Abstract
Samtidig chemoradiation med 5-fluorouracil (5-FU) er allment akseptert for kreftbehandling. Imidlertid samspillet mellom stråling og 5-FU er fortsatt uklar. Her vurderte vi påvirkning av lokal bestråling på farmakokinetikken til 5-FU i rotter. Den enkelt-fraksjon stråling ble gitt til hele bekkenet felt av Sprague-Dawley-rotter etter datastyrte tomografi-baserte planlegging. 5-FU 100 mg /kg er foreskrevet 24 timer etter bestråling. En væskekromatografi system ble anvendt for å måle 5-FU i blodet. Matriksmetalloproteinase-8 (MMP-8) inhibitor jeg ble gitt for å undersøke hvorvidt RT modulering av 5-FU farmakokinetiske parametre kan bli blokkert. Sammenlignet med sham-kontroller bestrålt, hele bekkenet bestråling reduserte arealet under konsentrasjonskurven (AUC) av 5-FU i plasma og, i kontrast, økt i gallen med et strålingsdoseavhengig måte. Basert på protein rekke analyse, er mengden av plasma MMP-8 ble økt med hele bekkenet bestråling (2,8-ganger av 0,5 Gy og 5,3 ganger ved 2 Gy) sammenlignet med kontroller. Forbehandling med MMP-8-inhibitor reverseres effekten av bestråling på AUC av 5-FU i plasma. Våre funn første indikerer at lokal bestråling modulere systemiske farmakokinetikken til 5-FU gjennom å stimulere utgivelsen av MMP-8. Farmakokinetikken til 5-FU ved samtidig chemoradiaiton behandling bør kontrolleres på nytt og den optimale 5-FU-dosen bør revurderes, og justeres om nødvendig i løpet CCRT
Citation. Hsieh CH, Liu CY, Hsieh YJ, Tai HC, Wang LY, Tsai TH, et al. (2011) matriksmetalloproteinase-8 formidler Ugunstig Systemisk Impact of Local Bestråling på farmakokinetikk Anti-Cancer Drug 5-Fluorouracil. PLoS ONE seks (6): e21000. doi: 10,1371 /journal.pone.0021000
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 26 desember 2010; Godkjent: 18 mai 2011; Publisert: 09.06.2011
Copyright: © 2011 Hsieh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Strålebehandling (RT) brukes som et effektivt. lokal behandlingsform for å hemme celleproliferasjon, indusere celledød og undertrykke tumorvekst [1]. For å forbedre behandlingsresultatet, både når det gjelder lokoregionalt kontroll og overlevelse, er samtidig bruk av kjemoterapi under strålebehandling (CCRT) nå standard behandling av ulike kreftformer, spesielt lokalt avansert kreft. Blant de legemidler som brukes for å forbedre RT effekt, 5-fluorouracil (5-FU) er en av de mest brukte kjemoterapeutika av CCRT [2], [3], [4], [5].
i det siste, ble RT utelukkende anvendt som en lokal behandling, og dens effekt ble beregnet ved lokal effekt modell [6]. Imidlertid viser økende bevis for at stråling har direkte DNA-skader avhengige effekter samt sender signaler til nabocellene. Reaksjonene av ikke-bestrålte celler som reagerer på signaler frembragt av nabo bestrålte celler blir betegnet bystander virkning [7], [8]. Videre er lengre rekkevidde effektene inntreffer innenfor eller mellom vev også rapportert og kalles abscopal, out-of-field eller fjerne tilskuer svar [9]. Flere molekyler spiller roller i bystander signalering som involverer stressresponser og celle-cellesignalering, er imidlertid ingen av dem er spesifikke for stråling. Flere studier viser at endringer i plasmastoffnivåer reagerer på stråling, så som interleukin 6 (IL-6) [10], IL-8 [11], transformerende vekstfaktor-beta-1 (TGF-β1) [12], tumor nekrose faktor α (TNF-α) [13], reaktive oksygenarter [14] og reaktive nitrogenforbindelser [15]. Likevel er ingen sterke bevis for årsaksforhold av disse molekylene gitt. Nylig rapporterte vi at mage bestråling kunne gi en betydelig modulere systemiske farmakokinetikken til 5-FU på 0,5 Gy, off-målområdet i klinisk praksis, og på 2 Gy, den daglige behandlingsdosen for målet behandling i en eksperimentell rottemodell [16]. I tillegg er resultatene fra en klinisk undersøkelse viste at pasienter med kolorektal kreft med lavere AUC for 5-FU under adjuvant kjemoterapi hadde lavere sykdomsfri overlevelse [17]. Tatt sammen, disse linjer med bevis støtter viktigheten og nødvendigheten av å søke etter mediatorer som er ansvarlige for den uventede effekten av lokal RT på systemiske farmakokinetikken for kjemoterapeutiske midler, så som 5-FU. I denne studien undersøkte vi mulige løselige meglere involvert i virkningen av lokaliserte hele bekken RT, med lever sparsom, på farmakokinetikken til 5-FU hos rotter.
