Abstract
I prekliniske studier var proteasominhibitor ixazomib hemmer cellevekst i et bredt panel av solide tumorcellelinjer
in vitro
. I kontrast, antitumor aktivitet i xenografttumorer er modellavhengig, med noen solide svulster viser ingen respons på ixazomib. I denne studien undersøkte vi faktorer ansvarlig for ixazomib følsomhet eller resistens ved hjelp av musen xenograft modeller. En undersøkelse av 14 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og 6 kolon xenotransplantater viste en påfallende sammenheng mellom ixazomib aktivitet og
KRAS
genotype; svulster med villtype (WT)
KRAS
var mer følsomme for ixazomib enn svulster husing
KRAS
aktiverende mutasjoner. For å bekrefte sammenhengen mellom
KRAS
genotype og ixazomib følsomhet, brukte vi SW48 isogen tykktarm kreft cellelinjer. Enten KRAS-G13D eller KRAS-G12V mutasjoner ble introdusert i KRAS-WT SW48 celler til å generere celler som stabilt uttrykker aktivert KRAS. SW48 KRAS WT svulster, men verken SW48-KRAS-G13D svulster eller SW48-KRAS-G12V svulster, var følsomme for ixazomib
in vivo
. Siden aktivert KRAS er kjent for å være assosiert med metabolsk omprogrammering, sammenlignet vi metabolitt profilering av SW48-WT og SW48-KRAS-G13D svulster behandlet med eller uten ixazomib. Før behandling var det betydelige metabolske forskjeller mellom SW48 WT og SW48-KRAS-G13D svulster, noe som reflekterer høyere oksidativt stress og glukose utnyttelse i KRAS-G13D svulster. Ixazomib behandling resulterte i betydelig metabolsk regulering, og noen av disse endringene var spesifikke for KRAS WT svulster. Nedbryting av frie aminosyre bassenger og aktivering av GCN2-eIF2α-trasé ble observert både i tumortyper. Imidlertid ble det observert endringer i lipid beta oksidasjon i bare KRAS WT svulster. De ikke-kliniske data som presenteres her viser en sammenheng mellom
KRAS
genotype og ixazomib følsomhet i NSCLC og tykktarm xenografter og gi nye bevis for regulering av viktige metabolske veier ved proteasomhemmingen
Citation. Chattopadhyay N, Berger AJ, Koenig E, Bannerman B, Garnsey J, Bernard H, et al. (2015) KRAS Genotype korrelerer med proteasominhibitor Ixazomib aktivitet i Preklinisk
In vivo
modeller av Colon og ikke-småcellet lungekreft: potensielle rolle Tumor Metabolism. PLoS ONE 10 (12): e0144825. doi: 10,1371 /journal.pone.0144825
Redaktør: Mariola J. Edelmann, University of Florida, USA
mottatt: 23 juli 2015; Godkjent: 23 november 2015; Publisert: 28.12.2015
Copyright: © 2015 Chattopadhyay et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Takeda Pharmaceuticals International Co Videre Takeda Pharmaceuticals gitt støtte i form av lønn for forfattere (NC, AJB, EK, BB, JG, HB, PH, AML, YY, JD, KJ, ST, BS, CX, GK, MM, og BA). Metabolon Inc. gitt støtte i form av lønn for forfatteren NR, men ikke har noen ekstra rolle i beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Denne studien ble finansiert av Takeda Pharmaceuticals International Co . Forfattere NC, AJB, EK, BB, JG, HB, er PH, AML, YY, JD, KJ, ST, BS, CX, GK, MM, og BA ansatt ved Takeda Pharmaceuticals. NR er ansatt Metabolon Inc. Patent informasjon: En patentsøknad på deler av dette arbeidet har blitt arkivert (WO2013071142 A1) under tittelen «Biomarkører av respons på proteasomhemmere» av Millennium Pharmaceuticals Inc., et heleid datterselskap av Takeda Pharmaceutical Company Begrenset. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
ubiquitin proteasome Systemet behandler de fleste cellulære proteiner, inkludert proteiner involvert i vekst, cellesyklusregulering og apoptose [1,2,3]. VELCADE (bortezomib) er den første i sin klasse proteasominhibitor (PI), godkjent for behandling av pasienter med myelomatose (MM) [4] og mantelcellelymfom [1,5,6]. Ixazomib er en eksperimentell oral PI, nå i fase III kliniske studier hos pasienter med MM og lett kjede amyloidose. Proteasehemmere har vist et bredt spekter av virkninger på MM-celler og deres mikromiljøet i benmargen. Dette gjelder virkning på cellesyklus, NF-kB-inhibering, og apoptotiske regulatorer, så vel som induksjon av den integrerte spenning respons, inhibering av IL-6-produksjon og signalering, og mange andre [7,8]. Som sterkt sekretoriske antistoffproduserende celler, MM-celler har en forhøyet behov for protein kvalitetskontroll og kan ha en større avhengighet av proteasom-funksjonen for overlevelse sammenlignet med andre celletyper [9].
