Abstract
Lungekreft eller lunge carcinoma stammer i hovedsak fra epitelceller som er tynne og linje på alveolar overflater av lungene for gassutveksling. ANO1 /TMEM16A, først identifisert fra luftveis epitelceller, er medlem av Ca
2 + -aktiverte Cl
– kanaler (CaCCs) som funksjon å regulere epithelial sekresjon og cellevolumet for vedlikehold av ion og vev homeostase. ANO1 /TMEM16A har nylig blitt vist å være sterkt uttrykt i flere epitel opprinnelse karsinomer. Imidlertid er rollen til ANO1 i lungekreft er ukjent. I denne studien viser vi at inhibering av kalsium-aktiverte klorid kanal ANO1 /TMEM16A hemmer tumorvekst og invasjon i human lungekreft. ANO1 blir oppregulert i forskjellige humane lungecancercellelinjer. Knocking ned ANO1 av små hårnål RNA hemmet spredning, migrasjon og invasjon av GLC82 og NCI-H520 avbryte celler evaluert av CCK-8, ville-healing, transwell og 3D myke agar analyser. ANO1 protein er overuttrykt i 77,3% tilfeller av human lunge adenokarsinom vev oppdaget av immunhistokjemi. Videre tumorvekst i nakne mus implantert med GLC82 celler ble signifikant undertrykt av ANO1 demping. Til sammen våre funn gi bevis på at ANO1 overekspresjon bidrar til tumorvekst og invasjon av lungekreft; og undertrykke ANO1 overekspresjon kan ha terapeutisk potensial i lungekreft terapi
Citation. Jia L, Liu W, Guan L, Lu M, Wang K (2015) Hemming av kalsiumaktiverte Chloride Kanal ANO1 /TMEM16A undertrykker Tumor vekst og invasjon i human lungekreft. PLoS ONE 10 (8): e0136584. doi: 10,1371 /journal.pone.0136584
Redaktør: Shang-Zhong Xu, Universitetet i Hull, Storbritannia
mottatt: 28 april 2015; Godkjent: 05.08.2015; Publisert: 25 august 2015
Copyright: © 2015 Jia et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler til KWW fra departementet for vitenskap og teknologi i Kina (2013CB531302 og 2014ZX09507003-006-004) og Science Foundation of China National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft eller lunge carcinoma som stammer fra epitelceller er generelt kategorisert i småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Som den vanligste typen lungekreft, NSCLC står for 84% av de estimerte tilfeller med to store undergrupper: adenokarsinom og plateepitelkarsinom [1]. I dag er den patogenese og utviklingen av lunge cancer er ikke klart definert. Økende bevis indikerer at ionekanaler spiller en betydelig rolle i kreftcelleformering og invasjon, og i kjøre kreft progresjon i det hele tatt forskjellige stadier [2, 3].
ionekanaler er vannfylte porer og transmembranproteiner til stede i alle levende celler, delta i ulike fysiologiske aktiviteter integrert i oppstemthet, sammentrekning, sekresjon, cellesyklus og metastatisk kaskader [4, 5]. Normal uttrykk for ionekanaler er avgjørende for å opprettholde Ca
2 + og vev homeostase under cellulær proliferasjon og differensiering gjennom styrende cellulære ion fluks, regulerer cellevolumet, og genererer membranpotensiale [6, 7]. Klorid kanaler er viktig for mange biologiske prosesser, inkludert transepitelial transport for ion fluks, cellevolumregulering, differensiering og apoptose [8, 9]. Stabil og konstant cellevolumet og ion-homeostase i løpet av celleproliferasjon og differensiering er strengt nødvendig for cellefunksjon og overlevelse [10, 11]. Klorid fluks gjennom klorid kanaler i respons til celle svelling er en av de kritiske mekanismer ved hvilke celler gjenopprette deres volum følgende osmotiske forstyrrelser og stress forårsaket av intensive metabolske aktiviteter resulterte fra vann, nonelectrolyte og ionebytting på epiteliale overflatene [12-14]. Feilregulering av ionekanal uttrykket blir epigenetiske unormal i metastatiske kreftceller [15-17]. For eksempel er oppregulering av klorid intracellulær kanal 1 (CLlC1) involvert i tykktarm kreft celle migrasjon og invasjon gjennom formidling regulatoriske volum reduksjon (RVD) mekanisme [18]; og overekspresjon av klorid channel3 (ClC3) bidrar til flere humane karsinomer slik som gliom, lunge, bryst, og cervical tumorer [19]. Det har også blitt rapportert at en økning i intracellulært kalsium som opptrer under hypoton utfordring er knyttet til RVD og involvert i kreft apoptose, hvilket indikerer samspillet mellom kalsium homeostase og volum homeostase [20, 21].