Resultater
Plasma farmakokinetiske parametre av 5-FU og hele stråling av bekkenet
for å verifisere at lokale RT modulert systemiske farmakokinetikken til 5-FU, vi etablert en eksperimentell modell ved hjelp av CT-basert planlegging og stråling av bekkenet hos rotter, og integrert det i en farmakokinetisk assaysystem. Forbløffende nok fant vi at stråling av bekkenet markert redusert AUC for 5-FU i rotter med 17,6% ved 0,5 Gy (
P
= 0,019) og 21,5% ved 2 Gy (
P
= 0,008 ) (fig. 1A). Av spesiell interesse, stråling på 2 Gy til rotta hele bekkenet simuleres den daglige behandlingsdosen til et menneske, mens lavdose stråling (0,5 Gy) simulert dose deponeres i den sjenerøse, off-målområdet i klinisk praksis. Som vist i tabell 1, stråling av bekkenet betydelig redusert bety oppholdstid (MRT), og ved kontrast, økt clearance verdien av 5-FU i forhold til ikke-bestrålte kontroller. Det var ingen signifikant forskjell i verdiene av halveringstid (T
1/2), maksimal observert plasmakonsentrasjon (Cmax) eller distribusjonsvolum ved steady state (Vss) i løpet av de testede gruppene.
den tverrgående aksen viser tid i minutter, og den vertikale aksen representerer konsentrasjonen av 5-FU. (A) Plasma. (B) Bile. Hver gruppe data ble samlet fra seks rotter.
Bile farmakokinetiske parametre for 5-FU og hele stråling av bekkenet
Vi fant at stråling av bekkenet betydelig økt AUC for 5- FU i galle fra rotter med 25,1% ved 0,5 Gy og 30,6% ved 2 Gy (fig. 1B). Stråling av bekkenet betydelig redusert Cmax og clearance verdi, og i kontrast, økt MRT og Vss av 5-FU, når sammenlignet med ikke-bestrålte kontroller. Av interesse, redusert 2-Gy bestråling Cmax, og i kontrast, økt MRT (
P
= 0,008) og Vss (
P
= 0,015) av 5-FU i en utstrekning som er større enn det av 0,5-Gy gruppe. Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom de 0,5-Gy og kontrollgrupper for Cmax og Vss. Videre ingen signifikant forskjell i T
1/2 ble bemerket blant de tre gruppene (tabell 2).
leverfunksjon etter RT eller 5-FU behandling
serum konsentrasjoner av alanin aminotransferase (ALT) nivåer var ingen signifikant forskjell mellom 5-FU-behandlede, 2Gy-behandlede, 0,5 Gy fulgt av 5-FU-behandlede og 2 Gy fulgt av 5-FU-behandlede og kontrollgrupper (fig. 2 ).
serumkonsentrasjonen av alaninaminotransferase (ALAT) var ikke signifikant forskjellig mellom alle testede grupper. N = 5 for hver gruppe.
De cytokiner svare på RT eller 5-FU i plasma
Sammenlignet med kontrollgruppen, var det ingen signifikante forskjeller mellom RT 2Gy alene , 5-FU alene, RT 0,5 Gy fulgt av 5-FU og RT 2 Gy fulgt av 5-FU gruppe i nivåene av transformerende vekstfaktor-beta-1 (TGF-β1) og tumornekrosefaktor α (TNF-α) ( fig. 3A og 3B).
(A) nivået av transformerende vekstfaktor beta 1 (TGF-β1) i plasma. (B) Et nivå av tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) i plasma. Hver gruppe data ble samlet inn fra fem rotter.
