Abstract
Bakgrunn
T-celle immunoglobulin-3 (TIM-3) har vært etablert som et negativt regulerende molekyl og spiller en avgjørende rolle i immuntoleranse. TIM-3 er oppregulert i oppbrukt CD8
+ T-celler i både kronisk infeksjon og tumor. Men, arten av TIM-3
+ CD4
+ T-celler i svulsten mikromiljøet er uklart. Denne studien er å karakter TIM-3 uttrykker lymfocytter innen humane lungekreft vev og etablere kliniske betydningen av TIM-tre uttrykk i lungekreft progresjon.
Metodikk
Det er totalt 51 human lungekreft vev prøver ble innhentet fra patologisk bekreftet og nylig diagnostisert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter. Leukocytter fra tumorvev, distale normalt lungevev, og perifert blod mononukleære celler (PBMC) ble analysert for TIM-3-overflate-ekspresjon ved strømningscytometri. TIM-tre uttrykk i tumor-infiltrerende lymfocytter (Tīlss) ble korrelert med clinicopathological parametre.
Konklusjoner
TIM-3 er sterkt oppregulert på både CD4
+ og CD8
+ Tīls fra humane lungekreft vev, men ubetydelig uttrykt på T-celler fra pasientens perifere blod. Frekvenser av IFN-γ
+ celler ble redusert i TIM-3
+ CD8
+ Tīlss forhold til TIM-3
-CD8
+ Tīlss. Men nivået på TIM-tre uttrykk på CD8
+ Tīlss ikke klarte å assosiere med noen klinisk patologisk parameter. Interessant, fant vi at ca 70% av TIM-3
+ CD4
+ Tīlss uttrykt foxp3 og ca 60% av foxp3
+ Tīlss var TIM-3
+. Viktigere, TIM-tre uttrykk på CD4
+ T-celler korrelerte med dårlig clinicopathological parametre av NSCLC som nodal metastase og avanserte kreft stadier. Vår studie viser en ny rolle TIM-3 som en viktig immun regulator i svulsten mikromiljøet via sin dominerende uttrykk i regulatoriske T-celler
Citation. Gao X, Zhu Y, Li G, Huang H, Zhang G Wang F, et al. (2012) TIM-3 Expression Karakteriserer regulatoriske T-celler i tumorvev og er assosiert med Lung Cancer Progresjon. PLoS ONE 7 (2): e30676. doi: 10,1371 /journal.pone.0030676
Redaktør: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus tekniske universitet-Dresden, Tyskland
mottatt: 13 oktober 2011; Godkjent: 20 desember 2011; Publisert: 17 februar 2012
Copyright: © 2012 Gao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er delvis støttet av NSFC (National Natural Science Foundation of China) gir 30.528.008, Program for Changjiang Scholars og Innovativ Research team i University (IRT0849) og et prosjekt finansiert av Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu institusjon for høyere utdanning (PAPD) (til BL og XZ). BL ble delvis støttet av Young Investigator Award fra Cancer Research Institute og University of Pittsburgh Oppstart fond. QY støttes av Eleven-Fifth Mega-vitenskapelige prosjekt på «forebygging og behandling av AIDS, viral hepatitt og andre smittsomme sykdommer» (2008ZX10003-012). GL og XG støttes av et stipend fra Kina Scholarship Council. YZ er støttet av NSFC bevilgning 31170866, Jiangsu Natural Science Fund BK2011289 og Suzhou Social Development Project (SYS201009). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
svulst utvikling induserer antitumor immunresponser. Type 1 adaptive immunresponser mediert av Th1-celler og CTL, antas å være en viktig bestanddel av celleformidlet immunitet mot kreft [1]. Det er blitt vel etablert, men at mange tumor infiltrerende T-celler er i en tilstand av ikke-responsivitet på grunn av immunundertrykkende svulstens mikro [2], [3]. Regulatoriske T-celler og utmattelse av effektor T-celler er antatt å være to hoved-T-celle iboende mekanismer som gjør ineffektive anti-tumor immunresponser [2], [4], [5]. Flere molekylære reaksjonsveier, slik som TGFfi, IL-10, medlemmer av B7-familien er involvert i å etablere en tilstand av immunsuppresjon innenfor tumor [2], [6], [7], [8]. Forståelse av rollen av nye immun hemmende baner i formidling av immuntoleranse i svulsten mikromiljøet skal hjelpe forbedre immunterapi av kreft.
