Abstract
Bakgrunn
transposable elementer (tes) utgjør nesten 45% av hele genomet, og er en del av sofistikerte regulatoriske nettverk systemer som styrer utviklingsprosesser i normale og patologiske forhold. Den retrovirale /retrotransposon genet maskiner består hovedsakelig av Long ispedd Nuclear Elements (stilte med 1) and Human Endogene Retrovirus (HERVs) som koder for sin egen endogen revers transkriptase (RT). Interessant er RT typisk uttrykt i høye nivåer i kreftceller. Nyere studier rapporterer at RT hemming av ikke-nukleosid reverstranskriptasehemmere (NNRTI) induserer vekst arrest og celledifferensiering
in vitro Hotell og motvirker veksten av humane svulster i dyremodell. I denne studien analyserer vi anticancer aktivitet av abakavir (ABC), en nukleosid revers transkripsjon inhibitor (NRTI), på PC3 og LNCaP prostata kreft cellelinjer.
hovedfunnene
ABC reduserer cellevekst, migrasjon og invasjon prosesser, bremser betydelig S-fasen progresjon, induserer senescence og celledød i prostatakreftceller. I samsvar med disse observasjonene viser microarray analyse på PC3 celler som ABC induserer spesifikke og doseavhengige endringer i genuttrykk, som involverer flere cellulære veier. Spesielt ved kvantitativ Real-Time PCR fant vi at line en ORF1 og ORF2 mRNA nivåer var signifikant oppregulert ved ABC behandling.
Konklusjoner
Våre resultater viser potensialet i ABC som kreft middel i stand til å indusere antiproliferativ aktivitet og utløse senescence i prostatakreftceller. Verdt å merke seg, viser vi at ABC utløser oppregulering av LINE-1 uttrykk, noe som tyder på involvering av disse elementene i de observerte cellulære endringer
Citation. Carlini F, Ridolfi B, Molinari A, Parisi C, Bozzuto G , Toccacieli L, et al. (2010) revers transkripsjon Inhibitor Abacavir Viser Anticancer aktivitet i Prostate Cancer Cell Lines. PLoS ONE 5 (12): e14221. doi: 10,1371 /journal.pone.0014221
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 19 februar 2010; Godkjent: 15 november 2010; Publisert: 03.12.2010
Copyright: © 2010 Carlini et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av fra National Institute of Health i Roma (ISS), Ricerca Finalizzata 2004 Samarbeid program ISS /NIH-USA og Ricerca Corrente 2007-2008, ISS. Andre midler som er fra departementet for universitet og forskning, Regione Campania, Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) og doktorgradsprogrammer: «Pathology of Cell signaltransduksjon» (OMVG) av den andre University of Naples og «toksikologi, Onkologi og Molecular Pathology «ved Universitetet i Cagliari (MR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en kompleks sykdom og sin ekstreme fenotype variasjonen kan ikke uttømmende beskrevet og forklart utelukkende av gen-miljø interaksjoner. Uventet, fullføring av det humane genom avslører at den egentlige kompleksiteten av genomet har lite å gjøre med antallet og heterogenitet av dets gener.
bare 2% av de humane genom koder for proteiner, mens 45% består av transposable elementer (tes) [1]. TES, i utgangspunktet tenkt å være bare intracellulære parasitter, ble betegnet egoistisk eller «junk» DNA, inntil videre forskning avdekket hvordan denne enorme mengden av ikke-protein-kodende sekvenser skalerer opp med organismer kompleksitet, spiller en viktig rolle som en del av regulerings verktøykasse av genomet, ved å endre genekspresjon og kjøre genom evolusjon, så vel som utvikling av en organisme [2] – [10]. Tes kan deles inn i to hovedklasser: DNA-transposoner (2,8%) og retrotransposons (42,2%). DNA-transposoner forsterke uten en RNA mellomliggende, mens retrotransposons stole på en RNA transkripsjon som selv replikerer ved hjelp av en revers transkriptase (RT).
RTs kodet av Long ispedd Nuclear Element-en (LINE-1 ) and Human Retroviruses Endogene (HERVs) ble funnet å være assosiert med patologiske og fysiologiske prosesser. Spesielt ble høye ekspresjonsnivåer av RT funnet i kjønnsceller, embryo, udifferensierte og transformerte celler, mens i differensierte ikke-patologiske vev ble de knapt blir uttrykt, noe som tyder på en direkte korrelasjon med den proliferative potensial av cellen [11] – [17 ].
