Mouse. PLoS ONE 6 (9): e24650. doi: 10,1371 /journal.pone.0024650
Redaktør: Se-Jin Lee, Johns Hopkins University School of Medicine, USA
mottatt: 28 februar 2011; Godkjent: 16 august 2011; Publisert: 19.09.2011
Copyright: © 2011 White et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av stipend 5R01CA121249 fra Nation Institutes of Health (NIH) og National Cancer Institute (NCI) til Dr. Carson. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Skeletal muskelmasse tap er et kjennetegn på kakeksi, og muskelmasse bevaring er avgjørende for overlevelsen av mange kreftpasienter [1]. Ofte kreftpasienter ikke blir diagnostisert før betydelig vekttap har oppstått [2], som begrenser behandlingstilbud i cachectic pasienter [3]. I motsetning pasienter diagnostisert under første trinn av cachexia (mindre enn 5% kroppsvekttap) har en mye bedre overlevelse tid og kjemoterapibehandlingsresultater [5] – [6]. Forstå regulering av muskelsvinn gjennom utviklingen av kakeksi er avgjørende for å utvikle både forebygging og intervensjon strategier for behandling av kakeksi [4]. Dessverre, vi har en begrenset forståelse av muskel protein omsetning regulering under den innledende fasen av kakeksi. Videre er utviklingen av muskelsvinn akselererer i løpet av utviklingen av kakeksi [5]. Denne ikke-lineær prosess skaper hull i vår kunnskap, som er i stor grad basert på regulatoriske endringer i løpet av de senere stadier av kakeksi.
Den cellulære signal som forstyrrer den delikate balansen mellom satsene for muskel protein syntese og nedbrytning er tenkt å være en viktig fundament er nødvendig for en bedre mekanistisk forståelse av muskel sløse med kreft. Mens akselerert muskel protein degradering har erkjent betydning for utviklingen av avmagring, fortsatt usikker regulering av proteolytiske mekanismer gjennom utviklingen av kakeksi. Muscle proteolyse, først og fremst gjennom ubiquitin avhengige mekanismer, er økt i løpet av sent stadium kakeksi [6], mens en enkelt rapport har rapportert ingen forskjell i muskel proteolyse under den innledende fasen av kakeksi i tumorbærende mus [7]. Tilsvarende er usikker rollen av proteinsyntese i løpet av utviklingen av kakeksi. Mens reduksjon i proteinsyntesen er vist i pasienter med sent stadium kakeksi [8], og i tumorbærende mus som har minst en 16% reduksjon i kroppsvekt [7], regulering i løpet av de første stadiene av kakeksi og eventuell overgang til alvorlig vekttap garanterer videre leting.
muskelens evne til å syntetisere protein er mottakelig for mange stimuli, inkludert energistatus, anabole hormoner, katabole hormoner, og lasting [9]. Insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF-1) signalisering gjennom PI3K /Akt /mTOR svei kan integrere tilbakemelding fra en rekke vekstrelaterte stimuli for å regulere størrelsen myofiber [10]. Sirkulerende IGF-1 og IGF-1 muskel-genekspresjon blir vanligvis redusert med sløse betingelser [11] inkluderende kakeksi [12], [13]. I tillegg er muskel mTOR aktivering reduseres også etter at minst et 12% tap av kroppsvekt og avtar ytterligere i sent stadium kakeksi [14], [15]. IGF-1 signalering kan også regulere muskel protein degradering gjennom undertrykkelse av gaffelhodeboks O (FOXO), hvis transkripsjonen mål inkluderer muskel atrogin-1 /MAFbx, Muskel ringfinger-en (MuRF1) og autofagi relaterte gener [16], [ ,,,0],17], [18]. Muskel 5′-adenosinmonofosfat-aktivert protein kinase (AMPK), en sensor for celleenergistatus, regulerer også proteinsyntese [19], [20], [21]. AMPK aktiveres ved lav celleenergi status og også muskelkontraksjon [22]. AMPK kan hemme mTOR signaliserer gjennom flere mekanismer, inkludert fosforylering av raptor på Ser792 [23], noe som hindrer binding og påfølgende fosforylering av p70S6K og 4EBP1. I tillegg har AMPK aktivering vist seg å øke proteindegradering i myotubes, som er forbundet med en økning i FOXO transkripsjonelle mål atrogin1 og MuRF1 [24]. I tumorbærende rotter og mus, har aktiveringen av AMPK i løpet av utviklingen av kakeksi vist å være variabel og dens rolle i reguleringen av muskelsvinn med kakeksi er vanskelig å tolke [25]. Denne studien søker å avklare rollen AMPK i reguleringen av muskel protein omsetning i løpet av kakeksi.