Endring av løselige faktorer i plasma forårsaket av hele stråling av bekkenet
For å vurdere endringer i profilen av løselige faktorer involvert med hele stråling av bekkenet, rotteplasmaprøver ble oppsamlet og underkastet en cytokin antistoff matrise-analyse (fig. 4). Sammenlignet med kontroll (ubehandlet) gruppe (Fig. 4A) og 5-FU alene (fig. 4C), den observerbare doseavhengige forandringer i plasmanivåene av løselige faktorer inkludert matriksmetalloproteinase-8 (MMP-8), monocytt kjemotiltrekkende protein 1 (MCP-1), cytokin-fremkalt nøytrofil kjemotiltrekkende -1 (Cinc-1) og tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1). Blant disse faktorene, bare økningen i MMP-8-nivå var konsistent i triplikate eksperimenter. Sammenlignet med kontrollgruppene, RT 2Gy alene kan øke ekspresjonen av MMP-8 med faktorer på 3,8 (Fig. 4B). Når sammenlignet med 5-FU alene gruppe, plasmanivået av MMP-8 økt både RT 0,5 Gy fulgt av 5-FU (fig. 4D) og RT 2 Gy, fulgt av 5-FU-grupper (fig. 4E) i en doseavhengig måte med faktorer på 2,8 og 5,3, respektivt.
mengden av matriksmetalloproteinase-8 (MMP-8) økte i 0,5-Gy og 2-Gy bestrålt grupper sammenlignet med kontrollgruppen. Et kart over plasseringen av cytokin antistoffer oppdaget på protein chip vises på den siden av figuren. Prikkete firkanter angir plasseringen av MMP-8. Hver cytokin er representert ved like flekker på de stedene som er vist. Cytokin antistoff matriser analyse av (A) ubehandlet kontrollgruppe, (B) hele bekkenet bestråling (RT) med 2 Gy bare, (C) 5-fluorouracil (5-FU) alene, (d) RT med 0,5 Gy etterfulgt av 5- FU og (E) RT med 2 Gy fulgt av 5-FU. Cytokin matrisen bilde representerer resultater fra en av tre uavhengige forsøk, som viser lignende mønstre av uttrykket.
Intracellulær 5-FU nivåer med eller uten rekombinant MMP-8 ved høy-ytelses væskekromatografi
Vi har undersøkt rollen av rekombinant MMP-8 på intracellulære konsentrasjonen av 5-FU i HepG2 (menneskelig levertumor-avledede celler som innehar biokjemiske profiler som er karakteristiske for normale hepatocytter) uten å motta stråling. Det var ingen signifikant effekt på AUC for 5-FU mellom rekombinant MMP-8 pluss 5-FU og 5-FU alene grupper (Fig. 5). Vi fant ut at rekombinant MMP-8, ikke indusert ved bestråling, vil ikke påvirke intracellulære konsentrasjonen av 5-FU i levercellene, etterligne noen farmakokinetiske endringer på cellenivå.
Modulation av 5-FU farmakokinetisk av bestråling ble reversert av MMP-8 hemmer
Vi neste undersøkte rollen som MMP-8 på effekten av RT på 5-FU farmakokinetikk ved hjelp av en MMP-8-hemmer. Verken MMP-8-hemmer alene eller dets kjøretøy hadde en signifikant effekt på AUC for 5-FU i sammenligning med kontrollene (fig. 6). Vi har funnet at forbehandling med MMP-8-inhibitor vesentlig dempet nedgangen i AUC av 5-FU som skyldes stråling av bekkenet (AUC
bestråling versus AUC
MMP-8-inhibitor + bestråling var 3305 versus 3963 min ug /ml,
P
0,05). Videre er redusert MRT og økt clearance verdi forårsaket av bestråling ble fullstendig reversert ved anvendelse av MMP-8-inhibitor (tabell 3).
Arealet under plasmakonsentrasjonskurven (AUC) av 5-FU 100 mg /kg administrert til rotter i kontrollgruppen uten oppløsningsmiddel, kontrollgruppen med oppløsningsmiddel, helt bekken 2-Gy bestråling med oppløsningsmiddel, og hele bekkenet 2-Gy bestråling med oppløsningsmiddel og MMP-8-inhibitor. Den tverrgående aksen viser tid i minutter, og den vertikale aksen representerer konsentrasjonen av 5-FU i plasma. Hver gruppe data ble samlet inn fra fire rotter.