Tidligere studier har vist at en klasse av ikke-nukleosid RT-inhibitorer (NNRTI), mye brukt i AIDS-terapi, hemmer den endogene RT-aktivitet i et antall av murine og humane kreftcellelinjer, noe som reduserer celle veksthastighet og indusere differensiering [18] – [20]. Videre ble de samme biologiske virkninger er gjengitt i RNA forstyrrer eksperimenter med spesifikk
si
RNA rettet mot LINE-1 og Herv-K. Disse resultatene viser tydelig at begge klasser av retroelements er knyttet sammen i et funksjonelt nettverk, involvert i cellevekst og tumordannelse, men med tydelige hierarkiske roller, være LINE-en i stand til å kontrollere Herv-K uttrykk [21]. Disse studiene tyder på at endogen ikke-telomeric RT kan representere en roman mål i utviklingen av terapeutiske cytostatika.
NNRTIer binde seg til en hydrofob lomme, i nærheten av RT aktive området. Bindingen induserer en konformasjonsendring i proteinet, som påvirker dets affinitet for substratet og følgelig inhibering av RT-enzymatisk aktivitet. NNRTI er klassifisert som allosteriske ikke-konkurrerende RT hemmere.
En annen klasse av antiretrovirale hemmere som er rettet mot RT er representert ved de nukleosid revers transkripsjon (NRTIs). Sammenlignet med NNRTI, de har en annen virkningsmekanisme. Den NRTI er nukleotid-analoger som hemmer revers transkripsjon ved å bli innlemmet i de nylig syntetiserte virale DNA (cDNA) og hindre dens videre forlengelse. De er klassifisert som ikke-allosteriske konkurrerende substrat hemmere. Blant disse er Abacavir (ABC) med hell brukes i kombinasjon med andre antivirale medikamenter i behandlingen av HIV-infeksjon. Det omdannes ved cellulære enzymer til den aktive karbovir triphosphorilated form, en analog av dGTP. Med hensyn til andre NRTI, viser ABC en svært lav affinitet for cellulær DNA polymerase [22]. I tillegg har Jones et al. [23] demonstrert med en
in vitro
LINE-en retrotransposition analyse som NRTI har evnen til å undertrykke LINE-en retrotransposition, noe som indikerer i hvilken grad LINE-1 RT til denne klassen legemidler.
Basert på disse bevisene, har vi undersøkt antitumor aktivitet av ABC på hormonavhengig LNCaP og hormon-ildfast PC3 prostata kreft cellelinjer. Disse metastatiske celler er generelt antatt å representere tidlige og sene stadier av prostatakreft hhv. Inntil nå, representerer prostatakreft den vanligste noncutaneous kreft hos mennesker i USA [24]. Bærebjelken behandling er androgen ablasjon, men etter en innledende god respons sykdommen utvikler seg til hormon-refraktær prostata kreft [25]. Nye modaliteter terapi er nødvendig for å forebygge eller behandle dette mer dødelig form for prostatakreft.
Her vi vise at ABC induserer en signifikant reduksjon i celleveksthastighet og en forsinkelse av cellesyklusen i S-fasen. En høy andel av senescent celler ble observert, og mange av dem var forpliktet til døden. Noen timer med ABC eksponering betydelig redusert potensialet for migrasjon og invasjon i prostatakreftceller. Videre er en genom-bred ekspresjon analyse på PC3-celler viste en doseavhengig genregulering. Spesielt, ABC var i stand til å modulere LINE-1 uttrykk i begge cellelinjer.
Materialer og metoder
cellekulturer og behandlinger
Den menneskelige prostata kreft cellelinjer PC3 (ATCC CRL-1435) og LNCaP (ATCC CRL-1740) og den ikke-transformerte humane fibroblastcellelinje WI-38 (ATCC CCL-75) ble dyrket i henhold til ATCC anbefalinger. Abakavir ble renset fra kommersielt tilgjengelige Ziagen tabletter (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC 27709) av metanol ekstraksjon og rensing grad vurderes ved HPLC. For legemiddel eksperimenter ble ABC oppløst i FBS-fritt medium og anvendt ved en konsentrasjon på 15 og 150 uM. Medikament-inneholdende friskt medium ble skiftet hver 48 timer. For synkroniserings forsøkene ble cellene behandlet med 2 ug /ml aphidicholin i 18 timer, deretter vasket to ganger med PBS og frigjort i friskt medium, inneholdende eller ikke ABC.
