Abstract
NSCLC (ikke-småcellet lungekreft) viser ofte motstand mot paclitaxel behandling. Identifisere elementene som regulerer paclitaxel respons vil gå videre arbeidet med å overvinne slik motstand i NSCLC behandling. Ved hjelp av
in vitro
tilnærminger, viste vi at overuttrykk av mikroRNA MIR-337-3p sensitizes NCI-H1155 celler til paclitaxel, og at MIR-337-3p ligne har en generell effekt på paclitaxel respons i NSCLC cellelinjer, noe som kan tilveiebringe en ny strategi for å adjuvant paclitaxel i behandlingen av lunge cancer. Ved å kombinere
in vitro Hotell og
i silico
tilnærminger, identifiserte vi
STAT3 Hotell og
RAP1A
som direkte mål som medierer effekten av MIR-337- 3p på paclitaxel følsomhet. Videre undersøkelser viste at Mir-337-3p ligne sensitizes også celler til docetaxel, et annet medlem av taxan familien, og at Stat3 nivået er signifikant korrelert med taxan motstand i lungekreft cellelinjer, noe som tyder på at endogen STAT3 uttrykk er med på å bestemme indre taxan motstand i lungekreft. Identifiseringen av en MIR-337-3p som en modulator av cellulær respons til taxaner, og
STAT3 Hotell og
RAP1A
som regulatoriske mål som formidler dette svaret, definerer en ny regulerings sti moduler paclitaxel følsomhet i lunge kreftceller, noe som kan gi nye adjuvant strategier sammen med paklitaxel i behandling av lungekreft, og kan også gi biomarkører for å forutsi paclitaxel respons i NSCLC
Citation. Du L, Subauste MC, DeSevo C, Zhao Z, Baker M, Borkowski R, et al. (2012) MIR-337-3p og sine mål
STAT3 Hotell og
RAP1A
modulere taxan følsomhet i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (6): e39167. doi: 10,1371 /journal.pone.0039167
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 6 februar 2012; Godkjent: 17 mai 2012; Publisert: 18 juni 2012
Copyright: © 2012 Du et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet i del av Lung Cancer SPORE P50 CA70907 (JD Minna), R01 CA129632 (A. Pertsemlidis) fra National Cancer Institute, og Academic Excellence Grant EDUD-7824-021007-US (A. Pertsemlidis) fra Sun Microsystems. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Høy ytelse databehandling maskinvare ble gitt av en Academic Excellence Grant fra Sun Microsystems. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Paclitaxel er en microtubule-målsøkende middel opprinnelig isolert fra bartre
Taxus brevifolia
– barlind treet har en lang historie med medisinsk bruk [1] – og er mye brukt i behandling av kreft hos mennesker, inkludert lungekreft. For NSCLC, motstand mot paclitaxel er vanlig, med svarprosenter som strekker seg fra 21% til 24% [2], [3]. Mekanismer for slik motstand er overekspresjon av P-glykoprotein, endringer i tubulin sammensetning, og mutasjoner i β-tubulin [4], [5], [6], [7]. En nylig studie viste at en stor gruppe av protein-kodende gener som hører til et bredt spekter av funksjonelle klasser er potensielt er involvert i modulering av paklitaksel motstand i behandling kreft [8]. Identifisere de mekanismene som regulerer uttrykket av viktige gener involvert i paclitaxel motstand vil gå videre arbeidet med å overvinne slik motstand i behandling av lungekreft.
Vi er interessert i potensialet involvering av microRNAs (miRNAs) i moduler paclitaxel respons i kreftbehandling lunge. mirnas er korte, 19 til 23 nukleotid RNA som finnes i flere organismer som regulerer genekspresjon i stor grad ved å redusere nivåene av mål messenger RNA [9], [10], og har vist seg å spille en viktig rolle i regulering av en lang rekke patologiske prosesser, inkludert kreft patogenesen. miRNA nivåer kan lett manipuleres ved hjelp av syntetiske RNA-molekyler. En kjemisk stabilisert, enkelt-trådet RNA-molekyl komplementært til en mål-miRNA virker som en inhibitor og reduserer endogene nivåer av miRNA. Motsatt, en dobbelt-trådet RNA-molekyl med en tråd identisk i sekvens til et modent miRNA fungerer som en etterligner av den naturlig forekommende miRNA og øker dets cellulære ekspresjonsnivåer. Flere studier har undersøkt den terapeutiske effekten av miRNA etterligner og inhibitorer og demonstrert den potensielle av disse klassene av oligonukleotider som terapeutiske midler [11], [12], [13], [14], [15], [16].
