Abstract
Tidligere tre onkogene transgene sebrafisk linjer med induserbar uttrykk for
xmrk
,
kras
eller
Myc
i leveren har blitt generert, og disse transgene linjer utvikle onkogen-avhengige leversvulster ved kjemisk induksjon. I denne studien ble sammen transcriptomic tilnærminger brukes til å undersøke korrelasjonen av de tre induserte transgene leverkreft med humane lever kreft. RNA-profiler fra de tre sebrafisk svulster indikert relativt små overlappinger av betydelig deregulerte gener og biologiske veier. Likevel, de tre transgene kreft signaturer alle viste signifikant korrelasjon med avansert eller svært avansert menneskelig leverkreft (HCC). Interessant, molekylær signatur fra hver oncogen-indusert sebrafisk levertumor korrelert med bare en liten undergruppe av humane HCC prøver (24-29%), og det ble konservert oppregulert trasé mellom sebrafisk og korreleres human HCC undergruppe. De tre sebrafisk leverkreft modeller representert sammen nesten halvparten (47,2%) av menneskelige HCCs mens noen menneskelige HCCs viste signifikant korrelasjon med mer enn en signatur definert fra de tre onkogen-avhengige sebrafisk svulster. I motsetning til dette, som vanligvis deregulert gener (21 opp og 16 ned) i de tre sebrafisk tumormodeller generelt viste accordant deregulering i de fleste humane HCCs, noe som tyder på at disse genene kan bli mer konsekvent deregulert i et bredt spekter av humane HCCs med forskjellige molekylære mekanismer og dermed fungere som vanlig diagnose markører og terapeutiske mål. Dermed disse transgene sebrafisk modeller med veldefinerte onkogen-induserte svulster er verdifulle verktøy for molekylær klassifisering av menneskelig HCCs og for forståelse av molekylære sjåfører i hepatocarcinogenesis i hvert menneske HCC undergruppe
Citation. Zheng W, Li Z Nguyen AT, Li C, Emelyanov A, Gong Z (2014)
Xmrk
,
Kras Hotell og
Myc
Transgene Sebrafisk Liver Cancer modeller Del Molecular Signaturer med Delsett av menneskelig leverkreft. PLoS ONE 9 (3): e91179. doi: 10,1371 /journal.pone.0091179
Redaktør: Xiaolei Xu, Mayo Clinic, USA
mottatt: 02.10.2013; Godkjent: 09.02.2014; Publisert: 14 mars 2014
Copyright: © 2014 Zheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Medical Research Council of Singapore. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Zhiyuan Gong er for tiden en faglig redaktør av PLoS ONE; Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Menneskeleverkreft (HCC) er kjent for å være en svært heterogen sykdom, spesielt hos middels og avanserte stadier [1]. På grunn av de mangfoldige og komplekse årsaker som bidrar til HCC forekomst, kan ulike genetiske mutasjoner eller endrede molekylære stier være ansvarlig for hepatocarcinogenesis. Så langt har flere kreftfremkallende veier blitt identifisert til å være involvert i utvikling og progresjon av HCC, inkludert VEGFR, EGFR, og mTOR trasé [2]. I forsøk på å dechiffrere den rollen ulike onkogene veier, er det etablert en rekke transgene musemodeller [3], [4] og komparative transcriptomic analyser har blitt brukt til å identifisere de beste transgene musemodeller for menneske HCCs [4].
sebrafisk har blitt stadig mer anerkjent som en verdifull eksperimentell modell for menneskelige sykdommer, spesielt for kreft [5] inkludert leverkreft [6] – [11]. Det har blitt vist at sebrafisk tumorer hadde slående likheter med human cancer histologisk [12], [13]. Transcriptomic og epigenetiske analyser har også indikert bevarte funksjoner i carcinogen-indusert sebrafisk HCC med menneskelig HCC [14] – [16]
Tidligere har vi generert flere levertumormodeller av transgene uttrykk for tre forskjellige onkogener (
kras, xmrk
eller
Myc
) spesielt i sebrafisk lever og disse transgen sebrafisk vanligvis produsere leversvulster med varierende grader av alvorlighetsgrad fra levercelleadenom (HCA) til HCC [6] – [9]. De tre onkogener vi anvendt i sebrafisk har alle blitt vist å være involvert i hepatocarcinogenesis.