Ca
2 + -aktiverte Cl
– kanaler (CaCCs) er viktige regulatorer av epitel sekresjon og cellevolum regulering [22, 23]. TMEM16A, også kjent som DOG1, ORAOV2, eller TAOS-2, ble identifisert fra luftveis epitelceller som en bona fide CACC som formidler endogen Ca
2 + -aktiverte klorid strøm [24-26]. TMEM16A har også blitt referert til som anoctamin 1 (ANO1) på grunn av dets anion selektivitet og åtte (OCT) transmembransegmenter [25].
ANO1 /TMEM16A
-genet er lokalisert på 11q13, en av de mest hyppig forsterkede områder i humane cancere [27, 28] og forbundet med en dårlig prognose [29]. Det har nylig blitt vist at ANO1 /TMEM16A forsterkes eller overuttrykt i flere humane kreftformer som gastrointestinal stromal tumor (GIST), prostatakreft, hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC), brystkreft og tykktarmskreftceller [27, 30- 33]. ANO1 overekspresjon er også korrelert med dårlig prognose av HNSCC og brystkreftpasienter [30, 34], og farmakologisk hemming av CACC ANO1 aktivitet ved CaCCinh-A01 og T16Ainh-A01 kan hemme kreft celle spredning [32, 35, 36]. Selv om grunnen for høy ekspresjon av ANO1 i tumorer er uklar, har flere studier vist at ANO1 er involvert i onkogene signalisering ved å aktivere EGFR og CAMK veier å fremme cellesyklusprogresjon og kreft [30, 37]. Det har blitt rapportert at ANO1-samspill proteiner som signal /stillas aktin-bindende regulatoriske proteiner ezrin, radixin, moesin, og RhoA kan delta i reguleringen av ANO1 funksjon [38, 39]. Mer nylig, ANO1 og EGFR er funnet å danne en funksjonell kompleks som regulerer HNSCC celleproliferasjon [40]. Men om ANO1 /TMEM16A spiller en rolle i tumor tilblivelsen av lungekreft er fortsatt ukjent.
I denne studien fant vi at CACC ANO1 er sterkt oppregulert i humane lungekreft vev. ANO1 oppregulering ble bekreftet i forskjellige humane lungecancercellelinjer. Knockdown av ANO1 uttrykk av kort hårnål RNA hemmet cellulær proliferasjon, migrasjon og invasjon i lungekreftceller GLC82 og NCI-H520. Inhibering av ANO1 også undertrykkes tumorvekst i nakne mus implantert med stabilt transfektert GLC82 celler. Våre funn gir holdepunkter for at membranen ANO1 protein kan tjene som en potensiell biomarkør og mål for diagnostisering og behandling av lungekreft.