RT Activity Assay
RT aktivitetsanalyser ble utført ved en mindre modifikasjon av metoden beskrevet av Mangiacasale et.al [18]. Celler (5 x 10
5-10
6) ble lysert i 40 ul iskald lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl
2, 1 mM EGTA, 0,1 mM PMSF , 5 mM β-merkaptoetanol, 0,5% CHAPS, 10% glyserol). Etter tre fryse-og-tine-sykluser, ble celler inkubert i 30 min på is og sentrifugert i 30 minutter ved 14 000 r.p.m. ved 4 ° C. RT-aktivitet ble testet ved anvendelse av en ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen) i 20 ul reaksjoner inneholdende 10 ng av MS2 fag-RNA (Roche Diagnostics) og 30 pmol av MS2 revers primer (se nedenfor) og erstatte kommersielt RT med cellefritt ekstrakt ( 24 ug totalt protein). Reaksjonsblandingene ble inkubert ved 55 ° C i 1 time, etterfulgt av 5 min ved 85 ° C. En 1 pl volum av
Escherichia coli
RNaseH (2 U /pl) ble tilsatt til hver prøve og ytterligere inkubert ved 37 ° C i 20 min. Kontroll reaksjoner ble satt opp ved å utelate celleekstrakt (negativ kontroll), eller legge til 1 mL av ThermoScript RT (Invitrogen) (15 U /mL, positiv kontroll). En 2 ul volum fra hver reaksjon ble blandet med 30 pmol hver av forover (5′-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3 «) og bakover (5′-CACAGGTCAAACCTCCTAGGAATG-3») MS2 primere og PCR-amplifisert ved hjelp av PCR platina SuperMix (Invitrogen). PCR-betingelsene var som følger: 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 sek. Amplifikasjonsproduktet er et 112-bp DNA-fragment som spenner over 21-132 posisjonerer ved 5 «enden av MS2 RNA (GenBank V00642). PCR-produktene ble fraksjonert ved 1,5% agarosegel-elektroforese.
Cell Proliferation Assay
PC3, LnCap og WI-38-celler ble sådd ut ved en tetthet på 20 000 per brønn i 12-brønners plater, kultivert i 24 timer og deretter behandlet med ABC ved en konsentrasjon på 15 og 150 uM. Ved 0, 24, 48, 72 og 96 h antall trypanblått-ekskluderende celler ble tellet i et Burker kammer. Eksperimentene ble utført tre ganger i tre eksemplarer.
Cell Cycle Analysis
behandlede og ubehandlede celler ble høstet ved trypsinering og vasket med iskald PBS. DNA farging ble utført ved hjelp av Cycle TEST ™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson). Cellene ble så analysert på et FACScan strømningscytometer (Becton 0,05 ble ansett som oppdages. Gener med Diff Score på ± 40 (p-verdi på 0,0001) ble vurdert som forskjellig uttrykt gener. Microarray data er MIAME kompatibel og rådata er blitt deponert i ArrayExpress database (https://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae), med Tiltredelse nummer. E-TABM-532
Oppfinnsomhet Pathway Analysis 7 (Oppfinnsomhet Systems®, www.ingenuity.com) ble brukt til å analysere biologiske forhold av forskjellig uttrykt gener. De biologiske funksjoner ble evaluert i henhold til instruksjonene i programvaren. Fishers eksakte test ble brukt til å beregne en p-verdi bestemme sannsynligheten for at hver biologiske funksjon tilordnet den datasettet er grunn til tilfeldighetene alene. En GO (Gene ontologi) berikelse analyse ble også utført med DAVID programvare [27], [28].