KRAS
er mutert i -7% av leverkreft hos mennesker [17] men Ras signale overalt aktivert i HCC [18].
Xmrk
er en naturlig forekommende variant av EGFR i fisk av slekten
xiphophorus plakater (platyfish og sverddragere) med konstituerende autofosforylering og aktivering av nedstrøms signaler [19]. Aktivering av EGFR signal er korrelert med dårlig prognose for HCC pasienter [20].
MYC
er ofte forsterket i mange kreftformer, inkludert HCC og høyere uttrykk nivå av MYC er assosiert med mer avansert status for HCC [21]. Vi har vist at overekspresjon av
kras Hotell og
xmrk
i sebrafisk leveren kan indusere HCC [7] – [9], mens overekspresjon av
Myc
indusert meste HCA [ ,,,0],6].
Sammenlignings transcriptomic analyser av dyremodeller og humane kliniske prøver tilveiebringe et kraftig verktøy for identifikasjon av konserverte molekyl trasé og biomarkør genene for diagnose og terapi [15], [22]. Våre eksisterende onkogene transgene sebrafisk modeller har veldefinerte oppregulering av driver onkogen og dette kan gi et verdifullt verktøy for å identifisere de molekylære drivkreftene i menneskelig kreftutvikling av komparative transcriptomic analyser. Derfor, i denne studien benyttet vi RNA sekvenseringsteknologi for å sammenligne transcriptomic profiler av de tre onkogen-indusert leversvulster i transgen sebrafisk. Ved komparative analyser med humane lever transcriptomes fra cirrhosepasienter lever til svært avansert HCC, fant vi ut at de alle viste sterk molekylær sammenheng med avansert eller svært avanserte menneskelige HCCs. Likevel, det er ganske forskjellige deregulerte biologiske pathways basert på deregulerte gener i de tre onkogene transgene modeller. Interessant, hver sebrafisk levertumormodell korrelert med et delsett av human HCCs og hver undergruppe har noen distinkte molekylære egenskaper. Vi viste at transgene sebrafisk modeller med veldefinerte driver-genet aktivitet bør være verdifulle for klassifisering av menneskelig HCCs og for å forstå de molekylære mekanismene bak hver HCC subtype.
Materialer og metoder
Behandling og induksjon av leverkreft i de tre Sebrafisk Transgene modeller
Sebrafisk ble opprettholdt etter godkjent protokoll av Institutional Animal Care og bruk komité National University of Singapore (Protocol 079/07). Den generasjonen av
xmrk Hotell og
Myc
transgen sebrafisk ble tidligere beskrevet, og de ble betegnet som
TO (xmrk) product: [9] og
TO (Myc)
[6] henholdsvis i tidligere publikasjoner. De to transgene linjer ble konstruert ved anvendelse av en tetracyklin-induserbar transgene system og onkogen ekspresjon ble indusert av doksycyklin.
kras
V12
transgen linje som brukes i denne studien ble nylig generert ved hjelp av en mifepriston-induserbar system [7] i kombinasjon med en Cre-loxP system (upublisert). For
xmrk Hotell og
Myc
transgene linjer, transgen fisk og deres ikke-transgene søsken ble behandlet med 60 mikrogram /ml doksycyklin (Sigma, USA) fra 3,5 MPF (måned etter befruktning) i 6 uker. Alle
xmrk
fisk utviklet HCC og alle
Myc
fisk utviklet HCA. Totalt for hver transgen linje, en tumorprøve (transgen fisk behandlet med doksycyklin) og tre kontrollprøver (ikke-transgene søsken behandlet på samme måte med doksycyklin, transgene søsken uten doxycycline behandling, og ikke-transgene søsken uten doxycycline behandling) ble samlet inn for RNA sekvensering. I alle tilfeller ble leverprøver anvendt for RNA-sekvensering slått sammen 4-5 hannfisk. For
kras
V12
transgen fisk, én måned gamle transgen fisk ble behandlet med 1 mikrometer mifepriston (Sigma, USA) i 36 timer for å indusere Cre-mediert rekombinasjon for aktivering av
kras
V12
transgene uttrykk i leveren.