Diskusjoner
Etter bevis på konseptet at lokale RT påvirket systemiske farmakokinetikken av kjemoterapeutika å bruke 5-FU som modell, vi neste screenet for mulige løselige faktorer ansvarlig for denne effekten, som ble identifisert som MMP-8. MMP-8, også kjent som kollagenase-2 eller nøytrofil kollagenase, er et medlem av den sinkavhengige interstitiell kollagenase undergruppe av MMP-familien av nøytrale proteinaser [18]. Vi viste at MMP-8 besatt uventet bioaktivitet i moduler farmakokinetikken av 5-FU.
polymorfonukleære nøytrofile (PMN) er den viktigste kilden til MMP-8 hos mennesker og mus [19], [20]. MMP-8 er lagret i granulater av PMN og blir frigjort ved degranulering [21]. Fisher
et al
. [22] rapporterte at MMP-8 protein nivåer i menneskelig hud økte omtrent 4 ganger i løpet av 8 timer og forble forhøyet i 24 timer etter at ultrafiolett bestråling. Strålebehandling ved tumorbærende områder fremkaller betennelse i den bestrålte felt og rekrutterer T-lymfocytter, nøytrofile, lymfocytter, makrofager, plasmaceller og dendrittiske celler [18], [23], [24]. I tillegg induserer bestråling opp-regulering av genene til de viktigste proinflammatoriske kjemokiner [25]. I denne studien, bestrålt vi hele bekkenet av rotter, som kunne ha levert en stråledose til sirkulerende nøytrofile, vev og benmargsmakrofager og i bekken. Kollektivt, øker dette muligheten for at stråling av bekkenet kan stimulere nøytrofiler og /eller den andre inflammatoriske celle ontogeny, indusere inflammatorisk stress, og forbedre utskillelsen av MMP-8 (fig. 4), så vel som forskjellige andre proinflammatoriske mediatorer. I tillegg har flere studier viser forandringer i plasmanivåene av stoffet reagerer på stråling, for eksempel TGF-β1 [12] og TNF-α [13]. Videre kan TGF-β være et mål for 5-FU via c-Jun NH2-terminal kinase /aktivator protein-1-aktivering i humane fibroblaster [26]. I tillegg innebærer TNF-α i reguleringen av fluoropyrimidin-aktiverende enzymer, Uridin fosforylase (UPase), som induserer UPase genekspresjon med derav følgende forbedring av 5-FU antiproliferativ aktivitet [27]. Men i denne studien, nivåene av TGF-β1 og TNF-α er ikke økt i RT alene, 5-FU alene eller RT etterfulgt av 5-FU gruppene sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 3A og 3B). Disse data tyder på at MMP-8 ser ut til å spille en viktig rolle i lokal RT-indusert modulering av systemiske 5-FU farmakokinetikk men ikke gjennom disse cytokiner.
Harty MW et al. [28] rapporterte at polymorfonukleære celle-avledet MMP8 spiller en viktig rolle for lever reparasjon i sin reversible galleobstruksjon modell. Den aktuelle studien viser at anvendelsen av bekken RT eller 5-FU ikke ville føre til skader av leverfunksjonen. Dermed vil responsen av MMP-8 indusert ved RT i RT-PK fenomener ikke være prosessen av inflammatorisk infiltrasjon til leveren, slik som alvorlige skader forårsaket av galleobstruksjon. Dessuten er det ingen forskjeller av levedyktighet (data ikke vist) og intracellulær 5-FU nivåer (Fig. 5) for 5-FU-behandlet HepG2 med eller uten rekombinant MMP-8. HepG2-celler opprettholde mange av de morfologiske og biokjemiske egenskaper av normale hepatocytter, slik som utskillelsen av de fleste plasmaproteiner som forventes fra leverceller, inkludert apolipoprotein B [29]. Resultatet tyder på at rekombinant MMP-8, ikke indusert ved bestråling, ikke vil påvirke PKS av 5-FU i leverceller, og ikke har noen signifikant toksisitet for humane hepatoblastoma-avledede cellelinje HepG2. Til sammen kan MMP-8 ikke modulere leverfunksjon.