Metoder
Cell kultur
Normal lungecellelinje 2BS , lungekreftcellelinjer A549 og H1299 var gaver fra Dr. Hongti Jia ved Institutt for biokjemi og molekylærbiologi, Peking University Health Science Center. A549 og H1299-celler ble opprinnelig oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). 2BS celler ble opprinnelig hentet fra National Institute of Biological Products (Beijing, Kina). Lungekreft cellelinjer GLC82 og Calu-3 for adenokarsinom og NCI-H520 for plateepitelkarsinom ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). De 2BS Cellene ble dyrket i DMEM (Invitrogen, Carlsbad, USA), og de andre cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen). Mediet ble supplert med 10% føtalt kalveserum og 1% penicillin-streptomycin. Alle celler ble opprettholdt i medium ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
shRNA transfeksjoner og generering av stabile cellelinjer
ANO1 shRNAs og egge shRNA plasmider var konstruert av GeneChem Co., Ltd (Shanghai, Kina). Den shRNAs ble klonet inn i BamHI og Hindlll setene på pGCsi-U6 /Neo /GFP vecor, og sløyfen sekvensen ved TTCAAGAGA ble anvendt. Målet sekvens av tre ANO1 shRNAs var som følger: shRNA1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA; shRNA2, GCATCTATTTGACTTGTCT; shRNA3, CGAAGAAGATGTACCACAT. Kryptert sekvensen var CGAGTGGTCTAGTTGAGAA. For transfeksjon, ble 8 ug DNA pr 60 mm skål med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner, og transfeksjon ble mediet erstattet med dyrkingsmedium i 4 timer etter transfeksjon. Alle etterfølgende eksperimenter ble utført ved 48-72 timer etter transfeksjon og gjentatt i triplikat. For å generere stabil GLC82 cellelinje som uttrykker ANO1 shRNA ble transfekterte celler valgt under 800 mikrogram /ml G418.
Immunhistokjemisk farging
Kirurgisk resected menneskelige kreft vevsprøver som består av 44 tilfeller av lunge adenokarsinom og 40 tilfeller av plateepitelkarsinom lungekreft ble innhentet retrospektivt fra Peking University Third Hospital. Vevsprøver var fullt avidentifisert før tilgang av oss og alle pasientene ble informert og samtykket til bruk av deres utskåret vev for fremtidig forskning. Vevssnittene ble inkubert i et 60 ° C tørt kammer i en time før de-paraffinized i xylen tre ganger og hydrert gjennom en gradert serie av etanol. Behandlet i 3% hydrogenperoksid i 10 minutter, ble vevene deretter kokt i 10 mM citrat-antigen henting løsning (pH 6,0) i 20 minutter ved bruk av en mikrobølgeovn. Immunhistokjemisk (IHC) farging ble utført ved å inkubere vevene med det primære antistoff til ANO1 (1: 100; ab53212, Abcam) ved 4 ° C over natten. Etter inkubering av vev med geit-anti-kanin-IgG-HRP i 30 minutter ved 37 ° C, ble DAB kromogen system anvendt for visualisering. Skår ble beregnet ved å multiplisere den intensitet (heltall mellom 0 og 3).
Western blot-analyse
Cellene ble vasket tre ganger i iskald fosfat-bufferoppløsning og lysert i RIPA-buffer med en X Halt fosfatase og proteasehemmere cocktails (Pierce, Rockford, IL). Prøvene ble kvantifisert ved anvendelse av en BCA proteinanalysesett (Thermo Scientific, USA). Like mengder av protein (50 pg) ble separert ved anvendelse av PAGE (8%) og overført til nitrocellulosemembraner. Etter blokkert med Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 5% melk, ble blotting membranen inkubert over natten ved 4 ° C med kanin-anti-ANO1 (1: 1000; Abcam) og kanin-anti -β-aktin (1: 500; i Santa Cruz, California). Membranen ble inkubert med et anti-kanin IgG-HRP-sekundært antistoff (1: 5000, Santa Cruz) i en time ved romtemperatur, og visualisert ved hjelp av Immobilon Vest-HRP-substrat
CCK8 celleproliferasjonsanalyse
.
Celleproliferering ble målt med Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Japan). 500 celler per brønn, ble inokulert i 96-brønners plater. 10 ul av celletelling Kit-løsning ble tilsatt i hver brønn ved 24, 48, 72 og 96 timer etter seeded. Deretter 96-brønners plater ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C før den optiske tetthet (OD) ble målt ved 450 nm med en mikroplateleser.
kolonidannelse assay i kultur
For kolonidannelse i kultur, transfekterte celler (behandlet med 800 ug /ml G418 i 2 dager etter 48 timer etter transfeksjon) ble platet på 200 celler per brønn i 6-brønns plater og inkubert i RPMI-1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum i 12-15 dager. De gjenværende kolonier ble farget med 0,1% krystallfiolett og tellet, og bilder ble tatt etter farging.