kras
V12
aktivert transgen fisk ble deretter lov til å vokse i seks måneder for å utvikle HCC og HCC prøvene ble deretter samlet for RNA sekvensering. Tre leversvulster fra indusert transgen fisk og tre normale lever fra ikke-induserte transgene fisk ble samlet separat som tumor og kontrollprøver. Alle prøver som ble brukt var fra hannfisk og to sett med biologiske replikater ble brukt.
Identifikasjon av Signatur Gene Lister i hvert Sebrafisk leverkreft Modell
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol Reagens (Invitrogen, USA ) og behandlet med DNase i for å fjerne genomisk DNA-forurensning. 3 «RNA-SAGE (serie analyse av genuttrykk) sekvensering ble utført på ABI solid plattform av Mission Biotech (Taiwan) i henhold til produsentens protokoll og 10-23000000 leser ble samlet inn hver sampler (tabell S1). I korthet mRNA ble renset ved hjelp av Dynabeads Oligo (dT) EcoP (Invitrogen) og underkastet cDNA-syntese. Resulterende cDNA ble spaltet ved NlaIII og EcoP15I å resultere i en 27 nukleotider cDNA merkelappen mellom de to sekvense adaptere. Kodene ble kartlagt til NCBI RefSeq (Reference Sequence) mRNA database for sebrafisk med et kriterium for å tillate maksimalt 2 nucleotide uoverensstemmelser. Alle RNA-Seq data ble sendt til Gene Expression Omnibus database med følgende tilgangsnumre: GSE53342 for
xmrk Hotell og
Myc
data og GSE53630 for
KRAS
data. Tag teller hver avskrift ble normalisert til TPM (transkripsjoner per million) for å legge til rette for sammenligning mellom forskjellige prøver. De forskjellig regulert gener i
Myc
– og
xmrk Anmeldelser – indusert leverkreft ble identifisert ved hjelp av en sample t-test som tidligere beskrevet [23], og differensielt uttrykte gener i
kras
indusert leverkreft ble identifisert ved hjelp av tosidige t-test.
for å lette funksjonelle konsekvensene av sebrafisk transkriptomet ble alle sebrafisk gener tilordnet kommentert menneskets gener for å kunne bruke eksisterende programvare på nettet utviklet i humane gener. Dermed ble menneske homologi kartlegging av sebrafisk Unigene klynger hentes fra Genome Institute of Singapore Sebrafisk Merknader Database (https://123.136.65.67/). For Unigene klynger kartlagt av mer enn én transkripsjons oppføringer, ble den høyeste TPM brukes til å representere uttrykk nivået av Unigene klyngen. Noen sebrafisk Unigene klynger ble kartlagt til mer enn en menneske Unigene klynger, som vanligvis kom fra det samme genet familien. For å fjerne redundans og unngå å forårsake skjevhet i funksjonelle analyser, var bare det første mennesket Unigene klyngen i listen er valgt til å representere de sebrafisk Unigene klynger. Listene over betydelig oppregulert sebrafisk gener som ble kartlagt med menneskelige homologer og brukes for sammenlignende analyese med menneskelige HCC data er vist i tabell S2.
Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)
GSEA ble brukt til å etablere den slektskap mellom de transgene sebrafisk modeller og humane lever-kreft [24]. GSEA er en beregningsmåte som avgjør om en
priori
definert sett av gener viser statistisk signifikante, samstemmige forskjellene mellom to biologiske prøver; den beregner en berikelse ranger med en innkjørings sum statistikken gjennom en rangert liste av genekspresjon datasett. Menneske homologer av signifikant oppregulert gener fra de sebrafisk tumorvev ble brukt som kreft signaturer for hver transgen sebrafisk modell for transcriptomic sammenligning med menneskelige HCC data. Hver valgt fenotype av humane HCCs (enten en spesifikk HCC trinns eller en spesiell HCC prøve) ble sammenlignet med resten av prøvene i det samme datasettet. Alle gener i det valgte fenotypen ble rangert ved t-test for å bestemme ekspresjon forskjeller mellom forskjellige stadier eller HCC HCC forskjellige prøver. Berikelse score på den forhåndsdefinerte transgen sebrafisk kreft signaturen ble beregnet ved hjelp av en innkjørings sum statistikken gjennom rangert gener. Den statistiske signifikans av anrikningen resultatet ble estimert ved hjelp av en empirisk fenotype basert permutasjon testprosedyren. En FDR (false funnrate) verdi ble gitt ved å innføre regulering av flere hypotesetesting. Menneskelige leveren kreft transkriptom data ble hentet fra Gene Expression Omnibus (GEO) database. Den menneskelige datasettet inkludert ulike stadier av HCCs brukt i sammenligningen var GSE6764 [25]. De ti humane HCC datasettene som brukes for behandlingen av representasjonen av sebrafisk leverkreft gen signaturer er oppsummert i Tabell S3. Stempler informasjonen ble hentet fra SOURCE (https://smd.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch). For flere sonder som kan tilordnes til en Unigene klynge, ble den maksimale signalintensitet valgt til å representere uttrykket nivået av Unigene klyngen.
GSEA Forhånds rangert Analyse
GSEA forhåndsrangerte alternativ ble brukt til å analysere de deregulerte trasé i hvert transgen sebrafisk modell og undergrupper av menneske HCCs. I korthet, ble hele transkriptomet rangert etter logaritmen transformerte p-verdi (grunntall 10). De oppregulert gener ble gitt positive verdier, og nedregulert gener negative verdier. De kuratert kanoniske trasé fra MSigDB (Molecular Signatur Database) ble brukt. Antallet permutasjon brukte var 1000.
RT-qPCR validering
Total RNA ble revers-transkribert ved hjelp av Super II cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). RT-qPCR ble utført med samme sett av cDNA som brukes til SAGE sekvensering ved hjelp av LightCycler 480 SYBR Grønn Jeg Master system (Roche). Reaksjonene ble utført i triplikat for hver prøve og cDNA Primersekvensene er vist i tabell S4. Genuttrykk nivåer i hver kontroll eller transgen leverprøve var normalisert med nivået på
β-actin
mRNA som den interne kontrollen. Loggen
2 fold endringer mellom tumor og kontrollprøver ble beregnet ved bruk av CT-fremgangsmåten i henhold til formelen: log
2 ganger forandrer = -ΔΔCT = – [(CT genet av interesse-CT
β-actin
) transgen prøve-(CT genet av interesse-CT β-aktin) kontrollprøve]. To-tailed heteroscedastic t-test ble utført ved hjelp av normalis CT-verdier (CT gen – CT β-aktin) og endringer med p 0,05 anses å være betydelig
Resultater
Identifikasjon av forskjellig uttrykt. gener i de tre transgene Sebrafisk Liver Cancer modeller
de tre onkogene transgene linjer (
xmrk, Myc Hotell og
kras
V12
) ble overtalt til å utvikle leversvulster ( Figur S1), og disse tumorprøver ble underkastet RNA-SAGE sekvensering. Ved en utvalgskriteriene av ganger endring 1,5, p verdi 0,05 og TPM 10 (i enten kontroll eller tumorprøver), ble differensielt uttrykte gener valgt fra de tre kreft sett. Det var 2,892, 797 og 494 gener oppregulert og 169, 902 og 676 genene nedregulert i
xmrk
-,
kras
– og
Myc Anmeldelser – Induced sebrafisk leverkreft, henholdsvis (figur 1A, B). Deregulerte gener fra de tre transgene modeller viste relativt små overlappinger, noe som indikerer at de tre onkogener reguleres ganske forskjellige sett med gener. Dette er konsistent med den rapport som morfologisk ensartet krefttype blir ofte klassifisert i forskjellige undergrupper basert på deres forskjellige genuttrykksmønster [26]. Interessant var det 21 oppregulert og 16 nedregulert gener som vanligvis finnes i alle de tre tumormodeller (figur 1A, B, tabell 1).