Det er nye bevis for lysosomal /autofagi å spille en rolle i løpet av muskelsvinn sykdom [26], [27]. I likhet med andre metoder for muskel degradering, er autophagy en viktig prosess i skjelettmuskel er nødvendig for å fjerne organeller, dvs. mitokondrier og deler av cytoplasmaet [28]. Sletting av Atg7, en kritisk gen som er involvert i autofagi, resulterer i skjelettmuskulatur atrofi, unormal mitokondrier og manglende organisasjon sarcomeres [29]. I motsetning til de ubiquitin-systemet, er autophagy ikke-spesifikk, ATP-uavhengig prosess, noe som fordøyer deler av cellen i stedet for individuelle proteiner. De molekylære komponentene i Autophagy /lysosomale trasé er godt beskrevet, er imidlertid reguleringen ikke godt kjent. Flere gener har blitt identifisert som autofagi relaterte inkludert, LC3β, Gabarpl1, Atg12l, PI3kIII, Ulk2, Atg4β og Beclin1. Det har vært rapporter som viser autofagi relaterte gener øke i muskel dystrofi [30], diabetes [31], sepsis-indusert sløse [27] og kreftrelatert kakeksi [31], [32].
Pro- inflammatoriske cytokin IL-6 er implisert i reguleringen av muskelsvinn i løpet av kakeksi hos både mennesker og gnagere [33]. Transgene mus som over-uttrykker IL-6 har muskelatrofi forbundet med økt ekspresjon av lysosomale og ubiquitin-relatert mRNA og proteiner [34], [35]. Hos mennesker kan IL-6 administrasjon føre til en reduksjon i skjelettmuskelproteinsyntesen [36]. På grunn av den katabolske effekter som kan bli formidlet gjennom IL-6 under kakeksi, har flere behandlinger blitt foreslått for å hemme IL-6-aktivitet for å forhindre utviklingen av kakeksi. Administreringen av en IL-6-reseptor-antistoff er effektivt imøtegått muskelsvinn i tumorbærende mus [36], [37]. Videre kan inhibering av IL-6-aktivitet reduserer både ubiquitin og lysosomal nedbrytningsbaner i gastrocnemius muskel av C-26 tumorbærende mus [37]. Disse data tyder på at IL-6-inhibering kan redusere muskelproteindegradering; har imidlertid virkning på muskelproteinsyntese ikke blitt utforsket. Videre arbeid er nødvendig for å belyse den tilhørende mellom IL-6 signal og muskelproteinsyntese i løpet av utviklingen av kakeksi. Vi har tidligere rapportert muskelsvinn i
Apc
Min /+
musen til å være avhengig av sirkulerende pro-inflammatoriske cytokin IL-6 [38], [39]. Men regulering av protein omsetning i initiering og progresjon til mer alvorlige tap er ikke godt undersøkt i løpet av kakeksi. Hensikten med denne studien var å fastslå IL-6 regulering av muskelprotein omsetning under initiering av og progresjon mot mer alvorlig kakeksi i
Apc
Min /+
mus. Vi har målt direkte muskelproteinsyntese, muskelproteindegradering, og tilhørende signalisering i løpet av forskjellige stadier av vekttap. Vi har også undersøkt om IL-6-reseptor-signalisering var viktig for regulering av disse prosessene ved utviklingen av kakeksi. Relatert til prosesser initierende kakeksi, hypotese vi at proteinsyntesen skulle bare redusert i løpet av sene stadier av kakeksi, mens ATP avhengig protein degradering vil være hovedansvarlig for initiering av muskel tap. Etter initiering av kakeksi, hypotese vi at suppresjon av IL-6 signal ville redde muskelmasse gjennom induksjon av muskelproteinsyntese og undertrykkelse av ATP-avhengig protein degradering.
Måter
Dyr
The University of South Carolina Institutional Animal Care og bruk komité godkjente alle dyreforsøk i denne studien.