HSA-MIR-337 (MIR-337) er en menneskelig miRNA locus plassert på kromosom 14q32.2. MIR-337-3p er sterkt uttrykt i normale immortaliserte fosterets lunge fibroblaster (IMR-90), og påvises i udødeliggjorte humane bronkiale epitelceller (HBECs). Ekspresjonen av MIR-337-3p i lungekreft linjer, er imidlertid generelt lavere enn i normale lunge epiteliale cellelinjer (figur S1). Målet forutsigelse viser at MIR-337-3p potensielt regulerer ekspresjonen av multiple gener som er involvert i tumordannelse. Vi fant at MIR-337-3p sensitizes lungekreftceller til paclitaxel-behandling, men uventet, ikke i betydelig grad påvirke cellenes levedyktighet alene. Vi brukte videre
in vitro Hotell og
i silico tilnærminger
å definere direkte mål av MIR-337-3p som formidler sin effekt på paclitaxel følsomhet. Vi har også utforsket mulighetene relevansen av MIR-337-3p ligne og sine mål for å bestemme paclitaxel følsomhet i et stort panel av NSCLC cellelinjer, og foreløpig utforsket potensialet i MIR-337-3p ligne som en adjuvant til paclitaxel behandling
in vitro
hos NSCLC cellelinjer.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP brukt i denne studien er hentet fra Hamon Senter for Terapeutisk onkologi Forskning ved UT Southwestern Medical Center. Linjer som begynner med «NCI-H» ble etablert ved National Cancer Institute [17], [18]. Linjer som begynner med «HCC» og HBECs ble etablert av Hamon Senter for Terapeutisk onkologi Forskning ved UT Southwestern Medical Center [19]. Alle lungecancercellelinjer ble dyrket i RPMI-1640-medium (Life Technologies, Carlsbad, CA) supplert med 5% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). HBECs ble dyrket i GIBCO® KSFM medium supplert med bovint hypofyseekstrakt og rekombinant, human epidermal vekstfaktor (Life Technologies). Alle cellelinjer ble DNA fingeravtrykk bruker GenePrint PowerPlex 1.2 system (Promega, Madison, WI) og bekreftet mot fingeravtrykk bibliotekene vedlikeholdes av ATCC og Minna /Gazdar laboratorium, og testet for forurensning ved hjelp av e-Myco Mycoplasma PCR påvisning Kit (Boca Scientific , Boca Raton, FL).
celleviabilitet analyser
Følsomhet for NSCLC cellelinjer til paclitaxel og docetaxel ble målt ved hjelp av en standard protokoll som beskrevet i Zhou et al. [20]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners format, med paclitaxel tilsatt i forskjellige konsentrasjoner etter 24 timer, etterfulgt av inkubering med medikament i 96 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av CellTiter 96® vandige One Solution Cell Proliferation Assay (MTS, Promega). Effekten av MIR-337-3p og sine mål ble bestemt ved transient transfeksjon av enten MIR-337-3p ligne eller siRNA oligos rettet mot spesifikke gener. Generelt er celler ble revers-transfektert med de angitte oligoer i 96-brønners format og dyrket i 72 timer, etterfulgt av inkubasjon med narkotika for ytterligere 72 timer. Celleviabilitet ble bestemt ved hjelp av CellTiter 96® vandige løsning Cell Proliferation Assay (MTS, Promega) eller CellTiter-Glo Lysende celleviabilitet Assay (ATP, Promega).