(A) Venn-diagram av oppregulert gener i tre sebrafisk transgene HCC modeller. (B) Venn-diagram av nedregulert gener i de tre sebrafisk transgene HCC modeller. (C) deregulert trasé i de tre onkogene transgene leversvulster. Opp- og ned-regulert trasé i hvert sebrafisk transgen HCC modellen ble analysert ved GSEA pre-rangert analyse. Rød og grønn indikere opp-og ned-regulering henholdsvis, og den fargekode basert på FDR er vist til venstre. Pathways samkjøre med grå celler ble ikke oppdaget med noen endring. De oppregulert trasé ble tildelt i syv kreft kjennetegn kategorier (med unntak av aktivering replicative udødelighet) ifølge Hanahan og Weinberg [27] og nedregulert trasé ble klassifisert basert på ulike aspekter av levermetabolisme (se tabell S1 for detaljer).
Tydelig pathways regulert i tre Sebrafisk levertumormodeller
Pathway analyse ved hjelp GSEA viste at de tre transgene leverkreft modeller har ulike veier deregulert (figur 1C, tabell S5) . Det har blitt allment akseptert at det er åtte kreft kjennetegnene for flertrinns tumorigenesis og kompleksiteten av svulster [27], [28]. Vi fant at GSEA-identifiserte trasé falt i minst sju kreft kjennetegnene (unntatt for aktivering replicative udødelighet).
Xmrk
hovedsakelig oppregulert trasé som er involvert i å gå utenom vekstdempere og unngå immun ødeleggelse, som omfattet aktiverende cellesyklus, fremme RNA transkripsjon, opp regulerende proteasome og endre immun egenskaper.
Kras
tilgjengelig tumorcellene med evnen til selvbærende proliferative signaler ved hjelp av opp-regulering av EGFR, Raf-MEK-ERK, PI3K-AKT-mTOR og GSK3p signalveier. Spesielt det også endret fokus lim tegnene i kreftceller som kan aktivere invasjon og metastasering.
Myc
hovedsakelig oppregulert oversettelse og proteolyse å hjelpe kreftceller å unngå vekstdempere, og det også oppregulert VEGF veien, og dermed potensielt indusere angiogenese. Mens det var ingen enkel sti betydelig oppregulert i alle tre tumormodeller, var det noen trasé oppregulert i to modeller, som for eksempel proteasome i
xmrk Hotell og
MYC
modeller, og IGF1 vei, mTOR vei, tRNA biosyntese og fokal heft i
xmrk Hotell og
KRAS
modeller. I motsetning til veier i omprogrammering av energiomsetningen ble generelt nedregulert i alle tre modellene om nedregulering i
Myc
modellen var mindre tydelig enn de to andre modellene. I mellomtiden, mange andre måter med normal leverfunksjon, slik som blodfaktorer, aminosyremetabolisme, avgiftning og xenobiotiske metabolisme, fettsyremetabolisme, og galle syntese var jevnt nedregulert i alle tre tumormodeller. Men ett unntak var hormon regulering som var tilsynelatende oppregulert i
KRAS
svulster.