RT-analysen og Kvantifisering av LINE-1 mRNA uttrykk
Total RNA ble isolert fra celler ubehandlet og behandlet med 15 og 150 uM ABC fra 24 til 120 timer. RNA ble behandlet med DNase TURBO (Ambion) for å fjerne kontaminerende genomisk DNA. cDNA ble syntetisert av TaqMan High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (PE Applied Biosystems). Relativ kvantifisering PCR-reaksjoner ble utført med TaqMan kjemi. LINE-1 transkripsjoner ble oppdaget ved hjelp av tilpassede primere og FAM-MGB-prober for LINE-en ORF1 og ORF2 (PE Applied Biosystems), utviklet ved hjelp av Grunning Express-programvaren (tabell S1). LINE-en sekvens database som brukes i dette arbeidet er L1base (https://l1base.molgen.mpg.de) [29]. Antallet LINE-1 sekvenser målrettet av sonder er rapportert i tabell S1. Hver reaksjon ble utført i et endelig volum på 25 ul inneholdende 1 pl cDNA og 12,5 ul av TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Amplifikasjoner ble utført som starter med en 2 min aktiveringstrinn for Amperase UNG ved 50 ° C, 10 min mal denatureringstrinn ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 15s og 60 ° C i 1 min. Pre-utviklet TaqMan Assay Reagent for GAPDH (4310884E) ble anvendt som endogene kontroll. Fravær av forsterkning fra ikke-revers-transkribert RNA ble bekreftet å utelukke genomisk DNA forsterkning. Forskjeller i genuttrykk ble beregnet ved standard 2
-ΔΔCt metode. For den statistiske analysen Student t test ble brukt.
Resultater
Abacavir hemmer cellevekst, påvirker cellesyklusprogresjon og induserer senescence i prostata kreft cellelinjer
Først, vi evaluert endogen RT aktivitet i menneskelige prostata kreft celler og i ikke-transformerte WI-38 kontrollceller. Cellene ekstraktene ble anvendt som RT kilde til reverse transkribere en syntetisk RNA. Som vist i figur 1A, ble RT-aktivitet funnet i PC3 og LNCaP-celler, mens i WI-38-celler RT-aktivitet var på et upåviselig nivå.
(A) Endogen RT-aktivitet ble detektert i PC3, LNCaP og WI -38-celler som beskrevet i materiale og metoder; (+) Positiv kontroll reaksjon med kommersiell RT. (B) prostata cancer og normal human fibroblast WI-38-celler ble behandlet med ABC ved en konsentrasjon på 15 og 150 uM og dyrket ved de indikerte tidspunkter. Dataene som vises, er representative for minst tre uavhengige eksperimenter; barer, ± SD.
For å analysere effekten av ABC på celleproliferasjon hastighet,-celler ble dyrket i nærvær av stoffet i konsentrasjoner på 15 og 150 uM. En veksthemming doseavhengig ble observert i begge cellelinjer (figur 1B). Ved 15 uM ABC en betydelig reduksjon i cellevekst ble åpenbart etter 72 og 96 timer med behandling i PC3 og LNCaP respektivt. Den 150 mikrometer konsentrasjon sterkt hemmet veksten i begge cellelinjer (figur 1B). Den cytotoksisitet av ABC ble også undersøkt i ikke-transformerte WI-38 celler. Interessant, vi fant ikke signifikant reduksjon av cellevekst med 15 mikrometer ABC mens 150 mikrometer ABC konsentrasjon indusert bare 20% av celleveksthemming etter 120 timer (Figur 1b).
For å undersøke om ABC kunne påvirke cellesyklusutvikling, ble prostatakreftceller behandlet med 150 uM ABC og analysert ved forskjellige tidspunkter opptil 120 timer. I PC3-celler en meget høy akkumulering av celler i S-fasen ble sett etter 18 og 24 timer fra behandlingen (56,3 og 78,6% henholdsvis). Denne økningen ble etterfulgt av en augmentasjonen av G2 /M-celler som ble 23,4 til 26,9% av den totale populasjon på 96 og 120 timers behandling (Figur 2A, B). LnCap behandlede celler viste hovedsakelig en S-fasen opphopning nådde 40,5 til 54,3% etter 48 og 72 timers behandling, men ingen G2 /M fase økning ble observert. Snarere virker i S-fasen opphopning å holde seg konstant over tid (figur 2A). For ytterligere å karakterisere S-fasen endring, ble cellene synkronisert på begynnelsen av S-fasen ved å utsette dem for DNA-syntese inhibitor aphidicholin. Etter frigjøring fra aphidicholin blokken, ble cellene behandlet med 150 uM ABC og analysert med hensyn på cellesyklusfordeling ved forskjellige tidspunkter. Figur 2C, viser at 3 timer etter frigjøring begge synkroniserte kontrollcellene hadde beveget seg mot midten S-fasen, representert ved den sentrale toppen av diagrammet, mens ABC-behandlede celler viste en tydelig forsinket progresjon gjennom S-fasen. Etter 18 timer, en stor mengde av PC3 behandlede celler var fremdeles til stede i slutten av S- og G2 /M fase, mens LNCaP, som forventet, viste en tendens til å akkumulere i S-fasen (Figur 2C). Verdt å merke seg, ABC var i stand til å forlenge S-fasen progresjon også hvis det legges i midten S-fasen, 3 timer etter aphidicholin blokk frigjøring (data ikke vist). Alt sammen disse data støtter hypotesen om at ABC kunne påvirke spesifikt DNA-replikasjon.