Flowcytometri
Celler ble transfektert med de angitte oligoer i 6-brønners plater i 48 timer, etterfulgt av behandling med enten paclitaxel eller en bærer i ytterligere 16 timer. Både frittliggende og festede celler ble sentrifugert ved 1000 rpm i 5 min. Cellene ble vasket en gang med 1 x PBS (fosfatbufret saltvann) og fiksert med 1 x PBS inneholdende 1 mM EDTA og 85% etanol ved 4 ° C. Etter 1 time ble cellene høstet ved sentrifugering ved 1400 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Cellene ble resuspendert i 1 x PBS, og behandlet med 50 ug /ml propidiumjodid og 100 ug /ml RNase A i 30 minutter ved 37 ° C. Cellesyklus data ble samlet på en Cytomics FC 500 flowcytometer (Beckman Coulter, Brea, CA), med 20.000 hendelser innsamlet per prøve. Data ble evaluert ved bruk av FlowJo dataanalyse programvare, versjon 9.1 (TreeStar, Ashland, Oregon).
Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
miRNA uttrykket ble målt på en ABI PRISM 7900 Sequence Detection System bruker TaqMan® mikroRNA Analyser (Life Technologies) med RNU19 RNA uttrykk som en intern kontroll for normalisering av RNA lasting. mRNA-ekspresjon ble målt ved bruk av TaqMan®-genekspresjon Analyser med GAPDH mRNA-ekspresjon som en intern kontroll. Threshold syklustider (C
t) ble innhentet og relativ genekspresjon ble beregnet ved hjelp av komparative syklus tid metoden.
Western blot
Cellelysater ble utarbeidet etter NP-40 buffer. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av Pierce BCA assay (Thermo Fisher, Rockford, IL). For elektroforese ble like mengder av cellelysat løst ved hjelp av SDS-PAGE og overført til Immun-Blot PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA). Membraner ble blokkert, og analysert med følgende antistoffer: kanin anti-RAP1A eller anti-STAT3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), eller geit anti-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Bundede antistoffer ble detektert med sekundære antistoffer konjugert med pepperrot peroksidase (HRP) (Santa Cruz Biotechnology) og visualisert ved forsterket kjemiluminescens (ECL) substrat (Thermo Fisher). Relative endringer i proteinnivåene ble kvantifisert ved densitometri bruke Kvantum One-programvaren (Bio-Rad).
miRNA mål prediksjon
For å identifisere de regulatoriske målene for MIR-337-3p, brukte vi miRmate metode utviklet i vårt laboratorium som beskrevet tidligere [21]. I korthet er fremgangsmåten belønninger fullstendig komplementaritet i posisjonene 2-8 av miRNA (frøet region), uoverensstemmelser og innsettinger i den sentrale utbuling i posisjonene 9-11 i miRNA, noe komplementaritet ved 3′-enden, og spesifikk sekvens sammensetningen ved posisjon 1 (A) og 9 (A eller C) av miRNA, ifølge resultatene av Lewis et al. [22].
luciferaserapportørplasmid analyser
Den delen av villtype (WT) 3’UTRs inneholder de antatte målse av
RAP1A plakater (NM_002884) og
STAT3
(NM_003150) ble klonet nedstrøms for luciferase cDNA i pMIR-RAPPORT (Ambion, Austin, TX), en vektor som inneholder både luciferase og β-galaktosidase-cDNA under kontroll av separate pattedyr promoter /terminator-systemer. Mutant konstruksjoner (
RAP1A
MU og
STAT3
MU) med posisjon 3 (2
nd nukleotid i målet frø sekvens) endret fra G til A og posisjon 1 (straks 3 «til frøet sekvens) endret fra A til U, ble gjort ved hjelp QuikChange nettstedet mutagenese Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Luciferaseaktivitet og β-galaktosidase-aktivitet ble målt ved anvendelse av luciferase-analysesystem og β-galaktosidase Assay System (Promega), respektivt.
mRNA-ekspresjon profilering
NCI-H1155-celler ble transfektert med speil 337-3p ligne eller negativ kontroll etterligner. Total RNA ble isolert ved hjelp av Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion), merket og hybridisert til HumanWG-6 V3 Expression BeadChips (Illumina, San Diego, CA) ved hjelp av standard protokoller. Slides ble skannet på en Illumina BeadStation og signalintensitet ble oppsummert ved hjelp BeadStudio v3.3 (Illumina). Bakgrunn subtraksjon og quantile normalisering ble utført ved hjelp av MBCB algoritme [23].