myk agar-kolonidannelsesbestemmelsen
kolonidannelse assay i bløt agar ble utført i en 6- brønns plate. Basislaget ble laget ved å blande 1,2% agarose (Invitrogen) og tilsvarende volum av 2 x medium med 20% FBS. Deretter celler fra hver gruppe ble høstet og suspendert i medium inneholdende 0,4% agarose og belagt over basislaget i triplikat ved en tetthet på 3000 celler per brønn. Etter 30 dager ble klonene observert tilsynelatende og cellene ble avkjølt i fire timer, og deretter farget med 0,02% krystallfiolett. Bilder ble tatt etter farging.
sårhelende analysen
For å måle migrering aktivitet, celler ble inokulert i seks-brønns plater, vokst til 90% samløpet i RPMI-1640 medium som inneholder 10% føtalt bovint serum. Deretter ble cellene sultet ved å endre mediet til serumfritt RPMI-1640 og dyrket i 24 timer. Cellene ble skrapet med 100 ul pipettespisser plast og vasket med fosfatbufferoppløsning. Bilder ble samlet hver 24. time med en omvendt fase kontrast mikroskop (Olympus, forstørrelse: 10 ×). Forholdet mellom den gjenværende sårareal ble beregnet i forhold til den opprinnelige sårområdet og normalisert til egge shRNA gruppe eller DMSO gruppe.
Transwell assay
celle invasjon aktivitet ble evaluert i 8,0 um porestørrelse transwell 24-lagsplate kamre (Corning, Acton, MA, USA) belagt med BioCoatMatrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Etter pre-sultet i 24 timer ved dyrking i serumfritt medium, 3×10
4 (NCI-H520) eller 5×10
4 (GLC82) celler per brønn ble sådd ut i de øvre kamre med serumfritt medium og inkuberes i 48 (NCI-H520) eller 72 (GLC82) timer. De nedre kammer ble fylt med 10% føtalt bovint serum medium. Etter å tørke cellene ut fra den øvre side av det øvre kammer, er den nedre side av det øvre kammer fiksert med metanol og farget med 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; Sigma). Bilder ble fotografert i henhold mikroskop. Den DAPI flekker i nedre kammer var normalisert til egge shRNA gruppe eller DMSO gruppe, noe som indikerer dens relative invasivitet.
In vivo
xenograft tumorvekst
Kjøpt fra Institutt av Forsøksdyr Science of Peking University Health Science Center, ble 5-uker gamle Balb /c nu /nu mus karantene i en uke før de settes i studien. Dyr (8 dyr per bur) ble plassert i microisolat med fri tilgang til standard gnager chow og vann under tempererte forhold (23 ± 2 ° C) ved 70% luftfuktighet [33]. Dyrene ble opprettholdt på en omvendt 12 h /12 h lys /mørke syklus (lys på på 7:00). Dyret eksperimentelle protokollene ble godkjent av Animal bruk og vedlikehold Committee of Peking University og var i samsvar med de etiske retningslinjene. GLC82 stabile celler (1 x 10
7 celler per mus) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). GLC82-celler ble transfektert med egge shRNA, ANO1 shRNA1 og ANO1 shRNA2, henholdsvis, og er valgt av G418 i to uker før bruk. GLC82 celler ble inokulert hypodermically inn i de riktige forlemmene til de nakne mus, og i hver gruppe åtte dyr ble anvendt. På den syvende dagen etter injeksjonen ble tumorstørrelsene målt hver 2-4 dag i en periode på 2 uker, og blir beregnet ved (L x W
2) /2 (V og W representerer den lengste langsgående og tverrgående diameter, respektivt ). Endepunktet av forsøkene var på den 19. dagen etter injeksjon av GLC82 celler til å sørge for at tumormasse ikke signifikant forstyrrer normale kroppsfunksjoner av mus eller forårsake smerte. Mus ble avlivet ved intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (120 mg /kg) kombinert med 0,25% lidokain før tumorer ble fjernet. Representative bildene ble innhentet før svulstene ble veid ved hjelp av en elektronisk balanse.