Apc
Min /+
mus på en C57Bl /6 bakgrunn ble opprinnelig kjøpt fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og avlet ved University of South Carolina Animal Resource Facility som tidligere beskrevet [40]. Mann
APC
Min /+ plakater (n = 21) mus mellom 14 og 20 ukers alder ble gruppe plassert og avlivet ved tidene som ga lagdeling av kroppsvekttap for å tillate studiet av utviklingen av kakeksi . De 4 grupper anvendt i denne studien var stabil vekt (WS; n = 5), første (≤5%, n = 6), intermediat (6-19%, n = 4), og ekstrem (≥20%; n = 6) grad av vekttap, i forhold til toppkroppsvekt. For å blokkere utviklingen av kakeksi, et separat sett av
APC
Min /+
mus ble behandlet med en IL-6-reseptor-antistoff (n = 5) eller PBS kontroll (n = 7) i to uker , som starter på etter utbruddet av cachexia (16 uker). Villtype C57Bl /6-kontroller ble også behandlet med IL-6-reseptor-antistoff (n = 6) eller PBS-kontroll (n = 6) ved 16 uker. Rommet ble opprettholdt på en 12:12 light:dark syklus med lys periode som starter på 0700. Mus ble gitt standard gnager chow (Harlan Teklad Rodent Diet, # 8604, Madison, WI) og vann
ad libitum
.
Muscle Collection
Mus ble gitt en subkutan injeksjon med ketamin /xylazin /acepromazine cocktail (1,4 ml /kg kroppsvekt) før gastrocnemius ble dissekert. Tibia lengde ble målt som en indikator på dyrekroppsstørrelse og en korreksjonsfaktor for skjelettmuskel vekter. Tretti minutter før avlivning, ble alle musene gitt en intraperitoneal injeksjon av 150 mM
2 H
5-fenylalanin (Cambridge Isotope Laboratories) i en 75 mM NaCl-oppløsning i en dose på 2 ml /100 g kroppsvekt [41 ]. Ved ofring ble gastrocnemius musklene skylt i PBS, hurtigfrosset i flytende nitrogen, veiet og lagret ved -80 ° C inntil videre analyse.
tarmvevet Collection
tarmvevet samlingen ble utført slik det er beskrevet tidligere med en liten endring [39], [42], [43], [44]. I korthet, tynntarmen ble forsiktig skåret ved den distale ende av magen og ved den proksimale enden av cecum. Tykktarmen ble fjernet fra den distale ende av cecum til anus. Mesenterium fettvev ble fjernet med pinsett og tynntarmen ble kuttet opp i fire like store deler. Alle tarmavsnitt ble spylt med PBS, åpnet på langs med en saks, og flatet med en bomullspinne mellom to stykker av trekkpapir. Tarmavsnitt ble fiksert i 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS over natten og overført til PBS for lagring ved 4 ° C for videre analyse.
Polyp Teller
Polyp tellinger ble utført som tidligere beskrevet [ ,,,0],39], [42], [43], [44]. I korthet, 4% PFA-faste tarmavsnitt fra alle dyr ble kort farget i 0,1% metylenblått, og de ble plassert under et disseksjonsmikroskop. Polypper ble talt ved den samme utprøver på en blind måte. Polypper ble kategorisert som store ( 2 mm i diameter), middels (1~2 mm) eller liten ( 1 mm).
IL-6 reseptor antistoff Administration
MR16 -1 IL-6 reseptor antistoff var en generøs gave fra Chugai Pharmaceutical CO., LTD, Tokyo, Japan. Antistoffet ble administrert ved en dose på 300 ug /mus i fosfatbufret saltvann ved intraperitoneal injeksjon hver tredje dag i to uker som starter ved 16 ukers alder. PBS ble injisert som en kontroll kjøretøy.
myofibrillar protein syntese
gastrocnemius muskelprøver ble homogenisert i 1 ml vann. Myofibriller og andre uoppløselige proteiner ble pelletert ved sentrifugering, og supernatantene inneholdende frie aminosyrer ble brukt for å bestemme forholdet mellom fri
2 H
5-fenylalanin (m /z 239-fragment) for å endogene (umerket) fenylalanin (m /z 234 fragment). Forholdene ble bestemt ved GC-massespektrometrisk analyse av
t
butyldimetylsilyl derivater av disse aminosyrene. Myofibrillære proteiner ble vasket, hydrolysert, og analysert med hensyn på
2 H
5-fenylalanin-anrikning ved å overvåke m /z 237 og 239 fragmenter, som beskrevet i detalj av Welle et al. [41].