Selv om PI er blitt testet i ulike solid tumor kliniske studier, er ingen PI dag godkjent for behandling av solide svulster. Preklinisk aktivitet ixazomib og andre proteasehemmere har blitt demonstrert i et begrenset antall solide tumor xenograft modeller [10,11,12], men preklinisk identifikasjon av genetiske og fenotypiske determinanter av solid tumor følsomhet overfor PI har manglet.
i denne studien rapporterer vi en slående korrelasjon mellom
KRAS
genotype og ixazomib følsomhet i et panel bestående av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og tykktarms xenograft modeller. Ixazomib viste signifikant bedre antitumor aktivitet i villtype (WT) KRAS xenografter enn i xenografter med aktivering av KRAS-mutasjoner. Spesielt denne foreningen ble ikke observert
in vitro
. Omtrent 25-30% av humane tumorer er estimert til båtplass aktive RAS-mutasjoner [13]. Av de tre RAS isoformene (KRAS, NRAS og HRAS),
KRAS
er oftest mutert i kreftformer.
KRAS
mutasjon er spesielt dominerende i tykktarmen (40-45%), NSCLC (16-40%) og bukspyttkjertel ductal carcinoma (69-95%) [14]. Ras proteiner er GTPases som regulerer en rekke cellulære prosesser som proliferasjon, overlevelse, vekst, migrasjon, differensiering og metabolisme. Mutasjoner i
KRAS
onkogen er kjent for å modulere en rekke store metabolske veier, inkludert glykolyse, trikarboksylsyre (TCA) syklus, pentosefosfateveien pathway (PPP), membran biogenesis samt glukose transport [15,16 , 17]. Å karakter mekanismen av KRAS-forbundet
in vivo
motstand mot ixazomib, vi sammenlignet den metabolske profilen ved baseline og etter ixazomib behandling i isogen KRAS WT og mutante SW48 xenografter. Vi identifiserte flere viktige metabolske veier som er ulikt påvirket av KRAS-status, ixazomib behandling, eller begge deler. Dataene tyder på at disse metabolske pathways kan spille en rolle i å bestemme sensitiviteten til proteasominhibitor i solide tumorer.
metoder og materialer
Cellelinjer og reagenser
SW48 og SW48- KRAS-G13D og SW48-KRAS-G12V celler ble oppnådd fra Horizon Discovery Ltd. Cambridge, UK og opprettholdt i McCoys 5A media supplert med 10% serum.
8 andre cellelinjene som ble brukt som xenotransplantater ble oppnådd fra ATCC , Manassas, VA.
for
in vitro
bruk, ble ixazomib formulert i DMSO og fortynnet i media til ønsket konsentrasjon.
antistoffer
Kanin-antistoffer mot humant GLUT1, GLUT 4, ble GCN2, pGCN2 (T899) og eIF2α hentet fra Abcam, Cambridge, MA. FASN, PACC (S79), ACC, CPT-1-antistoffer ble erholdt fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA og muse-antistoff mot human peIF2α (S52) ble oppnådd fra Invitrogen, Grand Island, NY. Alle antistoffer ble brukt på. 1: 1000 fortynning
In vivo studier i xenograft bærende mus
Alle dyreforsøk og veterinær omsorg som ble utført ved Takeda Boston, ble gjennomført under en godkjent Takeda Boston Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) protokoll i en forening for Vurdering og akkreditering av Forsøksdyr Care International (AAALAC) akkreditert anlegget. Immunkompromitterte mus ble plassert i et kontrollert miljø, og fikk mat og vann ad libitum. Detaljene i xenograft modeller, inkludert indikasjon antall celler implantert og vertsstammen er spesifisert i S1 tabell.