Statistisk analyse
GraphPad Prism 5 ble brukt til å analysere data. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. Student «s
t
-test ble anvendt i dataanalysen av cellulære forsøk mellom to grupper. Den ANOVA ble anvendt for å analysere nivåene av protein ANO1 i flere cellelinjer, og for å sammenligne forskjellen i tumorvekst. For analyse av menneskelige patologisk vev samlinger ble Chi-kvadrat test utført. Verdien av
P
. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Overuttrykte ANO1 i menneskelige lunge adenokarsinom vev
For å undersøke uttrykk nivå av kalsium-aktiverte klorid kanal ANO1 proteiner, brukte vi ANO1 antistoff for immunhistokjemisk farging og oppdaget ANO1 uttrykk i lunge patologisk vevsprøver fra 84 pasienter. Som vist i figur 1, ble ANO1 protein sterkt uttrykt i adenocarcinom i lungene, mens vev fra godartet alveolene i tilknytning til karsinom og squamous cell carcinoma viste negativ farging av ANO1. Analysen av immunhistokjemisk farging viste at ANO1 protein ekspresjon var positiv i 34 av 44 (77,3%) humant lunge adenokarsinom vevsprøver (Tabell 1). I vevsprøver fra plateepitel lungekreft, ble seks av 40 (15%) farget ANO1 positive. Disse resultatene indikerer at ANO1 protein er overuttrykt i tumorgenese av human lungekreft og i særdeleshet, lunge adenokarsinom.
(A) Benign alveolene i tilknytning til karsinom som viser negativ ANO1 farging. (B) Squamous celle lungekreft viser negativ ANO1 farging. (C) humant lunge adenokarsinom kreftvev viser ANO1 farging (brun farge) av neoplastisk epitel. Målestokken viser 50 mikrometer.
oppregulering av ANO1 uttrykk i humane lungekreftcellelinjer
Ved hjelp av immunhistokjemi, vår første funn viste at ANO1 ble overuttrykt i menneskelig lungekreft vev, spesielt i adenokarsinom. For å bekrefte immunhistokjemiske funn og avgjøre om ANO1 er også oppregulert i ulike patologiske typer lungekreft cellelinjer, vi valgte og testet 6 forskjellige cellelinjer som inkluderer 2BS celler for normal menneskelig lungecellelinje, GLC82 og Calu-3 celler for adenokarsinom , NCI-H520 celler for plateepitelkarsinom, og A549 og H1299 celler for ubekreftet type lungekreft (fig 2). Proteiner ekstrahert fra 2BS, NCI-H520, GLC82, Calu-3, A549 eller H1299 celler ble separert ved gel-elektroforese i henhold denaturerende betingelser og probet med ANO1 spesifikt antistoff. Som vist i den nedre panel av figur 2, kvantitativ analyse av ANO1 protein uttrykk nivå viste en økning på 2,8 ganger i NCI-H520, 6,9 ganger i GLC82, 6,3 ganger i Calu-3, 3,1 ganger i A549 og 8,0 -gangers i H1299, sammenlignet med normale lunge 2BS celler. Økningen i GLC82, Calu-3 og H1299-celler var statistisk signifikant, men ikke for NCI-H520 og A549-celler (P = 0,149 og P = 0,238, respektivt) selv om det var en trend med økning i ANO1 uttrykk. Dette resultatet er i overensstemmelse med den immunhistokjemiske analyse av lungekreft vev oppnådd fra pasienter (Tabell 1), noe som ytterligere bekrefter at ANO1 uttrykk er høyere i lunge adenokarsinom GLC 82 celler enn plateepitel carcinom HCI-H520-celler. De GLC82 og NCI-H520-celler som hadde ulike uttrykk nivåer av ANO1 proteinene ble valgt for videre undersøkelser
Topplate:. Representative vestlige blot bilder av ANO1 uttrykk i ulike lungecellelinjer. Nedre panel: statistisk analyse stolpediagram (n = 3) av ANO1 relative nivåer i NCI-H520, GLC82, Calu-3, A549 og H1299 cellelinjer (sammenlignet med normale celler 2BS). Ekspresjon av ANO1 ble normalisert til ekspresjonsnivået av β-aktin. ANO1 er betydelig overuttrykt i GLC82, Calu-3 og H1299 cellelinjer. Statistisk signifikans av ANOVA er gitt som *
p
0,05; **
p
0,01 og ***
p
0,001. Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM
Hemming av GLC82 og NCI-H520 celleproliferasjon ved stanse ANO1
For å evaluere den biologiske rollen ANO1 i lungekreft celleproliferasjon, brukte vi shRNAs til knockdown ekspresjonen av ANO1 i forskjellige cellelinjer. Effektiviteten av tre shRNAs ble vurdert ved Western blot i GLC82 og NCI-H520 lungekreftceller. Sammenlignet med transfeksjon av egge shRNA, ANO1 shRNA1 transfeksjon var mest effektive i å stanse endogen ekspresjon av proteiner i både ANO1 GLC82 og NCI-H520-celler (figur 3A), og således den ble brukt for resten av forsøkene.