Den fraksjon frekvensen av myofibrillære syntese,% per dag, ble beregnet som% anrikning av tracer i hydrolysatet av myofibrillære proteiner, dividert med tracer anrikning i det frie aminosyrelageret i muskelvev . Myofibrillære protein anrikning ble bestemt fra m /z 237 og m /z 239 ioner fordi den letteste isotopomer (m /z 234) mettet MS-detektoren. Den myofibrillar /gratis berikelse forholdet ble multiplisert med 48 for å få% /dag verdier fordi tracer inkorporering skjedde over en periode på 30 min.
protein degradering
For å analysere nedbrytningen av løselig muskelprotein, en modifisert proteasomal proteolyse assay beskrevet av Hu et al [45] ble bli brukt. Gastrocnemius muskelen ble fjernet og frosset i flytende nitrogen. Muskelekstrakter (~40 MGS) ble homogenisert i iskald avling buffer (5 mM Tris-HCl (pH 8,8), 1% glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, fersk utgjorde 1 mm β-Me, og 50 mm EP -475). Homogenatene ble sentrifugert ved 30.000 x
g
i 30 minutter, og deretter de løselige fraksjoner ble anvendt for å måle proteinnedbrytingen. For proteinet degradering bestemmelse, ble muskelekstrakter dialysert mot en basal buffer [20 mmTris-HCl (pH 7,6) 10% glyserol, 2 mM ditiotreitol (DTT), 10 mM magnesiumacetat, og 20 mm kaliumklorid] for å fjerne oppsamlet tyrosin. Alikvoter av ekstraktene ble inkubert i 2 timer ved 37 C med eller uten en ATP-genereringssystem (1 mm ATP, 100 ug /ml kreatin kinase, og 10 mm fosfokreatin); ubiquitin (250 ug /ml) ble også tilsatt. Reaksjonen ble stanset med trikloreddiksyre, ble utfelte proteiner ble fjernet ved sentrifugering, og frie tyrosin ble målt fluorometrisk (450 nm eksitasjon /550 nm emisjon) for å beregne hastigheten av proteinnedbrytingen [46].
AMPK aktivitet
AMPK aktivitet ble bestemt ved hjelp av et kit fra Linco (St. Louis, MO). I korte trekk, ble hele muskel homogenater tilsatt til en 96-brønners plate belagt med AMPK substrat IRS-1, inkubert i 2 timer, fulgt av tilsetning av et sekundært antistoff, konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) og spesifikk for fosforylert Ser 794 i IRS -1. Til slutt, ble belyst middel tilsatt til platen for å kvantifisere fosfor-IRS-1 og bestemme AMPK aktivitet.
RNA-isolering, cDNA-syntese, og Real Time PCR
RNA-isolering, cDNA-syntese, og real-time PCR ble utført som tidligere beskrevet [47], ved anvendelse av reagenser fra Applied Biosystems (Foster City, CA). Fluorescens merkede prober for IGF-1, skjelett alfa aktin, C2 proteasomal subunt, C7 proteasomal subenhet, atrogin1, murf1 (FAM fargestoff), og de ribosomale RNA-18s (VIC fargestoff) ble innkjøpt fra Applied Biosystems og kvantifisert med TaqMan Universal Mastermix. Data ble analysert ved ABI programvare ved hjelp syklusen terskel (C
T), som er syklusen nummeret som fluorescensemisjonen er midt mellom deteksjon og metning av reaksjonen.
Western Blotting
Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [48]. I korthet ble frosset gastrocnemius muskel homogenisert i Mueller-buffer, og proteinkonsentrasjonen bestemt ved hjelp av Bradford-metoden [49]. Urene muskel homogenat 40 ug ble fraksjonert på 6% -15% SDS-polyakrylamidgeler. Geler ble overført til PVDF membraner over natten. Membraner ble farget med Ponceau rødt for å bekrefte lik belastning på hver gel. Membranene ble blokkert over natten i 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann med 0,1% Tween-20 (TBS-T). Primære antistoffer for p-Akt (Ser473), Akt, p-4EBP1 (Ser65), 4EBP1, p-mTOR (Ser2448), mTOR, p-S6K (Thr389), S6K, p-AMPK (Thr172), AMPK, p- Stat3 (Tyr705), Stat3, p-Raptor (Ser792), Raptor, Beclin-en, Atg7, LC3β, Ubiquitin, atrogin1 (Cell signalering) og SOCS3 (Santa Cruz) ble fortynnet 1:1000 å 1:500 i 5% melk i TBS-T, fulgt av en times inkubasjon med membraner ved romtemperatur. Anti-kanin-IgG-pepperrot-peroksidase konjugert sekundært antistoff (Cell Signaling) ble inkubert med membranene ved 1:2000 fortynninger i 1 time i 5% melk i TBS-T. Forbedret chemiluminescence (ECL) (GE Healthcare og biovitenskap, Piscataway, NJ) ble brukt til å visualisere antistoff-antigen interaksjoner. Bilder ble digitalt skannet og blotter ble kvantifisert ved densitometri med vitenskapelig bildebehandling (Scion Bilde, Frederick, MD).