TIM-3 er uttrykt på Th1, Th17 celler og CD8 T-celler, men ikke Th2-celler [9], [10], [11]. Interaksjon mellom TIM-3 og dens ligand galectin-9 hemmer Th1 og Th17 respons [12] og induserer perifer toleranse [13], [14], som støtter en hemmende rolle TIM-3 i T-celle responser. TIM-tre uttrykk identifiserer også utslitte T-celler ved kronisk infeksjon. TIM-3-uttrykkende CD4
+ og CD8
+ T-celler produserer reduserte mengder av cytokin eller er mindre proliferativ respons på antigen. Blokade av TIM-3-signalveien gjenoppretter spredning og forbedrer cytokinproduksjon i HIV-1-spesifikke T-celler [15]. Nyere studier har støttet en viktig rolle TIM-tre T-celle utmattelse i kreft. Tim-3 og PD-1, en annen markør for T-celle-uttømming, er co-uttrykt på CD8 Tīlss i mus som bærer transplanterte tumorer, så vel som på NY-ESO-1-spesifikke CD8
+ T celler hos pasienter med fremskreden melanom [4], [5]. TIM-3
+ PD-1
+ T-celler som oppviser den mest alvorlige oppbrukt fenotype som definert ved unnlatelse av å spre seg og produserer IL-2, TNF og IFN-γ. Blokkering av både Tim-3 og PD-1 trasé er mer effektive i å kontrollere tumorvekst enn rettet mot enten svei alene, noe som antyder disse to baner virker synergistisk i å etablere T-celle-uttømming [4], [5].
I denne studien har vi undersøkt TIM-tre uttrykk i Tīlss i noen småcellet lungekreft (NSCLC). Vi har funnet at TIM-3 blir uttrykt i både CD4
+ og CD8
+ Tīlss i lungekreft vev. Både TIM-3
+ CD4
+ og TIM-3
+ CD8
+ -T-celler som produseres mye reduserte nivåer av IFN-γ i forhold til de i TIM-3
-CD4
+ og TIM-3
-CD8
+ T-celler henholdsvis. Interessant, TIM-tre uttrykk på CD4
+ T-celler, men ikke CD8
+ T-celler korrelerte med dårlig clinicopathological parametre av NSCLC som nodal metastase og avanserte kreft stadier. Påfallende, ca 70% av TIM-3
+ CD4
+ Tīlss uttrykt foxp3 og ca 60% av foxp3
+ Tīlss var TIM-3
+. I kontrast, ble TIM-3 minimalt uttrykt i perifere CD4
+ T-celler, tregs, og CD8
+ T-celler. Disse dataene antyder en ny rolle TIM-3 i tumorassosierte regulatoriske T-celler og dens betydning i menneskelig kreft progresjon.
Materialer og metoder
Valg av vevsprøver
En totalt 51 lunge kreft vevsprøver ble oppnådd fra patologisk bekreftet og nylig diagnostisert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter som fikk drift fra oktober 2009 til mai 2011 i Cardiothoracic kirurgi Department of First Affiliated Hospital, Suzhouuniversitetet i denne studien . I tillegg ble 51 tilfeller av tilstøtende normale vev fra ikke-ondartede parti resekterte og valgt som kontroller. Den normale vev var minst 5 cm bort fra den synlige tumormassen. Autologe perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert fra helt blod ved hjelp av Ficoll tetthetsgradient-sentrifugering før bruk. Denne studien ble godkjent av etisk komité av First Affiliated Hospital of Suzhouuniversitetet. Dataene ble analysert anonymt og informert samtykke ble ikke nødvendig.
Harvest of tumor infiltrerer lymfocytter (Tīlss)
svulstvev og tilstøtende normalt vev fra samme pasient ble hakket og fordøyd med collagenase fordøyelsen løsning (1 mg /ml kollagenase IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i RPMI1640) ved 37 ° C i 45 min. Stykkene ble deretter overført til stålnett og en enkelt cellesuspensjon ble fremstilt ved mekanisk maling. Tīlss ble ytterligere renset ved gradient som per produsent protokollen, vasket og re-suspendert i Hanks media for ulike analyser.