Sammenheng uttrykk med 3’UTR motiv innhold
Sammenheng mellom endringer i genuttrykk indusert av MIR-337-3p løpet ekspresjon og motiv innholdet i sine 3’UTRs ble analysert ved hjelp sylamer (https://www.ebi.ac.uk/enright/sylamer), som beregner kumulative og hypergeometrisk p-verdier forbundet med små ord forekomster i en rangert seq av større sekvenser, i dette tilfelle 7-mer forekomster over hele settet med RefSeq 3’UTRs, og ved hjelp av lineær regresjon som er implementert i miReduce [24], [25]. For den sistnevnte, blir hvert motiv inneholdt i 3’UTRs anses å bidra lineært til folden endre profil, og miReduce beregner iterativt motivene som bidrar mest. Regresjonen koeffisienten for hvert motiv kan være positiv eller negativ, avhengig av om interaksjonen resulterer i en undertrykkelse eller aktivering av ekspresjon av målgenet. I tilfelle av over-uttrykker en miRNA forventer vi at transkriptene som inneholder motivene komplementære til den mikroRNA frø sekvensen som skal reduseres i uttrykk, slik at motivet vil ha en negativ koeffisient regresjon.
Reverse-Phase Protein Array (RPPA)
Protein lysater ble fremstilt ved anvendelse av varm lyseringsbuffer (2% SDS, 0,06 M Tris-Cl, pH 6.8, 5% glycerol) med proteinase og fosfatase-inhibitorer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ; Santa Cruz Biotechnology) og β-merkaptoetanol ferskt tilsatt. Lysater ble denaturert ved koking i 5 min med supernatanter erholdt ved sentrifugering ved 13 000 rpm i 7 minutter ved 4 ° C. Før arraying på lysbilder, ble proteinlysatene filtrert gjennom 96-brønners filterplater med 25 mikrometer pore membraner (Phenix forskning produkter, Candler, NC) for å fjerne aggregater. Like mengder lysatene ble kledd i tre eksemplarer på ONCYTE® AVID
TM nitrocellulose film lysbilder (Grace Bio-Labs, Bend, Oregon) ved hjelp av en SpotArray
TM24 Microarray utskriftssystemet (PerkinElmer, Waltham, MA) under 55-60 % luftfuktighet. For immunofarging, ble platene først inkuberes ved RT i ReBlot Plus Mild Solution (EMD Millipore, Billerica, MA) for mindre enn 7 min til å slappe av proteinstruktur og deretter vasket i TBS-T buffer deretter inkubert i Pierce SEA BLOCK blokkeringsbuffer (Thermo Fisher), blokkert med avidin og biotin (Dako, Glostrup, Danmark), og inkubert med enten STAT3 (EMD Millipore) eller pSTAT3 (S727, Cell Signaling Technology) antistoff ved 4 ° C over natten. Slides ble deretter vasket og inkubert med biotinylerte sekundære antistoffer (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 30 minutter etterfulgt av blotting med Qdot 655-streptavidin konjugert (Life Technologies) i 30 min. Lysbilder ble skannet med en ProScanArray microarray Scanner (PerkinElmer). Protein uttrykk nivåer ble kvantifisert ved hjelp MicroVigene ™ (Vigene Tech, Carlisle, MA) programvare og normalisert for forskjeller i protein lasting ved hjelp Sypro Ruby ™ (Life Technologies) protein flekken signaler som oppnås på en egen lysbilde trykt i samme parti.
miRNA uttrykk profilering av vevsprøver
10-20 mikrometer tykke seriesnitt av 249 kirurgisk resected NSCLC prøver (inkludert 172 adenokarsinomer og 76 plateepitelkarsinom) ble oppnådd ved bruk av en Leica cryostat og homogenisert ved hjelp av en Omni TH homogenisator (Omni International, Kennesaw, GA). Total RNA ble isolert ved hjelp av TRI Reagens (Life Technologies) og kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop 1000 spektrofotometer (Thermo Fisher). RNA kvalitet ble bestemt på en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
For mikroRNA analyse ble prøvene merket med miRNA Komplett Merking og Hyb Kit og hybridisert til Agilent menneskelige miRNA microarray versjon 3 chips (Agilent Technologies), som inneholder prober for 866 menneskelige og 89 menneske virus microRNAs basert på miRBase v12.0 (https://microrna.sanger.ac.uk). Hybridiseringer ble utført i rustfritt stål SureHyb kamre (G2534A) ved 55 ° C i 22 timer, hvoretter arrays ble vasket og skannet ved hjelp av en Agilent DNA microarray Scanner (Agilent Technologies). miRNA uttrykket nivåer ble hentet med Feature Extraction programvare (Agilent Technologies) og behandlet med bioconductor [26] pakke AgiMicroRna å korrigere for bakgrunnen, tar kontroll og un-detekterbare sekvenser, og quantile normalisere og oppsummere data.