(A) Celle syklus fordeling av PC3 og LNCaP-celler eksponert for 150 uM ABC. Celler ble høstet ved de indikerte tidspunkter, inkubert med propidiumjodid og DNA-innhold ble analysert ved flow-cytometri. Prosentandelen av celler i hver fase er rapportert. (ND, ikke gjort). Dataene er representative for fem uavhengige eksperimenter. (B) Et representativt forsøk av cellesyklusutvikling i PC3 behandlede celler. Pilene angir celle akkumulering ved G2 /M-fasen. (C) PC3 og LNCaP celler ble synkronisert tidlig i S-fasen av aphidicholin og cellesyklusfordeling ble analysert i behandlede (150 mikrometer ABC) og ubehandlede celler.
Sammen med spredning hemming, en betydelig økning av celledød i løpet av en periode på 6 dager, ble observert med 150 uM ABC (figur 3A, B). For å evaluere hvorvidt disse fenomenene var assosiert med apoptose-induksjon eller begynnende alderdom, prostatakreftceller ble behandlet med 150 uM ABC i 5 dager og undersøkt hver 24 timer for annexin eksternalisering, nukleær kondensasjon /fragmentering og ß-galaktosidase-aktivitet ved pH 6. Ingen signifikant økning av annexin-positive celler eller apoptotiske kjerner ble observert i behandlede prøver som helst punkt (data ikke vist), mens senescens forbindelse ß-galaktosidase-aktivitet ble betydelig indusert ved ABC og økte med tiden, og nådde omtrent 80% og 50% av positive celler på 5 dager etter behandling i henholdsvis PC3 og LNCaP (figur 3C, D). Videre, en sammenligning mellom celle alderdom og celledød kinetikk tyder på at de to fenomener er sterkt forbundet. Tvert imot, vi ikke observere celledød eller forskjeller i senescence nivå i WI-38 kontrollceller behandlet med 150 mikrometer ABC, sammenlignet med ubehandlede celler (data ikke vist).
(A og B) 5 × 10
4 celler ble sådd i 12-brønners plater med 150 uM ABC. Etter 0, 2, 4 og 6 dager adherente og flytende celler ble høstet og resuspendert i kulturmedium inneholdende 0,2% trypanblått for telling av levedyktige celler og død. (C og D) ß-galaktosidase-aktivitet ble evaluert i PC3 og LNCaP-celler ble behandlet med 150 uM ABC og analysert ved forskjellige tidspunkter.
morfologiske endringer av PC3 behandlede celler
PC3 cellene ble videre analysert ved morfologisk nivå. Ifølge cellesyklus endring og begynnende alderdom induksjon, ble det observert flere celle morfologiske endringer etter eksponering for legemiddel ved begge doser. Ved skanning elektronmikroskopi PC3 celler behandlet med 15 mikrometer ABC vises allerede en flatere form (figur 4A a, d) og en hindring i divisjon prosessen etter 48 timers eksponering (figur 4A b, e). I tillegg behandlede PC3-celler viser tap av overflate mikrovilli som tyder på en virkning av stoffet på cytoskjelettet organisasjon (figur 4A c, f). På atomnivå, understreker morfologisk analyse nærvær av bilobate og forstørrede kjerner, med en økning av kjerneområdet bli tydelig etter 48 timer inkubering med 15 uM ABC og 24 timer etter behandling med 150 uM ABC (figur 4B). Morfometriske og statistiske analyser indikerte at atom områder omtrent fordoblet i 48 timer med 150 mikrometer ABC (tabell S2). På nukleolært nivå betydelig struktur modifikasjoner ble funnet i celler eksponert i 72 timer for begge ABC doser. Videre, PC3-celler behandlet nucleoli virke mindre kompakt og i noen tilfelle spredt i forhold til kontroll (figur 4C).