Mus
6-8 ukers gamle kvinnelige C57BL /6 mus var brukes i tumorforsøk. Alle dyrene ble opprettholdt under patogenfrie forhold i Dyreavdelingen ved Universitetet i Pittsburgh eller Suzhouuniversitetet. Alle dyr arbeid har blitt godkjent av institusjon Animal Care og bruk komité ved University of Pittsburgh (protokollnummer 0906824). For svulst modellforsøk, ble musene utfordret med 2 × 10
5 B16F0 celler i.d. og tumorprøver ble fjernet for analyse rundt dag 20 som beskrevet tidligere [16].
In vitro T-celle stimulering
Naive T-celler ble renset fra PBMC av friske donorer ved hjelp tappe anti-CD45RO antistoff og Stemsep® human T-celle berikelse kit (StemCell teknologier, Vancouver, British Columbia, Canada). Renheten av T-celler var mer enn 90%. Celler ble stimulert med 1 pg /ml plate-bundet anti-CD3 (klon OKT3) og 2 pg /ml platebundet anti-CD28-mAbs i opptil 72 timer.
For å isolere Tregs, PBMC ble farget med fykoerytrin-cyanin Dye7 (PECY7) konjugert anti-CD4-mAb (RPA-T4) og anti-CD25 fykoerytrin (PE) (BC96). En MoFlo cytometer (Beckman-Coulter, Brea, CA USA) ble anvendt for å isolere CD4
+ CD25
høye celler. Disse celler ble deretter stimulert med anti-CD3 (1 pg /ml) og anti-CD28 (2 ug /ml) i nærvær av IL-2 (200 U /ml, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). 24, 48, og 72 timer senere ble cellene høstet for videre analyse
Antistoffer og flowcytometrisk analyse
direkte konjugert anti-humane antistoffer mot de følgende overflatemolekyler ble anvendt:. Anti-CD4 (RPA-T4) og anti-CD8 (RPA-T8) ble erholdt fra Beckman Coulter. Anti-TIM-3 (344823), ble anti-PD-1 (2H7), og anti-CD25 (BC96) kjøpt fra R & D Systems. Følgende monoklonale antistoffer spesifikke for mus antigener ble kjøpt fra eBioscience (San Diego, California, USA): CD4 (GK1.5), CD8 (53 til 6,7), Tim-3 (RMT3-23) og foxp3 (FJK-16) . Flowcytometrisk analyse ble utført ved hjelp av en FACS strømningscytometer.
For intracellulær cytokin farging ble menneskelige Tīlss høstet fra lungekreft prøver, stimulert med plate-bundet anti-CD3 mAbs (1 mikrogram /ml) og plate-innbundet anti-CD28-mAbs (2 ug /ml) i 16 timer og inkubert i de siste 3 timene med Brefeldin A (10 ug /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler ble overført til en V-bunnplate, farget med anti-CD4 eller anti-CD8 i Hanks buffer (inneholdende 1% FCS), deretter fiksert med fiksering medium, hvilket ble etterfulgt av permeabiliseringen medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Cellene ble deretter farget med anti-IFN-γ antistoff (4S.B3, Biolegend, San Diego, CA, USA). Celler som produserer IFN-γ ble undersøkt med flowcytometri.
For analyse av foxp3 uttrykk, ble Tīlss først farget med anti-CD4-PECY7, anti-CD25-PECY5 og anti-TIM-3-PE eller anti -PD-1-PE, etter fiksering og permeabilization ble cellene inkubert med FITC-konjugert anti-human foxp3 (259D, BioLegend, San Diego, CA, USA), basert på produsentens anbefalinger, og utsatt for flowcytometrisk analyse.