(A) RNAi knockdown av ANO1 protein uttrykk i ANO1 uttrykker celler ble vist av Western blot bilder. Membran proteiner hentet fra GLC82 og NCI-H520 celler på tredje dagen etter transfeksjon av forskjellige ANO1 shRNAs (shRNA1, shRNA2 og shRNA3) ble immunoblottet med ANO1 antistoff. ANO1 shRNA1 viste den mest effektive hemming av ANO1 uttrykk, sammenlignet med de to andre shRNAs og egge shRNA. (B) GLC82 eller NCI-H520-celle proliferasjon ble bedømt ved CCK8 assay basert på den ekstracellulære redusering av WST8 av NADH produsert i mitokondriene. Ved hjelp av en mikroplateavleser, ble antallet celler kvantifiseres ved måling av absorbansen ved 450 nm. Transfeksjon av ANO1 shRNA1 resulterte i signifikant inhibering av GLC82 og NCI-H529 cellelevedyktighet i tidsavhengig måte sammenlignet med celler behandlet med egge shRNA (n = 6). (C) celle proliferasjon av carcinoma celler ble bestemt ved kolonidannelsesbestemmelsen i kultur i nærvær av ANO1 shRNA1. Kvantitativ analyse av ANO1 stanse gruppen viste mindre koloni Genesis, sammenlignet med egge shRNA gruppe (n = 3). Representative bildene viste under søylediagrammer. (D) RNAi av ANO1 hemmer clonogenicity av GLC82-celler i bløt agar (n = 3). NCI-H520 mislyktes i å danne kolonier i myk agar. Statistisk signifikans av Student
t
-test er indisert som *
p
0,05; **
p
0,01 og ***
p
0,001. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik
For å bestemme levedyktighet og spredning, gjennomførte vi celleproliferasjon CCK8 analysen bruker GLC82 og NCI-H520-celler. Som vist i figur 3B, stanse ANO1 betydelig bremset veksten av lunge adenokarsinom GCL82 og lunge plateepitel karsinom NCI-H520-celler. Spredning av GLC82-celler ble hemmet i tidsavhengig måte fra 89,1% ved dag 2, 81,6% ved dag 3 til 75.0% på dag 4. proliferasjon av NCI-H520-celler ble også inhibert fra 89,0% ved dag 2, 75,3% ved dag 3 til 71,7% på dag 4. for ytterligere å bekrefte disse resultatene, vi brukte to analyser av kolonidannelse i både kultur tallerken og myk agar. Som vist i figur 3C, tie ANO1 resulterte i en reduksjon på 36,2% kolonidannelse i GLC82 celler og 30,7% kolonidannelse i NCI-H520-celler, sammenlignet med egge shRNA kontroll. For ytterligere å bekrefte effekten av stanse ANO1 på spredning, brukte vi den myke agar-kolonidannelse analysen som overvåker forankringsuavhengig cellevekst. GLC82 cellene kan danne kolonier i soft agar i tretti dager, men NCI-H520 celler mislyktes i å danne kolonier. Som vist i figur 3D, proliferasjon av GLC82 celler behandlet med ANO1 shRNA var signifikant hemmet sammenlignet med det forvrengte shRNA-gruppen. Disse resultatene indikerer at stanse endogen ANO1 kan hemme spredning av GLC82 og NCI-H520 lungekreftceller.