Dyrestudier som ble utført på Oncotest ble GmBH gjennomført i henhold til retningslinjene for tyske dyrevernloven (Tierschutzgesetz ).
for cellelinje xenotransplantater, et definert antall celler (med eller uten Matrigel, BD Biosciences, Bedford, MA) ble inokulert subkutant inn i høyre flanke av musene og tumorvekst ble overvåket med kalibermåling. Når gjennomsnittlig tumor nådd et visst volum (mellom 120-250mm
3, avhengig av modellen), ble dyrene randomisert i forskjellige behandlingsgrupper på 8-10 dyr pr gruppe. Primære humane tumor xenograft modeller merket med PHTX ble utviklet ved Takeda. Pasientprøver ble tatt fra enten National Disease Forskning Interchange, Philadelphia, PA eller samarbeidende menneskelig vev Network, NCI. Kirurgisk fjernet pasientprøver ble subkutant implantert i mus og passert flere ganger (ikke mer enn 10) før bruk i effektstudier. Primære svulster kommenterte med LX ble utviklet og testet ved Oncotest GmbH, Tyskland.
Ixazomib for
in vivo
bruk ble formulert i 10% HP-β-CD (hydroksypropylcellulose beta cyklodekstrin) og dosert på sin maksimalt tolererte dose (MTD) for den angitte musestamme og modell (mellom 11 til 14 mg /kg, IV, BIW i 3-4 uker).
Antitumoraktivitet aktivitet~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved å beregne behandling over kontroll (T /C) tumorvolum-forhold ved slutten av studien.
enten ved slutten av hver studie, fra hvis alle dyr nådd en human endepunkt, ble dyrene avlivet med CO
2, fulgt av cervikal forvridning eller en annen sekundær fremgangsmåte for eutanasi godkjent av IACUC protokollen.
Celleviabilitet assay
Celler ble dyrket i sine respektive vekstmedium, supplert med 10% føtalt bovint serum og sådd ut på 384-brønners poly D-lysin (PDL) -belagt svart, klare bunn plater (BD BioCoat
™) og inkubert 24 timer ved 37 ° C, 6% CO
2. Cellene ble deretter behandlet med ixazomib i forskjellige konsentrasjoner i 72 timer. Levedyktighet ble vurdert med CellTiter-Glo
® Cell levedyktighet reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Promega, Madison, WI).
2D Colony formasjon analysen
5000 celler per brønn av vill type eller KRAS muterte (G12V eller G13D) SW48 linjer ble sådd i 12-brønners plater (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) og inkubert over natten. Celle ble deretter behandlet med 0-500 nM av ixazomib i 11 dager og fiksert i 4% PFA før farging med 0,5% krystallfiolett i 25% metanol. Område av koloniene ble målt ved anvendelse Metamorph programvare og IC
50 ble bestemt ved å beregne den konsentrasjon ved hvilken den prosentvise gjennomsnitts kolonien område nådde 50% i forhold til bærerkontroll.
3D-kolonidannelse assay for 20 primær pasienten avledet NSCLC-tumorer ble beskrevet i [18].
Analyse av tumor farmakokinetikk (PK) og 20S-proteosomet aktivitet
tumor PK og 20S-analyser er tidligere beskrevet [10]. Kort fortalt ble tumorprøver høstet på ulike tidspunkter etter kjøretøy eller narkotika administrasjon og homogenisert i mus plasma for PK anaylsis. Konsentrasjon av ixazomib i svulstene ble bestemt ved bruk av LC /MS /MS-metoder.
20S Proteasome β5 enzymatisk aktivitet ble målt etter homogenisering tumorprøver i buffer som inneholder HEPES og DTT ved hjelp av en Covaris ultralyd.
mutasjonsanalyse
DNA fra xenograft tumorer ble amplifisert og analysert ved Sequenom analyse som beskrevet i [19]. Genet panel inkludert i OncoCarta
™ V1 og tilpasset panel er gitt i S2 tabell. For
KRAS
genet, mutasjonene testet er G12 A /C /D /F /R /S /V, G13 A /C /D /R /S /V, L19F, Q22K, T58I, A59T /V, G60D, Q61 E /H /K /L /P /R og A146T.