En annen viktig sak er lik, men mindre, effekten av lavdose RT på 5-FU farmakokinetikk (Fig. 1). Legeme fordeling av lav-dose RT (0,5 Gy, for eksempel) i klinisk praksis blir sterkt raus med avanserte strålebehandling teknikker og modaliteter, såsom intensitetsmodulerte radioterapi, spiralformede TomoTherapy, hurtig lysbuen strålebehandling, volumetrisk modulert bue terapi og andre, i sammenligning med konvensjonell RT. Mens akseptere fordelene ved å målrette svulster og skåner de kritiske organer ved hjelp av disse avanserte teknikker [30], [31], er fortsatt at en forsiktig den sjenerøse, lavdose bestråling kan gi uventede eller uønskede biologiske effekter. Klinisk vi tidligere observert at lav-dose, off-target stråling levert av svært konformt TomoTherapy kan forårsake alvorlig toksisitet til de kritiske organer rundt skivene, slik som lunger, og føre til at stråling pneumonitt [32]. Likevel har det medisinske samfunnet ikke helhetlig forståelse for de biologiske effektene av sjenerøse, lavdose RT. Vi håper denne studien vil øke vår kunnskap om disse effektene og gi en eksperimentell modell for å forstå de biologiske effektene av sjenerøse, lavdose RT i en tid med svært konforme RT.
Om 80% av 5-FU er catabolyzed av leveren via den dihydropyrimidin (DPD) veien for å generere giftig 5-fluor-5,6-dihydro-uracil, mens den anabole vei, via orotat fosforibosyl transferase, produserer aktive metabolitter, inkludert 5-fluoruridin-5′-monofosfat, 5-fluoruridin, og 5-fluor-2′-deoksyuridin [33], [34]. Den generelle toksisitet var to ganger så høy hos pasienter med alvor DPD mangler ( 45% av den midlere DPD-aktivitet fra en kontrollpopulasjon) sammenlignet med pasienter med moderate DPD mangler (mellom 45% og 70% av den midlere DPD-aktivitet av en kontroll befolkningen), som rapportert av Milano og medforfatterne [35]. Fordi 10% til 20% av 5-FU utskilles uforandret i urinen [36], for pasienter med nedsatt nyrefunksjon, plasmakonsentrasjonen av 5-FU på nondialysis dager er betydelig høyere enn på dialysedager, og dette kan skyldes fjerning av noen faktorer fra plasma ved hemodialyse, som hemmer DPD aktivitet [37]. I tillegg har 5-FU en forholdsvis smal terapeutisk indeks, er en sterk korrelasjon er beskrevet mellom eksponering for 5-FU og både hematologisk og gastrointestinal toksisitet [38]. Dermed, hvis den lever eller nyrer falle inn i den bestrålte volum, [16] DPD, et hastighetsbegrensende trinn i nedbrytningen av 5-FU [39], kan bli påvirket ved stråling skade på lever eller nyrer. Men i denne studien, er lever og nyrer ekskludert fra hele stråling av bekkenet felt (Fig. 7). I tillegg ALAT var ikke signifikant forskjellig mellom kontroll, 5-FU-behandlet, eller bekken RT grupper med eller uten 5-FU. (Fig. 2) således virkningen av RT på AUC av 5-FU bemerkes i denne undersøkelsen kan ikke være forårsaket av direkte modulering av leverfunksjon ved RT eller 5-FU.
kraniale margen ble satt til toppen av bilateral hoftekam for hele bekken feltet. Konvensjonell radioterapi ble brukt til å levere stråledosen via det anterior-posterior (AP) og PA portaler.
Sammenlignet med kontrollgruppen, hele bekkenet bestråling reduserte AUC for 5-FU i plasma til et statistisk signifikant nivå (fig. 1A). I motsetning til dette, bestråling økte AUC for 5-FU i gallen signifikant (fig. 1B). Det ble fulgt av en reduksjon i MRT og økning i klaring verdi i plasma, men en økning i MRT og reduksjon av klaringen verdi i gallen. Med hensyn til farmakokinetikken, tyder dette på at stråling av bekkenet kan lette utskillelsen av 5-FU.