Resultater
over-uttrykk for MIR-337-3p sensitizes NCI-H1155 celler til paclitaxel og forbedrer paclitaxel-indusert G
2 /M arrest
for å undersøke effekten av speil 337-3p på paclitaxel følsomhet i lungekreftceller, brukte vi MIR-337-3p ligne (Dharmacon) for å øke MIR-337-3p nivåer i NCI-H1155-celler, en lungekreft cellelinje karakterisert som moderat resistent mot paclitaxel i en tidligere studie [8]. Som vist i figur 1A, MIR-337-3p over-ekspresjon sensitizes vesentlig celler til paclitaxel behandling, redusere IC
50 – definert som den konsentrasjon som fører til en 50% reduksjon av cellelevedyktighet – fra 27,27 nM (95% CI 25,97 til 28,90) med kontroll oligo til 14,60 nM (95% CI 14,08 til 15,15) med MIR-337-3p ligne (p 0,0001). Vi testet neste dose-avhengighet av effekten av MIR-337-3p på paclitaxel følsomhet og cellelevedyktigheten ved å transfektere NCI-H1155-celler med forskjellige konsentrasjoner av enten MIR-337-3p etterligne eller kontroll oligo etterfulgt av behandling med enten 16 nM paclitaxel eller bærer. Som vist i figur 1B, MIR-337-3p mimic sensitizes vesentlig celler til paclitaxel i forhold til kontrollgruppen oligo ved konsentrasjoner så lave som 0,5 nM (p = 0,0168), men ikke betydelig redusere cellelevedyktighet i fravær av paclitaxel i konsentrasjoner selv så høyt som 200 nM. For ytterligere å vurdere reguleringen av paclitaxel respons ved MIR-337-3p, undersøkte vi effekten av MIR-337-3p inaktive på paclitaxel følsomhet i H1155 celler. Som vist i figur 1C, inaktivering av MIR-337-3p av MIR-337-3p hemmer betydelig reduserer responsen H1155 til paclitaxel behandling, med relativ celle levedyktighet økning på 17,81 ± 5,31% (p 0,0001), i forhold til kontroll oligoer.
(A) Doseavhengig avhengig~~POS=HEADCOMP effekt av paclitaxel på cellelevedyktighet i nærvær eller fravær av MIR-337-3p etterligne. Cellelevedyktigheten ble målt ved bruk av MTS-måling. (*, P 0,05; **, p 0,01; ***, p 0,001; ns, ikke signifikant) (B) Celleviabilitet som en funksjon av oligo-konsentrasjonen i nærvær eller fravær av paclitaxel. Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av ATP-konsentrasjon analysen. (C) Effekt av MIR-337-3p knockdown med MIR-337-3p inhibitor (50 nM) på paclitaxel følsomhet i H1155 celler. Vist er den relative cellelevedyktighet i nærvær av 16 nM paclitaxel normalisert til kontroll oligoer. (****, P 0,0001) (D) Cell syklusen analyse som en funksjon av MIR-337-3p overekspresjon og paclitaxel behandling. Fraksjonen av celler i G
1, S og G
2 faser ble estimert ved hjelp av Watson pragmatisk modell, idet forholdet mellom G
2 til G
1 fraksjoner for paclitaxel-behandlede celler normalisert til at observerte for kontroll forhold (R = [G
2 /G
1]
paclitaxel /[G
2 /G
1]
carrier).