Metabolsk profilering
tumorprøver ble høstet ved ulike tidspunkt etter intravenøs administrering av en enkelt dose av ixazomib. For kjøretøy kontroll, ble to tidspunkter (1t og 8 timer) evaluert. Svulsten lyse og global metabolsk profilering analyse ble gjort på Metabolon Inc. I korte trekk prøver ble hentet i metanol og deles i to like deler for analyse på GC /MS og LC /MS /MS-plattformer. Proprietær programvare ble brukt til å matche ioner til en in-house bibliotek av standarder for metabolitt identifikasjon og for metabolitten kvantifisering av toppområdet. Welch to utvalgs t-tester og to-veis ANOVA ble brukt for å sammenligne gjennomsnittene for to populasjoner. p-verdiene ≤0.05 ble vurdert som svært signifikant og p-verdier mellom 0,05 og 0,1 ble betraktet som mindre viktig.
Western blot-analyse
Tumorprøver ble homogenisert i buffer inneholdende MPER proteaseinhibitorer [10]. 10-20 μgm av proteiner ble fylt på 4% til 12% Bis-Tris-geler, eller 3-8% tris-acetat geler og høymolekylære proteiner (Invitrogen). Proteiner ble overført til PVDF-FL membraner (Millipore), blokkert og inkubert med primære antistoffer etterfulgt av Alexa Fluor 680-merket sekundært antistoff (molekylære prober). Band ble oppdaget ved hjelp av Odyssey infrarød bildesystem (LI-COR biovitenskap, Lincon, NE).
Resultater
KRAS-mutasjoner korrelerer med nedsatt følsomhet for ixazomib
For å forstå den molekylære faktorer som bestemmer følsomhet for ixazomib
in vivo
, undersøkte vi antitumoraktivitet i et panel av kolon og NSCLC xenograft modeller, inkludert primære humane xenografter og cellelinje-avledet xenografter. Antitumoraktivitet av medikament ble uttrykt som T /C-forholdet; med T /C på 0 indikerer fullstendig fjerning av tumoren, og T /C av 1 indikerer ingen effekt. (Fig 1A)
(A) Antitumor aktivitet ixazomib i 14 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og 6 kolon xenograft modeller. Panelet inkluderte både cellelinje-avledet og primære humane xenografter skjuler enten WT eller mutant KRAS. Tumorbærende dyr (n = 8-10 pr gruppe) ble behandlet med enten bærer eller MTD dose på ixazomib (mellom 11 og 14 mg /kg, IV, BIW) i omtrent tre uker. T /C ble beregnet ved å dividere gjennomsnittlig tumorvolum av medikamentbehandlede dyr ved at av bærerbehandlede dyr på dag 19-21. Tumor konsentrasjon av ixazomib (B) og 20S proteasomhemmingen (β5 stedet) (C) i ulike NSCLC og tykktarm xenografter ved ulike tidspunkt etter en enkelt intravenøs administrering av MTD dose ixazomib. % 20S β5-inhibering ble beregnet ved å vurdere den gjennomsnittlige (n = 3 for behandlingsgruppe eller 4 for kjøretøygruppe) tumor 20S aktiviteten av bæremiddelbehandlede dyr, som 100%. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige konsentrasjonen av ixazomib eller 20S hemming i svulsten fra 3-4 forskjellige dyr +/- SD.
Mutasjoner i et panel av onkogener og tumor dempere (S2 Table) ble undersøkt i de tumorxenotransplantater av Sequenom massespektrometri basert analyse. I samsvar med den høye forekomsten av
KRAS
mutasjoner i menneskelig kolon og NSCLC tumorer, 12 av de 20 modellene evalueres hadde
KRAS
mutasjoner i kodon G12, G13, G61 eller A146T, mens ingen
NRAS
eller
HRAS
ble oppdaget mutasjoner. Færre prøver hadde mutasjoner i
PI3KCA
, eller andre kjente onkogener (S3 tabell). KRAS mutante tumorer viste lavere følsomhet for ixazomib (av. T /C = 0,82) sammenlignet med WT KRAS tumorer (av. T /C = 0,4) (p = 0,002 bestemt ved t-test) (figur 1A).