Statistical Analysis
En enveis ANOVA ble benyttet for å bestemme forskjeller i
apc
Min /+
mus med varierende grad av kroppen veie tap. En to-veis ANOVA ble brukt til å bestemme forskjeller mellom genotypen og IL-6-reseptor-antistoff-behandling. Post-hoc analyser ble utført med Student-Newman-Keuls metoder. En pre-planlagt t-test ble brukt for å sammenligne villtype mus med vekt stabil
Apc
Min /+
i tabell 1. Betydning ble satt til p. 0,05
Resultater
Kroppsvekt vekt~~POS=HEADCOMP, fettmasse og inflammatorisk tilstand under utviklingen av kakeksi i
Apc
Min /+
mus
mus ble ofret mellom 14-20 ukers alder, som er aldersspredningen for kakeksi utvikling i
Apc
Min /+
mus, og kategorisert i henhold til prosent vekttap på tidspunktet for offer i forhold til deres topp kroppsvekt. Gruppene ble utpekt som vekten stabil (ingen vekttap), ≤5% vekttap (initial), 6-19% vekttap (middels) og ≥20% tap (ekstrem). Vekt stabil
Apc
Min /+
mus, (14 uker gamle), hadde kroppsvekt lik alderen-matchet villtype mus (tabell 1). Under oppstart av kakeksi, sirkulerende IL-6 (
P
= 0,02, tabell 1) og miltvekt (
P
0,001) ble økt noe i forhold til vekten stabil
apc
Min /+
mus, og økte ytterligere med progresjonen til middels kroppsvekt tap (
P
0,001; Tabell 1). Det var ingen ytterligere endring i sirkulerende IL-6 eller miltvekt i løpet av progresjon fra middels til ekstreme vekttap. Epididymal fettmasse ble redusert med 63% (
P
0,001; Tabell 1) under initiering av kakeksi og fortsatte å avta med progresjon av kakeksi (
P
0,001; Table 1). Tibia lengde, en indeks for generell kroppsstørrelse, var ikke forskjellig mellom noen grupper (tabell 1) indikerer at normal beinvekst ble oppstår under utviklingen av kakeksi.
myofibrillar proteinsyntesen reduseres under initiering av kakeksi
Under oppstart av kakeksi,
Apc
Min /+
mus gastrocnemius muskelmasse ble redusert med 17% (
P
= 0,001; Tabell 1), og som kakeksi kommet muskelmasse fortsatte å synke (
P
0,001; figur 1A). Under oppstart av kakeksi var det en tilsvarende 19% reduksjon i frekvensen av myofibrillar proteinsyntese (
P
= 0,001; figur 1A), som fortsatte å synke ytterligere med mellom vekttap (
P
0,001). I motsetning til muskelmasse tap, var det ingen ytterligere reduksjon i frekvensen av myofibrillar protein syntese mellom
Apc
Min /+
mus stiller middels eller ekstrem vekttap. Gastrocnemius muskelmasse ble korrelert (
P
= 0,003; figur 1B) med myofibrillar proteinsyntese hastighet i alle grupper av
Apc
Min /+
mus. Muskelmasse og proteinsyntese før kakeksi utvikling var lik mellom villtype og vekt stabil
Apc
Min /+
mus (Figur S1 A og B).
Protein syntese og IGF- 1 uttrykk ble målt i
Apc
Min /+
mus under utviklingen av kakeksi. A) myofibrillære proteinsyntesen. B) Korrelasjon mellom muskelvekt og proteinsyntese. C)
Øvre
: representant western blot av fosforylerte og totale former for Akt (Ser 473), mTOR (Ser2448), p70S6k (Thr389) og 4EBP-en (Thr37 /46).