Korrelasjon av de tre Gene Signaturer av Sebrafisk leversvulster med ulike stadier av menneske HCCs
oppregulert gener, 2892, 797 og 494 fra
xmrk
,
kras Hotell og
mYC
svulster henholdsvis ble brukt som signatur gener for hver modell. Disse oppregulert gener ble konvertert til 1362, 490, og 146 menneske Unigenes henholdsvis for å sammenligne med tilgjengelige transcriptomic data fra studier på mennesker. Vi deretter sammenlignet de tre signatur gensettene med et sett av menneskelige transcriptomic data (GSE6764) fra ulike stadier av menneskelige leveren forhold: levercirrhose, lav klasse dysplastiske knuter (LGDN), høy klasse dysplastiske knuter (HGDN), og veldig tidlig, tidlig , avansert og meget avansert HCC (veHCC, eHCC, AHCC og vaHCC), hvor de patologiske HCC stadier har blitt definert av tumorstørrelse, differensiering status og metastase nivå [25]. De tre signatur gensettene var oppregulert som sykdommen utvikler seg, men de begynte å bli oppregulert på ulike stadier av tumordannelse (figur 2).
xmrk
signatur viste positiv korrelasjon med HCCs start fra eHCC, og det var signifikant korrelert med AHCC og vaHCC.
kras
signatur positivt korrelert med AHCC og vaHCC, og det var bare signifikant korrelert med vaHCC.
Myc
signatur viste signifikant positiv korrelasjon med HCCs start fra eHCC, lignende med vår forrige resultat ved hjelp av en uavhengig sett av RNA-seq data fra samme transgene linjen [6]. Interessant, vanlige 21 opp-regulerte gener i alle de tre tumormodellene viste også oppregulering selv fra meget tidlig stadium av HCC, indikerer disse genene er korrelert med hele neoplastiske prosessen.
oppregulert gen underskrifter fra de tre transgene tumorer (xmrk, kras og Myc) og 21 vanlige oppregulert gener (Common) ble brukt for GSEA og Ness (normalisert berikelse score (y-aksen) er plottet mot ulike stadier av menneskelige HCCs (x-aksen .) NES er oppført i tabellen og stjerne indikerer statistisk signifikans: FDR 0,25 Forkortelser. CL, cirrhosepasienter lever, LGDN, lav grad dysplastiske knuter, HGDN, høy klasse dysplastiske knuter, veHCC, veldig tidlig HCC, eHCC, tidlig HCC; AHCC, avansert HCC,. vaHCC, svært avansert HCC
Representasjon av tre Gene Signaturer av Sebrafisk leversvulster i Human HCC Prøver
Gitt den særegne trasé endret i tre sebrafisk leveren tumormodeller og den høye grad av heterogenitet i humane HCC pasienter, søkte vi å undersøke graden av fremstilling av de tre sebrafisk leverkreft modeller i humane HCC prøver. Vi undersøkte ti sett med publiserte kliniske HCC mikroarray data, som hver omfattet minst 80 kliniske prøver. De ti datasett inneholder totalt 1,272 prøver som dekker ulike etniske grupper og risikofaktorer (tabell S2). Vi fant at
xmrk
,
kras Hotell og
Myc
gen signaturer var signifikant korrelert med 30,8%, 24,8% og 25,6% av alle kliniske prøver, henholdsvis. 47,2% av de humane HCC prøvene hadde signifikant korrelasjon med i det minste en av de tre sebrafisk genet signaturer (tabell 2, figur S2). I ulike menneskelige HCC datasett, prosent varierer fra 22,0% til 60,4%. Videre ble noen av de kliniske prøver korrelert med to eller tre sebrafisk gen signaturer. Co-korrelasjon av to gen signaturer, nemlig
xmrk Twitter /
kras
,
kras Twitter /
Myc Hotell og
kras Twitter /
Myc, etter sto for 17,5%, 13,5% og 12,4% av de menneskelige HCC prøvene. 9,3% av de humane prøvene viste ko-korrelasjon av alle de tre genet signaturer. Dermed ser det ut til at de tre transgene sebrafisk lever tumormodeller representerer molekylære mekanismer hepatocarcinogenesis i nesten halvparten av de menneskelige HCC tilfeller og den andre halvparten av menneskelig HCC kan skyldes ulike molekylære mekanismer.