Vi vurderte flere mulige forklaringer på forskjeller i ixazomib følsomhet blant xenografttumorer, og starter med farmakokinetiske (PK) og farmakodynamiske (PD) effekter av ixazomib
in vivo
etter en enkelt MTD dose i 5 xenograft modeller. Ixazomib konsentrasjoner i KRAS muterte tumorer var enten lik eller høyere enn de i KRAS WT tumorer (figur 1B), og tumor proteasomer β5-site-aktiviteten ble hemmet til en tilsvarende grad i både KRAS villtype og mutant-tumorer (figur 1C). Ytterligere bevis på proteasomhemmingen og nedstrøms konsekvensene ble generert ved hjelp av en IHC analyse for ATF3, som er oppregulert som en del av den integrerte stressrespons følgende proteasomhemmingen [10]. ATF3 oppregulering ble påvist i alle modeller, uavhengig av deres
KRAS
mutasjonsstatus eller følsomhet for ixazomib (S1 fig). Således er ufølsomheten KRAS-mutant tumorer til ixazomib ikke forklares ved lavere tumoreksponering eller mindre mål inhibering.
Interessant nok har KRAS mutasjoner ikke blitt identifisert som en prediktor for PI motstand i monolag vevskultur levedyktighet analyser. For å avgjøre om sammenhengen mellom KRAS status og ixazomib følsomhet kunne observeres ved hjelp av en
in vitro
tredimensjonal modell, et panel av 20 xenograft explants inkludert WT KRAS og mutante KRAS ble testet i en myk agar-kolonidannelse analysen. Eksplantatene inkluderte 17 primære humane xenografttumorer og 3 cellelinje avledet xenografttumorer, og åtte av de 20 har også blitt testet for ixazomib svar
in vivo
. Forskjellen i følsomhet sett
in vivo
ikke ble oppdaget
in vitro
. Median IC
50 i kolonidannelse analysen var 99 nM (range 34-272 nM) for WT KRAS-modeller, og 73 nM (range 38-17 5nM) for KRAS muterte modeller (S4 tabell). (P = 0,4). Disse dataene tyder på at mutant KRAS gir en overlevelse fordel
in vivo
som ikke etterlignet i myk agar assay format.
Innføring av KRAS mutasjon reverserer in vivo ixazomib følsomheten KRAS WT xenograft
for ytterligere å undersøke sammenhengen mellom
KRAS
genotype og ixazomib følsomhet
in vivo
, brukte vi et sett av tykktarmskreft cellelinjer som skiller seg i KRAS-status, men er ellers genetisk tilpasset. Stabile derivater av SW48 cellelinjen ble avledet ved å innføre en KRAS-G13D eller KRAS-G12V punktmutasjon via rrAV genet redigering teknologi. Tilstedeværelsen av mutasjoner og bevaring av generell genomisk profil av de modifiserte cellene ble bekreftet ved mutasjon deteksjon og SNP analyse (data ikke vist). Aktivering av KRAS signalering i KRAS-G13D og KRAS-G12V celler i forhold til sin WT motstykke ble tidligere bekreftet. [20]
Alle 3 cellelinjer var tilsvarende følsomme for ixazomib i
i
vitro celleviabilitet analysen (figur 2A). KRAS WT og KRAS-G13D celler var like sensitive i 2D kolonidannelse analysen, mens KRAS-G12V celler var ca. 2 ganger mer følsom i denne CFA analysen (figur 2A). I kontrast, var det en klar forskjell i
in vivo
følsomhet for ixazomib i SW48, SW48-G13D og SW48-G12V xenografttumorer. SW48 xenografter med villtype KRAS svart på ixazomib behandling med T /C på 0,42 (figur 2B). I kontrast, verken SW48-G13D eller SW48-G12V xenograft modell var følsom for ixazomib (T /C = 1,05 og 0,99), noe som tyder på at innføringen av en
KRAS
mutasjon er tilstrekkelig til å drive motstand mot PI i tumor xenograft modeller
in vivo
. De 3 xenograft modeller viste lignende vekstkinetikk i kjøretøygrupper (figur 2B), noe som tyder på at forskjeller i ixazomib respons er ikke på grunn av forskjeller i tumorvekstrater. Videre resultatene av en PK /PD studie utført i SW48 og SW48-G13D xenografttumorer indikerer sammenlignbare nivåer av ixazomib eksponering i xenografter (figur 2C), samt tilsvarende nivåer av tumor proteasomhemmingen (Fig 2D), i samsvar med resultater i den bredere panel av xenografter som er beskrevet i figur 1. Således er effekten av KRAS mutasjon ikke på nivået av legemiddeleksponering eller mål-inhibering.