(A) SEM-bilde illustrerer modifikasjonen oppstår i PC3-celler behandlet med 15 uM ABC ved 48 timer. (B) Morfologiske endringer og morfometrisk analyse av kjernene farget med Hoechst. Doser og tidspunkter er indikert. (C) Immunofluorescensanalyse av nucleoli farget med anti-kjerne humant serum.
Abacavir hemmer migrasjon og invasjon
Siden PC3 og LNCaP cellene er av metastatisk opprinnelse og har en trekkfugl og invasivitet potensial undersøkte vi effekten av ABC på motilitet og invasjons prosesser. Celler ble sådd ut i Transwell kamrene i nærvær eller fravær av 15 eller 150 uM ABC, og tillatt å migrere i 18 timer ved 37 ° C. En doseavhengig reduksjon av det areal som opptas av migrering og invasjon av celler ble observert etter ABC-behandling (figur 5A, B). Cellemigrasjon ble betydelig redusert i prostatakreftceller 15 og 150 um ABC doser (p 0,001). Matrigel celle invasjon ble betydelig inhibert bare ved den høyere ABC-dose (figur 5B).
PC3 og LNCaP-celler ble sådd på membranen i nærvær eller fravær av Matrigel og inkubert med 15 og 150 uM ABC i 18 timer. (A) representant bilde av trekkende og invadere PC3 celler farget med krystallfiolett. (B) Prosent av migrasjon og invasjon redusere hensyn til ubehandlede celler analysert ved Optilab programvare. (*) Tilsvarer p. 0,001, beregnet av Mann-Whitney test
Gene Expression Modification indusert av Abacavir i PC3 behandlede celler
I forsøket på å finne en genekspresjon signatur bak de morfologiske og funksjonelle endringer observert i ABC behandlet PC3 celler, fire biologiske replikater av både behandlede og kontrollceller ble analysert på en Illumina microarray plattform 48 timer etter behandling.
Analyse av microarray data viste at 192 gener ut fra 12 605 detekteres og 3246 ut fra 12 930, ble uttrykt forskjellig (p 0,0001). ved 15 og henholdsvis 150 pM ABC konsentrasjoner, hvorav de fleste resulterte oppregulert (figur 6A og Tabell S3)
(A) Oppsummering diagram av de uttrykte og forskjellig uttrykt gen tall som følge av mikromatriseanalyse (fire biologiske replikater for hver tilstand). (B) Sammenligning av de topp-ti biologiske funksjoner ved 15 og 150 mikrometer ABC innhentet av IPA analyse. På y-aksen den statistiske signifikans, uttrykkes som -log /p-verdi, er rapportert. Terskel p-verdi = 0,05 (gul linje). Antallet av de involverte i hver funksjon gener er rapportert på toppen av hver stolpe. (C) Venn-diagram som viser brøkdel av felles gener forskjellig uttrykt i PC3 cellene ved 15 og 150 mikrometer ABC.
En funksjon analyse av forskjellig uttrykte gener ble utført ved hjelp av oppfinnsomhet Pathways Analysis (IPA) system (Figur 6B). Interessant, viser komparativ analyse av topp-ti biologiske funksjoner som de viktigste cellulære funksjoner som påvirkes av behandlingen var den samme for de to konsentrasjoner, noe som indikerer en spesifikk og doseavhengig effekt av legemidlet. De som er beskrevet i figur 6B funksjoner er konsistent og representative for både morfologiske og funksjonelle forandringer observert ved fenotypisk nivå: utvinning av celledødsveier, endringer av cellesyklus og proliferasjon, endringer i cellulær morfologi. Andre vesentlig påvirket funksjoner var «RNA Post-Transkripsjon Modifikasjoner», «Gene Expression» og «DNA replikering, rekombinasjon og reparasjon». Gener gruppert i de ulike funksjonene er listet opp i tabell S4.