Gitt at samtidig bruk av kjemoterapeutika i kombinasjon med lokal konforme RT forbedrer kliniske behandlingsresultatene for et økende antall kreftformer [2 ], [3], [4], [5], våre resultater viser at begge lokalisert target-in og sjenerøs target-off bestråling kan påvirke 5-FU farmakokinetikk, og gir en grunn for å vurdere justering av kjemoterapeutiske administrasjon i løpet av RT kurs. Effekten av lokaliserte RT på systemiske farmakokinetikken til kjemoterapeutika eller andre rusmidler klart behov for ytterligere klinisk evaluering.
Materialer og metoder
Materialer og reagenser
5-FU og væskekromatografi (HPLC) -grade metanol ble kjøpt fra Sigma Chemicals (St. Louis, Missouri, USA) og Tedia Company, Inc. (Fairfield, OH, USA), henholdsvis. Milli-Q grade vann (Millipore, Bedford, MA, USA) ble brukt for utarbeidelse av løsninger og mobilfaser.
Dyr og prøveopparbeidelse
Voksen, Sprague-Dawley rotter (300 ± 20 g kroppsvekt) ble levert av Forsøksdyr Center på National Yang Ming University (Taipei, Taiwan). De ble plassert i en bestemt patogen-fritt miljø og hadde fri tilgang til mat (Laboratory Rodent Diet 5001, PMI Nutrition International, LLC, MO, USA) og vann. Alle eksperimentelle dyre kirurgi prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av dyreetiske komité for Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan (MMH-AS-98011).
Rottene ble bedøvet med uretan 1 g /ml og α-Chloralose 0,1 g /ml (1 ml /kg ved intraperitoneal injeksjon), og ble immobilisert på et bord når gjennomgår computertomografi for simulering av hele bekkenet feltet. KS marginen ble satt på toppen av de bilaterale bekken toppene for hele bekken feltet (Fig. 7). Konvensjonell radioterapi ble brukt til å levere stråledosen via det anterior-posterior (AP) og PA portaler. Forsøksdyrene ble randomisert til kontrollen, 2-Gy alene, 5-FU alene, 0,5-Gy fulgt av 5-FU, og 2-Gy, fulgt av 5-FU-grupper. Hver gruppe data ble samlet fra seks rotter.
allometrisk skalering av stråledoser (0,5 og 2 Gy) mellom mennesker og rotter, henholdsvis, var en viktig faktor i studien. Grunnen for bruk av 0,5 og 2 Gy for rottene var for å simulere de aktuelle doseringsområde for daglig behandling av menneskekroppen, for sikkerhet og bearbeidbarhet, som tidligere rapportert [16]. I korte trekk var det ingen direkte sammenligning av allometriske skalering ved hjelp av hele bekkenet bestråling. Likevel, allometrisk skalering av den dødelige dose (LD50) (Gy) av hele kroppen bestråling for mennesker og rotter er 4 Gy og 6,75 Gy, henholdsvis [40]. Gitt at denne forskjellen er moderat, bestemte vi oss for å bruke 0,5 og 2 Gy for rotter å simulere relevant doseområde for daglig behandling av menneskekroppen.
Ambre
et al
. [41] har studert eliminering av 5-FU og dens metabolitter etter intravenøs administrering av 5-FU ved 15 og 150 mg /kg til rotter. Resultatene av denne studie antydet at metning av katabolismen skjedde etter den høyere dose. Jarugula
et al
. [42] har vist at den dosenormaliserte areal under kurven (AUC) var betydelig høyere etter administrasjon av 100 mg /kg (gjennomsnitt ± standardavvik, SD, 1,14 ± 0,55 mg · h /L /mg) enn etter 50 mg /kg (gjennomsnitt ± SD, 0,50 ± 0,16 mg · h /L /mg) eller 10 mg /kg (gjennomsnitt ± SD, 0,43 ± 0,11 mg · h /L /mg). Derfor valgte vi 100 mg /kg som en mulig 5-FU-dosen i rotter for undersøkelse av 5-FU farmakokinetiske parametre, basert på tidligere rapporter [16], [41], [42].
tyve timer etter RT, ble rottene administrert 100 mg /kg av 5-FU i 2 ml normal saltoppløsning ved intravenøs infusjon i den femorale vene i løpet av en 2-minutters periode [42]. En 150 pl blodprøve ble tatt ut fra halsvenen med en fraksjonssamler i henhold til en programmert plan på 5, 15, 30, 45, og 60 min, og 1,5, 2, 2,5, og 3 timer etter legemiddeladministrering. Blodprøvene ble umiddelbart sentrifugert ved 3300 x
g
i 10 min. Det resulterende plasma (50 ul) ble tilsatt til 1 ml etylacetat i et rent rør, vortex-blandet i 5 minutter, og sentrifugert ved 5900 x
g
i 10 min. Etter sentrifugering ble det øvre organiske lag inneholdende etylacetat, overført til et nytt rør og inndampet til tørrhet under strømmende nitrogen. Det tørkede residuet ble rekonstituert med 50 pl av Milli-Q-vann (Millipore). En 20 pl alikvot av løsningen ble injisert på høyytelses væskekromatografi-ultrafiolett (HPLC-UV) deteksjonssystem.