(A) Sammendrag tabell av EC
50, IC
50 og T /C-verdier for SW48, SW48-G13D og SW48-G12V celler og transplantater fra
in vitro
celle levedyktighet,
in vitro
kolonidannelse og
in vivo
antitumor aktivitet analyser. EC
50 representerer den midlere konsentrasjonen av ixazomib (+/- SD) nødvendig for 50% celledreping i tre forskjellige forsøk i cellelevedyktighet analysen. I kolonidannelse assay (CFA) den midlere konsentrasjon av medikamentet for å inhibere 50% kolonidannelse ble beregnet i tre forskjellige forsøk, og antallet er gjennomsnittet +/- SD. 13 mg /kg, IV, ble BIW dose brukt i xenograft-studier og T /C ble beregnet som beskrevet tidligere. (B) Antitumor aktivitet ixazomib i SW48, SW48-G13D og SW48-G12V xenografter. Den tumorvekst over tid blir presentert for kjøretøy og ixazomib behandlede dyr peiling SW48, SW48-G13D og SW48-G12V xenografter. Behandlingen startet da gjennomsnittlig tumorvolumet nådd ca 200mm
3, og det var n = 10 dyr pr arm. T /C ble beregnet på dag 19-21. C og D: Tumor konsentrasjon av ixazomib (C) og 20S proteasomhemmingen (D) ved ulike tidspunkt etter en akutt intravenøs administrasjon av ixazomib på /kg dose 13 mg i SW48 og SW48-G13D svulster. Hvert datapunkt representerer svulster fra tre forskjellige dyr +/- SD
Økt uttrykk av GLUT4 reseptorer i KRAS muterte tumorer
Forskjeller i ixazomib aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo
antyder faktorer i tumormiljøet
in vivo
, slik som næringsnivåer, metabolitter eller andre faktorer, kan spille en rolle i å bestemme sensitiviteten til ixazomib. Onkogen KRAS proteiner har blitt rapportert å indusere celleoverflate-ekspresjon av glukose reseptorer (gluts), og derved lette cellulært glukosetransport [4,15,21,22]. Derfor, undersøkte vi grunnlinjen ekspresjon av GLUT1 og GLUT4 i en rekke KRAS WT og mutante tumorer ved Western blot (Fig 3). Vi inkluderte lysatene fra KRAS WT og mutant cellelinje-avledet xenografter (NCI-H1650 og A549 og isogen par SW48 og SW48-G13D) og primær xenografter (PHTX132Lu og PHTX192Lu). Selv uttrykk for GLUT1 reseptorer ikke korrelerer med KRAS-status, de KRAS muterte xenotransplantater viste mye høyere nivåer av GLUT4 reseptor uttrykk i forhold til svulster med WT KRAS. Økt GLUT4 ville muliggjøre økt glukoseopptak, noe som ville være fordelaktig i næringsbegrensende miljøer ofte finnes i tumorer. Den forhøyede GLUT4 uttrykk i KRAS muterte tumorer tyder på at endret glukoseopptak og metabolisme kan spille noen rolle i å bestemme sensitiviteten til ixazomib.
Proteiner ble hentet fra ubehandlede tumorer og 10 ug protein ble lagt i hvert kjørefelt. Nivåer av GLUT1 og GLUT4 proteiner ble bestemt ved western blot og tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. n = 3 for hver svulst.