videre demonstrert at undergrupper av humane HCCs som viste signifikant positiv korrelasjon med det samme gen signaturen også delt liknende oppregulert baner (figur 3, tabell S6). For denne analyse ble hver av de humane HCC sett deles inn i to undergrupper: de som viser signifikant korrelasjon med en av sebrafisk signaturer, og resten. Differensielt uttrykte gener mellom de to gruppene ble identifisert ved to-halet t-test, og spredningsveier analyser ble utført ved GSEA pre-rangeres analyse. Trasé ble utsatt for hierarkisk clustering av logaritmen-transform FDR verdier ved hjelp MeV [29], [30]. Som vist i figur 3, trasé differensielt regulert i humane HCCs som viste signifikant korrelasjon med en av sebrafisk skriftene hadde tydelige mønstre. Den veien cluster A besto av trasé oppregulert i alle de tre undergrupper, inkludert proteasome, tRNA biosyntese og oksidativ fosforylering. Ribosom, transkripsjon og translasjon, og cellesyklus var også sterkt oppregulert, noe som tyder på at de humane prøvene HCC signifikant korrelert med hvilken som helst av sebrafisk skriftene var sannsynligvis mer proliferativ enn de som ikke signifikant korrelert. Den veien cluster B inneholder trasé nedregulert i de fleste undergrupper forbundet med
xmrk
men oppregulert i undergrupper forbundet med
kras Hotell og
Myc
. Interessant, teser trasé var i samsvar med sterkt nedregulert baner i
xmrk
indusert sebrafisk HCC, inkludert energi metabolisme, aminosyre metabolisme, fettsyremetabolisme, gallesyre biosyntese, komplementveier, biosyntese av steroid, og N-glykan biosyntese. Den veien cluster C er mer oppregulert i
kras
-associated HCC undergrupper, inkludert glutamat metabolisme og glykolyse. Det har blitt rapportert at
Kras
kan øke omdannelsen av glukose til glutamat, og dette var avgjørende for
Kras
formidlet tumorigenicity [31]. Den veien klynge D var generelt oppregulert i
xmrk
– og
kras
-correlated menneskelig HCCs, men viste en uensartet mønster i
Myc
-correlated menneskelige HCCs . Denne klyngen inneholdt mange kinase trasé som ble deregulert i
xmrk
– og
kras
indusert sebrafisk leverkreft, men ikke vesentlig endret i
Myc
indusert sebrafisk lever kreft. Den veien klynge E var ganske heterogene. Den veien klynge F ble godt atskilt fra alle de andre, og den inneholdt trasé som var det meste ned-regulert i alle de menneskelige HCC undergrupper forbundet med sebrafisk signaturer, inkludert blodkreft celle avstamning, cytokin vei, kalsium signalisering, og GPCR sti. Siden de fleste av disse nedregulert trasé er involvert i betennelsesreaksjon, er det sannsynlig at de undergruppene av menneskelige HCCs ikke fanges opp av de tre sebrafisk modellene har mer alvorlig inflammatorisk status.
De fargefeltene representerer logaritmen-transform FDR verdier. Oppregulert trasé er gitt positive verdier (rød) og ned-regulert trasé negative verdier (grønn). Pathways samkjøre med grå celler er ikke påvist i veien analyser. Pathways med enten FDR = 1 eller ikke påvist i mer enn fem av de 30 kombinasjonene er forhånds ekskludert fra analysen.
De Vanligvis Opp- og Ned-regulerte gener i sebrafisk leversvulster er også konsekvent opp- og ned-regulert i human HCCs
Mens de tre gen signaturer representere oppregulering av forskjellige stier og korrelerer med ulike undergrupper av menneskelig HCCs, vi søkt å undersøke om 21 vanlige oppregulert og 16 ofte nedregulert gener i alle tre transgene modeller vil være tilsvarende regulert i menneskelige HCCs. Blant de ti menneskelige HCC datasett vi brukte, var vi i stand til å undersøke to datasett som inkluderte både HCCs og deres tilsvarende ikke-tumorvev (GSE14520 og GSE25097). Imidlertid kan bare GSE14520 sammenlignes med sebrafisk data som de fleste av de menneskelige gener homologe til de vanlige sebrafisk genene kan identifiseres fra microarray plattform som brukes: 19 av de 21 oppregulert gener (unntatt
FOXA3 Hotell og
MRPS9
) og 12 av de 16 nedregulert gener (med unntak av
cyp2ad2
,
slco1d1
,
TDH Hotell og
MIOX)
. GSE14520 datasettet inneholder 229 primær HCCs og tilsvarende paret ikke-tumor lever vev [32], [33].