Reduksjon av GLC82 og NCI-H520 celle migrasjon og invasjon av stanse ANO1
For å undersøke migrasjon av lungekreftceller, benyttet vi sårhelende analysen som evaluerer lukking av sår. To dager etter transfeksjon ble cellene plantet i en seks-brønns plate inntil 90% konfluens før sultet i 24 timer. Cellen lag ble nøye såret av sterile tips, inkubert med serumfritt medium. Som vist på fig 4A og 4B, transfektere GLC82 lungekreftceller med ANO1 shRNA hemmet såret fyller omtrent 66,8% ved 24 timer, 67,5% etter 48 timer og 74,3% ved 72 timer, sammenlignet med egge shRNA. I NCI-H520 lungekreftceller (figur 4C og 4D), den sårhelende i ANO1 knockdown gruppen var bare omtrent 29,1% ved 24 timer og 27,6% etter 48 timer sammenlignet med det forvrengte shRNA kontrollgruppen. På 48 timer, den sårhelende var nesten fullstendig i egge shRNA kontrollgruppen. Disse resultater viser at endogen ANO1 fremmer tumorcellemigrering, og stanse ANO1 hemmer migrering av lungecancerceller.
migrering av GLC82 og NCI-H520-celler transfektert med ANO1 shRNA1 eller kryptert shRNA ble bedømt ved sårhelende assay . To dager etter transfeksjon ble cellene plantet i en seks-brønns plate inntil 90% konfluens og deretter sultet i 24 timer. Cellelaget ble forsiktig såret av sterile tips, og inkubert med serumfritt medium. (A) Bright felt bilder av sår på tidspunkter 0 h, 24 h, 48 h og 72 h (GLC82) ble vist under lavt forstørrelse. (B) Kvantifisering for endringen i sårhelende av GLC82 celler ble vist i linjediagram og normalisert til egge shRNA gruppe. (C) Bilder av NCI-H520 sårhelende eksperiment ved 0 h, 24 timer og 48 timer ble presentert. (D) Linjediagram av NCI-H520-celler som viser cellemigrering som ble inhibert av ANO1 shRNA1 knockdown (n = 3). Statistisk signifikans (Student
t
-test) er indisert som *
p
0,05; **
p
0,01 og ***
p
0,001. Alle data er vist som gjennomsnitt ± standardavvik
Den mest truende trekk av kreft i lunge kreft er potensialet for invasjon og metastaser. For ytterligere å undersøke om lyddemping ANO1 også påvirker celle invasjon, brukte vi transwell analysen. To dager etter transfeksjon med ANO1 shRNA1 eller egge shRNA, GLC82 og NCI-H520-celler ble sultet i 24 timer før videre inkubasjon i det øvre kammeret. Etter 48 timers inkubering i NCI-H520-celler, eller 72 timers inkubasjon for GLC82-celler, ble celler invaderende inn i det nedre kammer fiksert med metanol og farget med DAPI. Som vist i figur 5, ble invasjonen potensialet av tumorceller drastisk undertrykket ved ANO1 knockdown. Arealet av ANO1 forstummet GLC82 celler som gikk gjennom det øvre kammeret var bare 4,0% av egge shRNA gruppen (Fig 5A og 5B). Som vist i figur 5C og 5D, er den relative transwell område av ANO1 knockdown i NCI-H520-celler var 12,2%, sammenlignet med celler transfektert med egge shRNA. Disse resultatene indikerer at stanse ANO1 hemmer migrasjon og invasjon av lungekreft GLC82 og NCI-H520-celler.