Høy ytelse væskekromatografi
Kromatografisk analyse ble utført på en Model LC -20AT HPLC-system (Shimadzu, Tokyo, Japan) som er utstyrt med en Model SPD-20A bølgelengde UV-detektor, SIL-20ac autosampler, og en LC løsning databehandlingssystem. En LiChroCART RP-18e-kolonne (Purospher, 250 mm, 5 um, Merck, Darmstadt, Tyskland) med en LiChroCART 4-4 guard-kolonne ble benyttet for separering. Den mobile fasen besto 10 mM kaliumfosfat-metanol (99:1, v /v, pH 4,5 justert med 85% fosforsyre), og strømningshastigheten for den mobile fase var 1 ml /min. Detekteringsbølgelengden ble satt til 266 nm. Under disse betingelser er retensjonstiden for 5-FU var 5,4 min. Linearitet av kalibreringskurver ble demonstrert av de gode bestemmelses koeffisientene (
r
2) oppnådd for regresjonslinjen. God linearitet ble oppnådd over området 0,01-5 ug /ml, med alle koeffisientene korrelasjon som er større enn 0,998. Alle prøver ble ferskt fremstilt, inkludert den standard løsninger, fra den samme stamløsning (5 mg /ml). 0,01-ug /ml kvantifiseringsgrense ble definert den laveste konsentrasjonen på kalibreringskurven som kan måles rutinemessig med akseptabel skjevhet og relativ SD. Den totale midlere nøyaktighet, definert av den relative SD, varierte fra 0,2% til 11,0%. Analytisk nøyaktighet ble uttrykt som den prosentvise forskjell av middel observerte verdiene sammenlignet med kjente konsentrasjoner varierende fra -10,0% til 14,0%. Gjenopprettings resultater for konsentrasjoner av 0,1-10 mg /ml var 92,0% -94,0%
Evaluering av leverfunksjonen
Plasmanivåene av alaninaminotransferase (ALAT) ble målt for å sjekke påvirkning av ulike modaliteter for leverfunksjon ved en standard kolo metode med en Synkron LX20 spektrofotometer (Beckman Coulter) og produsent levert reagenser.
Serum cytokinanalyse
plasma~~POS=TRUNC nivåene~~POS=HEADCOMP av cytokiner (transformere vekstfaktor beta 1 (TGF-β1) og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α)) oppnådd fra museblodprøver ble analysert ved anvendelse av enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) (R &. D Systems) i henhold til produsentens instruksjoner
cytokin antistoff rekke
rotteplasmaprøver ble analysert ved hjelp av et cytokin antistoff array (RayBio® Mouse cytokin antistoff Arrays II, RayBiotech, Inc., Norcross, Ga.) i henhold til produsentens instruksjoner og som tidligere beskrevet [43] for å oppdage mulige mediatorer av 5-FU-RT interaksjon. Dette bestemte rekke oppdager samtidig 34 murine cytokiner. (Fig. 4) I korthet cytokin-array-membranene ble blokkert i 2 ml av 1 x blokkeringsbuffer i 30 min og deretter inkubert med 1 ml plasmaprøve ved romtemperatur i 1-2 timer. Prøvene ble deretter dekantert fra hver beholder, og membranene ble vasket tre ganger med 2 ml l x vaskebuffer I, etterfulgt av to vaskinger med 2 ml l x vaskebuffer II ved romtemperatur med risting. Membranene ble deretter inkubert i 1:250 fortynnede biotin-konjugert primære antistoffer ved romtemperatur i 1-2 timer og vasket som beskrevet ovenfor, før inkubering i 1:1000 fortynnet pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert streptavidin. Etter inkubering i HRP-konjugert streptavidin i 30-60 min, ble membranene vasket grundig og utsatt for et peroksid substrat (deteksjons buffere C og D, RayBiotech, Inc.) i 5 minutter i mørke før avbildning. Membraner ble deretter eksponert for røntgenfilm (Kodak X-OMAT AR film) ved romtemperatur i 1 minutt. Signal intensiteter ble analysert med Fuji Film Multi Gauge V2.1. Biotin-konjugert IgG fungert som en positiv kontroll på seks plasser, hvor det ble brukt til å identifisere membran orientering og å normalisere resultatene fra forskjellige membraner som ble sammenlignet. For hver flekk, ble netto optiske tetthet bestemmes ved å subtrahere bakgrunns optiske densitet fra den totale rå optisk tetthet, og den optiske densitet av hvert cytokin var representert som en prosentandel av den positive kontrollen.