Taxaner binder seg til β subenheten av tubulin og hemme de normale dynamikken i mikrotubulus demontering, noe som fører til stabiliserte mikrotubuli og langvarig arrest av celler i G
2 /M-fasen av cellesyklusen og til slutt til celledød [27 ], [28]. Vi sammenlignet effekten av MIR-337-3p over-uttrykk på cellesyklus med eller uten paclitaxel behandling, på et tidspunkt (16 h) før paclitaxel indusert betydelig apoptose. Som vist i figur 1D, i nærvær av paclitaxel, induserer MIR-337-3p etterligne en dramatisk G
2 /M rest, med en normalisert G
2 /G
1 forhold av R = 4,38, i forhold til R = 2,48 for kontroll oligo, R = 2,34 for MIR-337-5p etterligne, og R = 2,31 for mock transfeksjon, mens MIR-337-3p ikke påvirker cellesyklusfordelingen i fravær av paclitaxel.
de ovenfor angitte resultater indikerer at MIR-337-3p modulerer paclitaxel følsomhet i NCI-H1155-celler ved spesifikt å forbedre celle arrest i G
2 /M-fasen av cellesyklusen uten i vesentlig grad å påvirke celleoverlevelse alene.
Expression rekke analyse tyder på at mange av de antatte målene fra Mir-337-3p er nedregulert på mRNA-nivå ved MIR-337-3p over-uttrykk
for å omfattende søk etter målet gener som medierer effekten av MIR-337-3p på paclitaxel følsomheten NCI-H1155-celler, profilert vi genuttrykk av microarray for å identifisere utskrifter som er nedregulert av MIR-337-3p over-uttrykk, ettersom økende bevis viser at mirnas regulere målet genuttrykk gjennom avtagende mRNA nivåer [29]. Størrelsen av MIR-337-3p over-ekspresjon (figur 2A) er sammenlignbare forskjeller i endogen ekspresjon observert i forskjellige vev og mellom IMR-90-føtale lungefibroblaster og HBECs (figur S1). Siden de fleste nyere studier støtter perfekt komplementaritet mellom 7-merer i frøet regionen (som dekker posisjonene 1-8) av et modent miRNA med sekvenser i 3’UTR av mRNA-transkript som en kritisk faktor for samspillet mellom en miRNA og et mål gen [30], [31], vurderte vi korrelasjonen mellom ekspresjon og motiv innhold av mRNA-transkripter basert på forekomsten av 7-merer i sine 3’UTRs. Som vist i figur 2B, betydelig mer av 1,211 gener inneholdende 7-mer UAUAGGA komplementært til mir-337-3p frø sekvens – baser 2-8, ansett for å være den sterkeste determinant av miRNA: target interaksjon – nedgang i ekspresjon enn økning (p = 1,37 × 10
-2), hvorav 32 gener redusere ≥2 ganger og kun 3 gener øke ≥2 ganger (figur 2D). I motsetning til omtrent like mange av 19,262 gener ikke inneholder 7-mer nedgang og økning i uttrykk. Videre Figurene 2C og 2D viser at blant de 16,384 7-mere motiver forekommer i de 3’UTRs menneske mRNA transkripter, flere er overrepresentert i 3’UTRs av gener som sank i celler transient transfektert med MIR-337-3p etterligne forhold til en negativ kontroll etterligner (figur 2C), med bare 10 motiver som viser en signifikant negativ korrelasjon mellom mRNA ekspresjonsnivåer og deres nærvær i 3’UTRs (figur 2D). 5 av motivene tilsvarer frøet region av en kjent miRNA (MIR-337-3p), inkludert en motiv tilsvarende baser 2-8 og 4 tilsvarende stillinger 1-7 og 2-7, i samsvar med nyere arbeid på frø region fyrstikker [30], [31]. Interessant, fant vi at en motiv (GUAGGAA) inneholder en G: U basepar i posisjon 7, noe som tyder på at de faktorer som bestemmer miRNA mål kan omfatte ikke-Watson: Crick komplementaritet. Figur 2E viser at, selv om mange av målgener som er identifisert ved de 5 motivene overlapper hverandre, de ytterligere 4 motivene identifisere unike mål. Totalt sett resultatene ovenfor viser at et betydelig antall gener som inneholder antatte MIR-337-3p målse er nedregulert av MIR-337-3p på mRNA-nivå og fremheve verdien av et omfattende søk for miRNA mål basert på 7- mer komplementaritet til frøet regionen.