Datasettene som oppnås på to doser ble suksessivt sammenlignet i et Venn-diagram og 144 gener resulterte skal deles mellom de to listene (figur 6C, tabell S5 ). Blant dem var den mest representert Gene ontologi (GO) termer identifiseres ved hjelp av DAVID «Functional merknad Chart» verktøy inkludert de tre kategorier: biologiske prosesser, cellulære komponenter og molekylære funksjoner. Funksjonelle merknads klynger ble identifisert for hver kategori, med berikelse score spenner 1,33 til 8,63 (tabell 1). Interessant, GO «Cellular Component» kategorien identifisert 20 gener som hører til de kjernefysiske avdelinger og spesielt til atom del, kromatin remodeling komplekse og kromosom vilkår (tabell 2).
Abacavir modulerer LINE -1 mRNA uttrykk
på grunn av bevis som støtter en sammenheng mellom RT aktivitet, LINE-1 uttrykk og kreftcelle omprogrammering [18] – [21], bestemte vi oss for å undersøke ABC effekt på uttrykk for denne klassen av retrotransposons. Nærmere bestemt, LINE-1 består av en 5 «UTR (ikke-translaterte region), to åpne leserammer (ORF1 og ORF2) og en 3» UTR som ender i en poly (A) hale. ORF1 koder for et protein med RNA-bindingskapasitet mens ORF2 koder for et protein med endonuklease og revers transkriptase funksjoner [7]. CDNA hentet fra prostata kreft celler, ubehandlet og behandlet med de to ABC doser og høstet ved 24, 48, 72, 96 og 120 timer, ble forsterket av Real-Time PCR med primere og prober som gjenkjenner konserverte regioner av LINE-en ORF1 og ORF2 sekvensene. Som vist i figur 7, ble en dose- og tidsavhengig økning i mRNA-ekspresjonsnivået observert enten i PC3 og LNCaP-celler for både ORF1 og ORF2 transkripter, noe som indikerer at LINE-1 kan spille en rolle i de molekylære og funksjonelle forandringer observert på ABC behandling.
relative nivåer av LINE-1 mRNA transkripter (ORF1 og ORF2) i PC3 og LNCaP celler behandlet med 15 og 150 mikrometer ABC ved ulike tidspunkt. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. De (*) og (**) symbolene angir en signifikant forskjell sammenlignet med ubehandlede celler, med ap verdi 0,05 og. 0,01 henholdsvis
Diskusjoner
Et stort antall av bevis har bekreftet sammenhengen mellom høyt nivå av endogen RT uttrykk og forvandlet /tumor cellefenotyp [11], [17]. Tidligere studier med allosteriske RT-inhibitorer, NNRTI, antyder at LINE-1-kodede RT kan betraktes som en ny molekylære mål i cancerterapi.
I dette arbeidet viser at det er antitumoraktivitet av Abacavir, en nukleosid revers transkripsjon inhibitor (NRTI) på PC3 og LNCaP menneskelige prostata cellelinjer av metastatisk opprinnelse. Videre rapporterer vi for første gang at ABC behandling kan modulere LINE-1 mRNA uttrykk.
ABC betydelig redusert cellevekst, indusere en forsinkelse i cellesyklus S fase progresjon i prostatakreftceller. Dette tregere fører til en påfølgende arrest i G2 /M fase i PC3 cellene mens LNCaP celler akkumuleres i S-fasen. Effekten på cellesyklus ble klart noen timer etter behandling og celler gradvis inn i en tilstand av begynnende alderdom. Utseendet til senescence-assosierte morfologiske endringer og SA-β-gal ekspresjon økes gradvis i PC3 og LNCaP-celler nådde 80% og 50% henholdsvis i 5 dager med påfølgende celledød.
i kontrasttumorcellemigrering og invasjon er et sentralt tema i prostatakreft. Det er velkjent at tilstedeværelse av metastase reduserer pasientens sannsynligheten for overlevelse og at behandlingstilbud tilgjengelige er sjelden i stand til å kurere metastatisk former. Her rapporterer vi at sammen med effekt på cellesyklus, svekker ABC invasjon og migrasjon potensialet i PC3 og LNCaP celler.
Basert på genuttrykk profiler av PC3 cellene, gir vi foreløpige innsikt i forholdet mellom ABC behandling