Bestemmelse av intracellulær 5- FU nivåer med eller uten rekombinant MMP-8 ved høy-ytelses-væskekromatografi
for å undersøke effekten av MMP-8 på normale leverceller, en human hepatoblastoma-avledet cellelinje HepG2, ble brukt til å simulere normale leverceller i våre andre eksperimenter. Etter behandling med 10 ug /ml rekombinant MMP-8 pluss 50 uM 5-FU eller 50 uM 5-FU alene, HepG2 (human leverkreft cellelinje) celler ble samlet opp hvert 10. minutt inntil 60 minutter og vasket to ganger i fosfat-bufret saltvann (PBS), etterfulgt av sentrifugering ved 13000 rpm i 5 min. For å ekstrahere intracellulær 5-FU, et ekstraksjonstrinn oppløsning inneholdende 0,1% Triton X-100 i dimetylsulfoksyd ble tilsatt til cellepelletene, og denne suspensjonen ble vortex-blandet og sentrifugert at13000 rpm i 5 min. Den resulterende løsning ble blandet med et like stort volum acetonitril for deproteination. Proteinbunnfallet ble fjernet ved sentrifugering (13 000 rpm i 5 min), og en 20 ul alikvot av supernatanten ble underkastet høytrykks-væskekromatografi-analyse som nevnt før.
Mediator-inhibitor fremstilling og eksperiment
MMP-8 inhibitor i (Calbiochem, La Jolla, CA) ble administrert til rotter til å undersøke hvorvidt RT modulering av 5-FU farmakokinetiske parametre kan bli blokkert. I korthet, MMP-8-inhibitor I ble løst i PEG400 /etanol [4:01 (v /v)] oppløsning, hvilket ga en endelig konsentrasjon på 5 mg /ml. To timer før bestråling, 10 mg /kg av MMP-8-inhibitor I ble infusert inn i rottens halevenen i løpet av en 2-minutters periode. Deretter ble rottene bedøvet med uretan 1 g /ml og α-kloralose 0,1 g /ml (1 ml /kg ved intraperitoneal injeksjon), og ble immobilisert på et bord for å gjennomgå datatomografering for simulering av hele bekkenet felt og mottatt bestråling, slik som beskrevet tidligere. Forsøksdyrene ble randomisert til å få tak uten PEG400 /etanol [4:01 (v /v)] oppløsning (0 Gy), kontroll med oppløsningsmiddel (0 Gy), hele bekkenet bestråling (2 Gy) med oppløsningsmiddel og hele bekkenet bestråling (2- gy) med MMP-8-inhibitor og løsemiddelgruppene, respektivt. Etter RT humbug RT 20 timer, alle rottene fikk 5-FU (100 mg /kg) injeksjoner og de farmakokinetiske parametre av 5-FU ble analysert. Hver gruppe data ble samlet inn fra fire rotter.
Farmakokinetikk og dataanalyse
Farmakokinetiske parametere inkludert AUC for konsentrasjons, terminal eliminasjonsfase t
1/2, Cmax, MRT, total plasmaclearance og VSS ble beregnet ved hjelp av farmakokinetikken beregning programvare WinNonlin Standard Edition, versjon 1.1 (Scientific Consulting, Apex, NC, USA) ved hjelp av en kompartment metode.
Statistiske metoder
resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Forskjeller i estimat utfall mellom gruppene ble beregnet ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA), med post hoc multiple sammenligninger. Alle analyser ble utført ved hjelp av SPSS, versjon 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).