xmrk
,
kras Hotell og
MYC
signaturer var signifikant korrelert med 30,5%, 20,0% og 20,5% av HCC prøver, og totalt 47,6% av HCC prøvene viste betydelig oppregulering av minst en av de sebrafisk leverkreft signaturer (tabell 2). Blant de 19 opp-regulerte gener, 16 av dem ble oppregulert på mer enn halvparten av HCC pasienter, og ni av disse var oppregulert på mer enn 75% av pasientene (figur 4).
STMN1
ble oppregulert i 96,9% av de menneskelige HCCs fra datasettet, som er den mest allestedsnærværende oppregulert.
STT3A Hotell og
SRP14
ble oppregulert i 93,0% av de menneskelige HCCs. Blant de 12 ned-regulerte gener, 11 av dem var nedregulert i mer enn halvparten av HCC pasienter.
FBP1
ble nedregulert i 96,9% av de undersøkte menneskelige HCCs. FBP1 er en glukoneogenesen regulatorisk enzym, og det fungerer å motvirke glykolyse i magekreft [34].
FBP1
er nedregulert i flertallet av menneske HCCs ved metylering [35]. Restaurering av FBP1 uttrykk i menneske HCC cellelinjer betydelig hemmet cellevekst, noe som tyder på at det kan fungere som en tumor suppressor [35].
19 av oppregulert gener og 12 av de nedregulert gener ble identifisert i microarray plattform. Den røde fargen indikerer oppregulering, og den grønne fargen indikerer nedregulering.
Til slutt uttrykket av disse 19 opp- og 16 nedregulert gener ble også validert av RT-qPCR i alt tre forskjellige typer av tumorer. Som vist i figur S3, de fleste av genet i de fleste tester (~90%) bekreftet konsistent trend av endringer i tumorprøver.
Diskusjoner
Det er vel kjent at menneske HCCs er svært heterogen; derfor bør kryssartssammenlignende studier på transcriptomic nivå være verdifulle for å identifisere konserverte og kritiske baner i kreftutvikling i virveldyrarter. Her vi først bestemt deregulerte trasé fra hver av onkogen transgen sebrafisk modell. Selv om de tre transgene tumormodeller hadde ganske forskjellige deregulerte biologiske pathways, de alle korrelert til avansert eller svært avanserte HCCs ved sammenligning med gen signaturer fra menneskelige HCCs. Videre fant vi også at hver av sebrafisk-modellen representerer en undergruppe av menneskelig HCCs. Siden våre onkogene transgene linjer har veldefinert kjøreveier i karsinogenese, bør informasjonen fra den transgene sebrafisk være verdifulle for å forstå de viktigste molekylære mekanismer for hver undergruppe HCC, noe som er viktig for å utvikle mer effektive terapeutiske midler som er spesifikke for hver undergruppe. Interessant, våre tre onkogene transgene sebrafisk modeller representerer betydelig bare mindre enn halvparten av den menneskelige HCCs og det er behov for å utvikle flere og ulike onkogene transgene dyremodeller for å dekke mer menneskelige HCCs for videre forståelse av ulike molekylære mekanismer i hepatocarcinogenesis, med fokus på inflammatoriske veier.
i denne studien har vi også identifisert en liste over vanlig deregulerte gener i leversvulster indusert av forskjellige onkogene signaler ble identifisert og deres uttrykks endringer i menneskelige HCC prøvene ble validert
i silico
(tabell 1, figur 4). Disse genene kan bli servert som potensielle terapeutiske mål siden de var uavhengige av individuelle onkogene veier. De oppregulert gener inkluderer de i protein oversettelse og behandling (
eif5a2
,
abce1
,
rrp9
,
srp14
,
itm1 <