Nedre
: Forholdet mellom fosforylert og total Akt, mTOR, p70 og 4EBP1 i gastrocnemius muskelen normalisert til WS gruppen. D) IGF-1-ekspresjon og e) korrelasjon mellom IGF-1 gen-ekspresjon og proteinsyntese. F) Skeletal alpha aktin mRNA uttrykk. Verdier er gjennomsnitt ± SE. Signifikans ble satt til p 0,05. † Betyr forskjellig fra WS mus. Betyr forskjellen fra mus med ≤5% kroppsvekt tap. $ Betyr forskjell fra mus med 6-19% vekttap. WS, vekt stabil.
For å vurdere endringer i cellesignale involvert i reguleringen av proteinsyntesen, målte vi IGF-1 /Akt /mTOR sti aktivering under initiering og progresjon av kakeksi. Akt fosforylering (Ser 473), vanligvis forbundet med å fremme muskel anabolisme, var uendret ved oppstart av kakeksi. Med overgangen til middels og ekstreme vekttap fant vi muskel Akt fosforylering økes ca 2 ganger (
P
0,001; figur 1C). Under igangsettingen av kakeksi, var det en trend for mTOR-fosforylering på Ser rest 2448 for å redusere (
P
= 0,06; figur 1C), mens fosforylering av mTOR mål, p70 (Thr389) og 4EBP1 (Ser65), ble redusert 20% (
P
= 0,001; figur 1C) og 55% (
P
0,001) under innledende stadier av kakeksi, henholdsvis. Med overgangen til mellom vekttap, ble det mTOR (-50%), og p70 (-37%) fosforylering ytterligere redusert (
P
0,001; figur 1C). Med ekstrem kroppsvekt tap bare p70 fosforylering hadde en ytterligere nedgang (figur 1C)
Muscle IGF-1 mRNA uttrykk redusert med 28% (
P
= 0,001; figur 1D). Under initiering av kakeksi. Selv om IGF-1 mRNA-ekspresjon ble ytterligere redusert med mellomliggende vekttap (figur 1D), var det ingen videre reduksjon i muskel IGF-1-ekspresjon med ekstremt vekttap. Muskel IGF-1 uttrykk og frekvensen av myofibrillar proteinsyntesen var korrelert på tvers av alle vekttap grupper (
P
= 0,03; Figur 1E). Muskel IGF-1 uttrykk i vekt stabil
Apc
Min /+ Hotell og villtype mus var lik (Figur S1C). Til tross for reduksjonen i myofibrillar protein syntese, fant vi ingen effekt av kakeksi på skjelett alpha aktin mRNA uttrykk (figur 1F) antyder at reduksjonen i myofibrillar proteinsyntesen var ikke på grunn av en reduksjon i mRNA tilgjengelighet.
Muscle AMPK fosforylering induseres under ekstrem kroppsvekt
Muscle AMPK fosforylering (Thr 172) og aktiviteten ble ikke endret under oppstart av kakeksi (2A og 2B). Som kakeksi utviklet seg, ble begge AMPK fosforylering og aktivitet økte med mellom vekttap, og ytterligere økt med ekstreme vekttap (figur 2A og 2B). AMPK aktivitet og fosforylering status var lik mellom villtype og
Apc
Min /+
før utviklingen av kakeksi (figur S2A og B). AMPK kan hemme mTOR-aktivitet gjennom flere mekanismer, et vesen fosforylering av raptor på Ser792. Endringer i raptor fosforylering sammenfalt med AMPK fosforylering under utviklingen av kakeksi. Raptor fosforylering ble ikke økt under initiering av kakeksi, men økte med mellom vekttap og ble ytterligere økt med ekstreme vekttap (figur 2C).
AMPK aktivering ble målt i
Apc
Min /+
mus i løpet av utviklingen av kakeksi. A) AMPK aktivitet i gastrocnemius muskelen normalisert til WS mus. B)
Øvre
: representant western blot av fosforylert AMPK (Thr172) og total AMPK i gastrocnemius.
Nedre
: Forholdet mellom fosforylert til total former for AMPK i gastrocnemius muskelen. C)
Øvre
: representant western blot av fosforylert raptor (Ser792) og total raptor i gastrocnemius.
Nedre
: Forholdet mellom fosforylert til total former raptor i gastrocnemius muskelen. Verdier er gjennomsnitt ± SE. Signifikans ble satt til p 0,05. † Betyr forskjellig fra WS mus. Betyr forskjellen fra mus med ≤5% kroppsvekt tap. $ Betyr forskjell fra mus med 6-19% vekttap. WS, vekt stabil.