Global metabolsk profil analyse i SW48 isogene svulster
For ytterligere å forstå de metabolske forskjeller mellom KRAS WT og KRAS muterte tumorer og deres respons på ixazomib, vi gjennomført metabolsk profilering på SW48 og SW48-G13D xenografttumorer høstet ved ulike tidspunkt etter en enkelt intravenøs dose av kjøretøy eller ixazomib. Metabolitter ble målt ved massespektrometri-baserte metoder og rapportert som en fold-endring i forhold til definerte kontrollprøver. Det var en rekke metabolske forskjeller observert ved baseline (behandlede prøver) mellom SW48 og SW48-G13D svulster, spesielt knyttet til glutation og glykogen metabolisme og fettsyrer (fig 4). Både oksidert og redusert glutation (GSSG og GSH) ble oppdaget på et høyere nivå i KRAS muterte tumorer sammenlignet med KRAS WT tumorer (figur 4A). Omvendt, ble biosyntetiske forløpere for glutation, for eksempel glutamat, cystein, glycin, gamma-glutamyl-aminosyrer, og 5-oxyproline påvises ved lavere nivåer i KRAS muterte xenograft tumorer (figur 4A). Den forhøyet nivå av glutation syntese i KRAS muterte tumorer kan bidra til økt overlevelse og legemiddelresistens ved å styrke svulstene evne til å håndtere Redox stresset [23]
AC. Glutation metabolisme trasé (A), glykogen metabolisme ( B) og relative uttrykk for pathway metabolitter i KRAS WT vs KRAS muterte tumorer behandlet med kjøretøy for 1 og 8 timer. Tallene angir ganger endring av hver metabolitt i KRAS muterte tumorer sammenlignet med KRAS WT svulster og er gjennomsnittet av metabolitter fra 5 forskjellige svulster. C: Relativ uttrykk for frie langkjedede fettsyrer, acetyl CoA, acetylcarnitine og citrate i KRAS mutant vs KRAS WT svulster. Grønne bokser indikerer en ratio 1, med mørke grønne bokser som svært signifikant (p ≤0.05) og lys grønne bokser som mindre viktig (0,05 p 0,1). Røde bokser indikerer en ratio 1, med mørke røde bokser som svært signifikant (p ≤0.05) og lys røde bokser som mindre viktig (0,05 p 0,1). Hvite boksene representerer ingen endring i uttrykket.
Redusert nivåer av glykogen mellomprodukter, som for eksempel maltotriose, maltose og glukose ble observert i KRAS muterte tumorer sammenlignet med KRAS WT tumorer (figur 4B), noe som tyder på en rask glykogen sammenbrudd i KRAS muterte tumorer å levere glukose. Den forholdsvis lavere nivå av glukose tilstede ved utgangspunktet i KRAS mutant tumorer er en indikator på at glukose blir raskt forbrukt i å fremme videre vekst og overlevelse.
Høyere nivåer av frie fettsyrer i SW48-G13D tumorer sammenlignet med SW48 (Fig 4C) ble oppdaget. Andre forskjeller i komponentene av fettsyremetabolisme banene ble også notert; i SW48-G13D svulster, nivåer av citrate er høyere og nivåer av acetylcarnitine er lavere i forhold til de SW48 WT svulster. Til sammen disse forskjellene peker på økt
de novo
fettsyrer i KRAS muterte tumorer, noe som kan bidra til økt membran biosyntese nødvendig for fortsatt vekst og spredning i onkogen drevet svulster.
aminosyre uttømming følgende ixazomib behandling
Det var en rekke metabolske forandringer observert følgende ixazomib behandling i både SW48 og SW48-G13D svulster. En av de store forandringer var den akutte nedgang i nivået av mange individuelle aminosyrer følgende ixazomib behandling (figur 5). Fig 5A viser reguleringen av 20 aminosyrer i en og 8 timer etter ixazomib behandling av KRAS WT og mutante SW48 svulster. En rekke av essensielle og ikke-essensielle aminosyrer redusert 1 time etter ixazomib behandling i både KRAS WT og mutante tumorer. Aminosyre nivåene returnert nær baseline etter 8 timer, noe som tyder på akutt aminosyre uttømming følgende ixazomib behandling. Proteasomal degradering av proteiner som danner korte peptider som kan være enzymatisk omdannet til frie aminosyrer; blokkering proteasome aktivitet med ixazomib bør derfor føre til en redusert pool av peptider og frie aminosyrer.
(A) Relativ nivå av aminosyrer i 1 time og 8 timer etter ixazomib behandling av SW48 KRAS WT og G13D mutante svulster. Tallene er uttrykt som relative nivået av hver aminosyre følgende ixazomib behandling sammenlignet med vehikkel behandling på det tidspunkt. Hvert datapunkt er et gjennomsnitt av tumorer fra fem forskjellige dyr. Fargekoden er tilsvarende som beskrevet i figur 4. (B) Ekspresjon av pGCN2 (T899), GCN2, peIF2α (Ser52) og eIF2α i tumorer fra kjøretøyet eller ixazomib behandling. Kjøretøyprøver ble tatt ved 4 timer etter dosering, og de ixazomib behandlede prøvene ble samlet opp ved forskjellige tidspunkter (som angitt i figuren) etter medikamentbehandling. Tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. Merk: for pGCN2 /GCN2 western blot, ble bare to prøvene vurderes til 24 t endepunktet og 3 prøver ble evaluert for alle andre markører og tidspunkter i denne figuren (14 prøver som brukes i GCN2 /pGCN2 blotter og 15 prøver i de andre blotter).