(A) Expression nivåer av MIR-337-3p etter 72 h transfeksjon av NCI-H1155-celler med 50 nM MIR-337-3p ligne målt ved QRT-PCR. (B) Histogram av endringer i mRNA uttrykk nivå som en funksjon av MIR-337-3p over-uttrykk. Barene i svart viser relative frekvenser av observerte log
2 fold endringer for alle gener, mens barene i rødt viser fordelingen for gener med 3’UTRs inneholder minst en 7-mer tilsvarer Mir-337-3p frø region. (C) Betydningen landskapet tomten for 7-merer på tvers av alle gener, sortert etter endring i uttrykk, fra de ble redusert til mest økt, viser 7-merer som er høyanriket i 3’UTRs av gener som er redusert i uttrykket. (D) Sammenheng mellom mRNA uttrykk og motiv innhold av 3’UTRs indusert av MIR-337-3p over-uttrykk. Vist er: (1) 7-mer motiv, markert for å vise komplementaritet til MIR-337-3p, (2) den regresjonen koeffisient, (3) en p-verdi, (4) det antall gener inneholdende motiv, (5 ) miRNA hvortil motiv tilsvarer, med de nukleotidposisjoner fullstendig komplementære til de merkede sekvensene i kolonne 1 i parentes, og antallet gener som (6) reduksjon i ekspresjon eller (7) økning i ekspresjon av ≥2 gangers . I kolonne 6, antall gener som inneholder den oppførte motiv, men ikke inneholder den kanoniske MIR-337-3p frø sekvens mål, er gitt i parentes. (E) Proporsjonalt Venn-diagram som viser sammenhengen mellom gener som reduserer ≥2 ganger i uttrykk og inneholder ett eller flere av de fem 7-merer som tilsvarer de modne MIR-337-3p sekvenser.
STAT3 Hotell og
RAP1A
er de direkte målene som medierer effekten av MIR-337-3p på paclitaxel følsomhet
Blant de genene nedregulert av MIR-337-3p ,
RAP1A Kjøpe og
STAT3
, som er nedregulert med 60% og 63% av MIR-337-3p over-uttrykk, henholdsvis, er begge spådd å være direkte mål av speil 337-3p (figur 3A) og er potensielt er involvert i reguleringen av paclitaxel følsomhet. For å validere disse samhandling, bygget vi luciferaserapportørplasmid vektorer som inneholder hvete 3’UTRs av
STAT3 Hotell og
RAP1A Hotell og tilhørende kontroll 3’UTRs med mutasjoner i det første og tredje nukleotider av målet språk sekvenser (figur 3a), som har vist seg å være avgjørende i forstyrre miRNA: målet interaksjoner [22]. Som vist i figur 3B, MIR-337-3p over-ekspresjon betydelig redusert luciferase-aktivitet i celler som uttrykker villtype 3’UTRs sammenlignet med ingen 3’UTR eller muterte 3’UTRs, viser at MIR-337-3p interagerer direkte med spesifikk nettsteder i 3’UTRs av
STAT3 Hotell og
RAP1A
. Figur 3C viser at effekten av MIR-337-3p på mRNA ekspresjonsnivåer av de to gener er forbundet med nedregulering av de endogene protein ekspresjonsnivåer i H1155 celler. Vi undersøkte videre effekten av MIR-337-3p overekspresjon på Stat3 og RAP1A nivåer i H1993, en NSCLC cellelinje som er definert som paclitaxel-resistente, med en udefinert IC
50. Som med H1155-celler, MIR-337-3p også nedregulerer STAT3 og RAP1A nivåer ved mRNA og proteinnivåene i H1993-celler, som vist i figur 3D. Disse resultatene tyder på at Mir-337-3p har en generell regulerende effekt på STAT3 og RAP1A uttrykk i lungekreftceller.