Muscle protein degradering er regulert av både ATP-avhengige og uavhengige prosesser
Totalt protein degradering, bestemmes av tyrosin utgivelsen analysen var ikke forskjellig mellom villtype og vekt stabil
Apc
Min /+
mus (Figur S3). Imidlertid ble total nedbrytning økt med 45% (
P
= 0,001; figur 3A) i mus med innledende vekttap mens degradering ble økt 134% og 188% i løpet av middels og ekstrem kroppsvekt tap hhv. Den innledende økning i proteinnedbrytning var på grunn av ATP avhengig nedbrytning. Under ekstreme kakeksi, var det en økning i både ATP avhengig og uavhengig degradering. I motsetning til ATP avhengig nedbrytning, fort ATP uavhengig degradering til å øke med mer alvorlig vekttap (figur 3A). Totalt protein degradering sterkt korrelert med gastrocnemius masse innen alle grupper av vekttap (
P
0,001; figur 3B). I tillegg ble protein degradering signifikant korrelert til prosent av kroppsvekten tap i
Apc
Min /+
mus (
P
0,001; figur 3C). For ytterligere å undersøke rollen til ATP uavhengige og avhengige proteolytiske trasé, vi målte komponenter av ubiquitin avhengige proteasomal pathway. Under oppstart av kakeksi, økt muskelprotein ubiquitinering 56% (
P
= 0,001; figur 3D) og ytterligere økt (
P
0,001) med større vekttap. C7 og C2 proteasomal subenhet ekspresjon økte med 94% (
P
= 0,001) og 81% (
P
= 0,008, figur 3E) henholdsvis ved oppstart av kakeksi og ytterligere øket med progresjon til ekstrem kakeksi. Det var ingen forskjell i ubiquitinering, C7 eller C2 uttrykk mellom
Apc
Min /+
mus med middels og ekstreme vekttap.
Protein degradering ble målt i
Apc
Min /+
mus med progressive vekttap. A) Protein degradering bestemmes av tyrosin utgivelsen analysen. Hvite linjer representerer ATP avhengig nedbrytnings; Svarte striper representerer ATP uavhengig degradering. B) Sammenheng mellom protein degradering og gastrocnemius vekt. C) Sammenheng mellom proteindegradering og prosentandelen av vekttap. D)
Øvre
representant western blot av ubiquitinmolekyler i gastrocnemius muskelen.
Nedre
Kvantifisering av ubiquitinmolekyler normalisert til vekt stabile
APC
Min /+
mus. E) Gene uttrykk for C7 og C2 proteasomal subenheter. F).
Øvre
: representant western blot av fosforylerte og totale former for Foxo3.
Nedre
: Forholdet mellom fosforylert og total Foxo3. G) Gene uttrykk for atrogin1 og MuRF1. H) Representant western blot av atrogin1 protein. Verdier er gjennomsnitt ± SE. Signifikans ble satt til p 0,05. † Betyr forskjellig fra WS grupper. Betyr forskjellen fra mus med ≤5% kroppsvekt tap. WS, vekt stabil.
Akt signal kan også regulere muskel nedbrytning vei gjennom fosforylering og påfølgende hemming av transkripsjonsfaktoren Foxo3 på Ser 253. Under oppstart av kakeksi, ble Foxo3 fosforylering redusert med 39% (
P
= 0,001; figur 3F), og ytterligere redusert ved overgangen til mellom vekttap, men ikke ytterligere redusert med ekstreme vekttap (figur 3F). Atrogin-en og MuRF1 mRNA uttrykk, Foxo regulert muskel E3 ligaser, demonstrerte ulike uttrykk mønstre under utviklingen av kakeksi. Atrogin1 mRNA økt 79% (
P
= 0.01, Figur 3G) under initiering av kakeksi, og ble ytterligere indusert med middels og ekstreme vekttap. MuRF1 mRNA uttrykk ble ikke økt ved oppstart av kakeksi eller overgang til mellom vekttap. Men
Apc
Min /+
mus med ekstreme vekttap viste en 92% (
P
= 0,02, figur 3G) økning i MuRF1 uttrykk. Atrogin1 protein uttrykk ble økt med 79% (
P
= 0,004; figur 3H) under innledende vekttap.