Aminosyre uttømming fører et overskudd av frie tRNA som kan binde seg til GCN2 og føre til dens autofosforylering og aktivisering [24]. Når den er aktivert, phosphorylates GCN2 eIF2αat Serine 52 som hemmer eIF2α og dermed undertrykker protein oversettelse [25,26]. For å spore konsekvensene av aminosyren utarming, vurderte vi GCN2 /fosfor-eIF2α aksen av western blot i SW48 WT og SW48-G13D xenografttumorer følgende ixazomib behandling. Som vist i figur 5B, ixazomib behandling resulterer i fosforylering av GCN2 ved T899 i både KRAS WT og mutante tumorer i en tidsavhengig måte, med litt høyere nivåer av pGCN2 detektert etter behandling i SW48 WT tumorer sammenlignet med deres KRAS mutante motstykker. Nivåene av total GCN2 var lik i begge SW48 og SW48-G13D svulster. I samsvar med den fosforylering og aktivering av GCN2, vi har observert en økning i fosfo-eIF2α (Ser 52) i det samme tidsrom i begge SW48 og SW48-G13D tumorer, selv om basalnivået av p-eIF2α var høyere i SW48-G13D tumorer sammenlignet med SW48 svulster. I tillegg er den totale nivået av eIF2α var noe høyere i SW48-G13D svulster i forhold til SW48 svulster, men ikke endre enten svulst følgende ixazomib behandling. Sammen, den metabolske profilering og western blot-data antyder ixazomib behandling resulterer i en akutt fall i frie aminosyre bassenger, som aktiverer GCN2 og dermed resulterer i fosforylering og inaktivering av eIF2α, noe som kan føre til redusert global proteintranslasjon. Fordi disse endringene skjer i både KRAS WT og mutante svulster, har de ikke forklare forskjellen i ixazomib følsomhet mellom KRAS WT og mutante svulster.
Økt fettsyren beta oksidasjon i KRAS WT svulster følgende ixazomib behandling
Utnyttelse av fettsyrer som en alternativ energikilde oppstår når andre katabolske veier slik som aminosyremetabolisme er kompromittert [27]. Frie fettsyrer kan gjennomgå β-oksydasjon for å fremstille acetyl-CoA og ketonlegemer, som beskrevet i figur 6A. I SW48 WT tumorer, detektert vi økte nivåer av frie fettsyrer, acetyl-CoA, og ketonet legemet 3-hydroksybutyrat (3-BHBA) ved 1 time etter ixazomib behandling (Fig 6B og 6C). Nivået av disse metabolittene returnert nær utgangsnivået etter 8 timer med medikamentell behandling. Økningen i disse biokjemikalier i KRAS WT svulster er reflekterende av et raskt skifte til fettsyre β-oksidasjon følgende ixazomib behandling. I kontrast, gjorde KRAS muterte tumorer ikke viser tegn til økt β-oksidasjon følgende PI behandling, med de fleste frie fettsyrer, acetyl-CoA og 3-HBA nivåer gjenværende uendret etter ixazomib behandling.
metabolitter involvert i fettsyre beta oksidasjon veien. (A) Tabell oppsummerer frie fettsyrer i tumorprøver. Tallene angir ganger endring i legemiddelbehandlede svulster enn kjøretøy behandlet svulster ved 1 og 8 timer tidspunkter. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt av tumorer fra fem forskjellige dyr. Tabell som oppsummerer innholdet av acetyl Co-A og 3-hydroksy-butyrat ved 1 time etter ixazomib behandling. Tallene indikerer ganger endring i ixazomib behandlet svulster enn kjøretøy behandlet svulster, n = 5 per datapunkt. Endringer i CPT-1 proteinnivået følgende ixazomib behandling i SW48 og SW48-G13D svulster.