GLC82 og NCI-H520-celler ble sultet i 24 timer før ruges i det øvre kammer med Matrigel transwell filtre. Etter 48 timer (NCI-H520) eller 72 timer (GLC82), ble celler invaderende inn i det nedre kammer fiksert med metanol og farget med DAPI. (A) Bildene representerer mikroskopiske felt av de invaderende GLC82 celler. (B) Den invasivitet av celler som uttrykker ANO1 shRNA en eller egge shRNA ble kvantifisert ved farget område av invaderende GLC82 celler. Invasjonen Området er normalisert til egge shRNA gruppe. (C) Representative bilder av NCI-H520 celler invadert gjennom Matrigel transwell filtre. (D) Bar chat av NCI-H520-celler som viser reduksjonen av celle invasjon av ANO1 shRNA1 knockdown (n = 3). Statistisk signifikans av Student
t
-test er indisert som *
p
0,05; **
p
0,01 og ***
p
0,001. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM
Undertrykkelse av xenograft tumorvekst i nude mus ved ANO1 knockdown
For å undersøke effekten av ANO1 knockdown på vekst av xenograft tumor
in vivo
, tre grupper av GLC82 celler ble individuelt transfektert med ANO1 shRNA1, ANO1 shRNA2 og egge shRNAs, og deres knockdown effektivitet ble bekreftet av western blot før injeksjon for dannelsen av tumor xenograft i mus (figur 6a). Vi injisert 10
7 GLC82 celler per mus i rette forlemmene av 5-uker gamle nakne mus i fire grupper for dannelse av en tumor xenograft. Størrelsen av tumorene ble først målt 7 dager etter injeksjon (som dag 0). Som vist i figur 6B og 6C, ANO1 stanse resulterte i en betydelig reduksjon av tumorvekst med 68,8% i shRNA1 gruppen og 42,1% i shRNA2 gruppe, respektivt, sammenlignet med det forvrengte gruppen ved observasjon av dag 12. På dag 12, svulstene ble fjernet fra mus og vektet. En bemerkelsesverdig reduksjon av tumorvekten i ANO1 shRNA grupper ble observert (figur 6D og 6E). Som sammenlignet med kontrollgruppen egge shRNA, den gjennomsnittlige tumorvekt av ANO1 shRNA1 og shRNA2 gruppene var omtrent 38,7% og 70,1%, respektivt (figur 6D og 6E). Videre immunhistokjemisk farging av ANO1 i xenograft tumoren bekreftet at reduksjonen av ANO1 protein ekspresjonsnivåer var i overensstemmelse med tumorvolumet i gruppene behandlet ved ANO1 shRNAs med forskjellig styrke og i kontrollgruppen (figur 6F og 6G). Disse resultatene indikerer at ANO1 stanse ikke bare hemmer migrasjon og invasjon av lunge kreftceller, men også betydelig undertrykker tumorvekst.
Normal GLC82 celler eller stabile GLC82 celler som uttrykker ANO1 shRNA 1, ANO1 shRNA 2 og egge shRNA ble inokulert hypodermically inn i høyre forbein av 5 uker gamle kvinnelige hårløse mus (1X107 celler per mus). (A) Western analyse av knockdown effektivitet for villtype GLC82 celler og GLC82 celler stabilt uttrykker egge shRNA, ANO1 shRNA en og ANO1 shRNA 2. (B) representativt bilde av nakne mus som bærer GLC82 implantert svulster i fire grupper: blank gruppe (n = 7), egge shRNA gruppe (n = 8), ANO1 shRNA1 gruppe (n = 8) og ANO1 shRNA2 gruppe (n = 8). (C) Tumor størrelse ble målt hver 2-4 dager ved Vernier caliper i løpet av sin utvikling siden den syvende dagen etter injeksjon. Veksten av svulster uttrykker ANO1 shRNA1 og ANO1 shRNA2 var betydelig hemmet i en tidsavhengig måte, sammenlignet med egge shRNA gruppen. (D) representativt bilde av svulster plukket fra mus på den 12. dagen i generasjon. (E) Tumorene ble veid og analysert etter kirurgisk fjerning. Sammenligning med egge shRNA svulster, ANO1 shRNAs svulster var lettere. Statistisk signifikans (ANOVA) vises som *
p
0,05; **
p
0,01 og ***
p
0,001. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. (F) Representative bilder av immunhistokjemisk farging av ANO1 ekspresjon i xenograft tumorvev. (G) Analyse av ANO1 uttrykk i xenograft tumorvev ble utført av ledelsen 0-3 i henhold til intensitet og området av farging.
Diskusjoner
Målet med denne studien var å undersøke om Ca
2 + -aktiverte Cl
– kanal (CACC) ANO1 eller TMEM16A, opprinnelig identifisert fra luftveis epitelceller, er involvert i utviklingen av ikke-småcellet lungekreft som er typisk for epitelial lunge kreft.
i denne studien har vi vist at ANO1 er sterkt overuttrykt i flere lungekreftcellelinjer og prøver menneskelige adenokarsinom vev. Stanse ANO1 undertrykker celleproliferasjon, migrasjon og invasjon, og veksten av implanterte svulster.