(A) MIR-337-3p og dens spådd samspill med målse i
RAP1A Hotell og
STAT3
. Vist er de strukturer og sekvenser av miRNA: målet interaksjoner for MIR-337-3p og 3’UTRs av
RAP1A Hotell og
STAT3
, og spådde fri energi av hybridisering. Frøet sekvens er uthevet i rødt. Baser endret ved seterettet mutagenese er understreket. (B) luciferase reporter assay. NCI-H1155-celler ble ko-transfektert med de indikerte oligoer og luciferase reporter vektorer. Luciferase og β-galaktosidase-aktivitet ble målt etter 72 timer, med luciferaseaktiviteten normalisert til p-galaktosidase-aktivitet. (C) Uttrykk for
RAP1A Hotell og
Stat3
mRNA og proteinnivåer etter 72 timer etter transfeksjon av NCI-H1155 celler med enten 50 nM MIR-337-3p, 25 nM siRNA rettet mot hverandre av genene eller negative kontroll oligoer. Vist er gjennomsnitts QRT-PCR resultatene av tre uavhengige transfections og representasjons Western blot bilder og kvantifisering av band intensiteter. (D)
RAP1A Hotell og
STAT3
mRNA og protein uttrykk i NCI-H1993-celler. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P. 0,001
For å kunne vurdere om
STAT3 Hotell og
RAP1A
megle effekten av MIR-337-3p på paclitaxel følsomhet, vi slått ned hvert gen individuelt og begge sammen. Figur 4A viser at knockdown av
STAT3 Hotell og
RAP1A
økte følsomheten av NCI-H1155 celler til paclitaxel behandling sammenlignet med kontroll oligonukleotider, men ikke signifikant påvirke celle overlevelse i fravær av paclitaxel . Ved å kombinere de to sirnas til halv konsentrasjon fører til en større nedgang i celle levedyktighet enn observert med enten siRNA alene (p = 0,017 for
RAP1A Hotell og p = 0,041 for
STAT3
), noe som antyder at den kombinerte knockdown har en synergistisk effekt på paclitaxel respons (figur 4B). Videre viser figur 4C at knockdown av
STAT3
eller
RAP1A
vesentlig bedre G
2 /M arrest i henhold paklitaksel behandling sammenlignet med kontroll oligonukleotider, med normalisert G
2 /G
1 forholdstall på R henholdsvis = 3.02 og R = 3,70,, i forhold til R = 1.93 for kontrollene og kan sammenlignes med R = 4.37 for transfeksjon med MIR-337-3p ligne.
( A) Effekt av knockdown av
RAP1A Hotell og
STAT3
uttrykk av siRNA på celle levedyktighet i nærvær og fravær av paclitaxel. Vist i rødt er celleviabilitet i 16 nM paclitaxel normalisert til levedyktighet i carrier som funksjon av økende konsentrasjoner av sirnas mot
RAP1A
eller
STAT3
. Vist i sort er celleviabilitet i fravær av paclitaxel. (B) Effekt av kombinert knockdown av
RAP1A Hotell og
STAT3
på paclitaxel følsomhet. Vist er den relative cellelevedyktighet i nærvær 16 nM paclitaxel normalisert til kontroll oligoer. (C) knockdown av STAT3 og RAP1A forbedrer paclitaxel-indusert G
2 /M rest som målt ved flow-cytometri. Forholdet (R) av G
2 til G
1 fraksjoner indusert ved paklitaxel behandling ble bestemt som ovenfor. (D) Celleviabilitet som en funksjon av oligo-konsentrasjon (MIR-337-3p etterligne eller negativ kontroll etterligner) i nærvær av cucurbitacin. *, P. 0,05
Økende bevis støtter bruk av Stat3 hemmere, som cucurbitacin, som terapeutiske midler i behandlingen av ulike kreftformer. Vi testet derfor effekten av MIR-337-3p over-ekspresjon av responsen av NCI-H1155-celler til behandling med cucurbitacin, cytotoksisiteten av disse er i det minste delvis basert på hemming av STAT3 aktivitet [32], [33]. Som vist i figur 4D, sensitizes MIR-337-3p ligne celler til cucurbitacin, redusere IC
50 fra 1,14 um (95% CI 1.3 til 1.28) til 0,37 mikrometer (95% KI 0,33 til 0,42) (p 0,0001), noe som indikerer at målretting både
STAT3
uttrykk med MIR-337-3p ligne og STAT3 aktivering med cucurbitacin har en synergistisk effekt på kreft celle overlevelse, og som tyder på at Mir-337-3p kan også tjene som en adjuvant til Stat3 hemmere.
MIR-337-3p sensitizes både paclitaxel-sensitive og paclitaxel-resistente cellelinjer samt de fra ulike histologiske subtyper
for å teste det generelle effekten av