Statistisk analyse
statistiske analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 5.0 programvarepakke (GraphPad Software, Inc., San Diego, USA). Student t-test, en-veis ANOVA og minst signifikant forskjell (LSD) -t-testen ble benyttet der dette er hensiktsmessig. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Siden TIM-3 er involvert i T-celle utmattelse, bestemte vi oss for å undersøke dens uttrykk på Tīlss i lungekreft prøver. Leukocytter fra tumorvev, distale normalt lungevev, og PBMC ble analysert for TIM-3-overflate-ekspresjon ved strømningscytometri. Den ikke-spesifikk farging ble kontrollert av isotype kontroll IgG-antistoff (figur S1). Mer enn 90% av CD4
+ celler var positive for CD3 etter vår renseprosedyren og valg av lymfocytt-porten under flowcytometrisk analyse. I vår lungekreft pasientgruppe, er det funnet at TIM-3 ble uttrykt i gjennomsnitt på rundt 30% av CD4
+ Tīlss og CD8
+ Tīlss (figur 1A og 1B). Prosentandelen av TIM-3
+ CD4
+ og TIM-3
+ CD8
+ Tīlss i de fjerntliggende normale lungevev redusert til ca 18% og 15% henholdsvis (figur 1A og 1B) . I motsetning til dette var ubetydelig ekspresjon av TIM-3 på den T-celler i blodet fra disse pasientene (figur 1A og 1B). Derfor TIM-3 ekspresjon var spesifikt oppregulert på T-celler i den normale lunge vev og ytterligere økning i kreftvevet. En fersk rapport viser at, i PBMC isolert fra avansert melanom pasient, en fraksjon av PD-1
+ NY-ESO-1-spesifikke CD8
+ T-celler ko-uttrykt TIM-3 og PD-1 og disse celler var mer dysfunksjonell enn TIM-3
-PD-en
+ og TIM-3
-PD-en
– kolleger [4]. Vi studerte PD-1 og TIM-tre uttrykk på Tīlss fra lungekreft vev. PD-1 ble uttrykt i mer enn 65% av Tīls fra både normale og kreft lungevev (figur 1C). Flertallet av TIM-3
+ Tīlss var PD-1
+ i lungevevet. I motsetning til dette var 10% av T-celler i perifert blod positiv til PD-1 (figur 1C). Dermed fant vi at et stort antall TIM-3
+ PD-1
+ T celler ble beriket i lungekreft vev. Dette er i tråd med det faktum at mange av T-celler i kreftvevet er dysfunksjonell sannsynlig på grunn av utmattelse eller anergi.
Tumor infiltrerer lymfocytter (Tīlss) ble høstet fra lungekreft vev, tilstøtende normalt vev, og perifert blod monouclear celler (PBMC) fra helblod fra pasienten. Cellene ble så farget for CD4, CD8, TIM-3 og PD-1. A. Representative dot-plott viser TIM-tre uttrykk på CD4
+ og CD8
+ T-celler i ulike vev fra lungekreftpasienter. -Lymfocytter ble gated for videre analyse av CD4 og CD8 T-celler. Mer enn 90% CD4
+ eller CD8
+ celler CD3
+. B. sammenfattet resultatene av prosent (%) av TIM-3 ekspresjon på CD4
+ og CD8
+ T-celler fra lungekreftpasienter er vist. Vannrette streker viser den gjennomsnittlige andelen av TIM-tre uttrykk på CD4
+ og CD8
+ T-celler. Feilfelt: S.E.M. C. Dual uttrykk for TIM-3 og PD-1 på gated CD4
+ og CD8
+ T celler er vist. P-verdiene ble beregnet ved bruk av enveis ANOVA.
Siden det har blitt vist at antigen-spesifikke TIM-3
+ CD8
+ T-celler er funksjonelt utmattet i kronisk infeksjon og kreftpasienter, bestemte vi oss for å undersøke om TIM-3 også merket dysfunksjonelle T-celler i Tīlss i lungekreft vev. Tīlss ble stimulert med anti-CD3 og anti-CD28 i 16 timer og analysert med hensyn på IFN-γ produksjon ved strømningscytometri. Vi har funnet at i gjennomsnitt 5% TIM-3
-CD8
+ Tīlss er IFN-γ
+ på ex vivo stimulering med anti-CD3 (figur 2A, 2C). I motsetning til dette ble frekvensen av IFN-y-produkt betydelig redusert i TIM-3
+ CD8
+ Tīlss (figur 2A, 2C). Dermed våre data er i tråd med ideen om at TIM-3 merker funksjonell utmattelse av CD8 T-celle i humane kreftvevet, i holde med den nylige funn ved hjelp av transplantasjon mus tumor modell [5].
Tīlss ble høstet fra lungekreft vev. Cellene ble deretter stimulert med plate-bundet anti-CD3-mAb (1 pg /ml) og plate-bundet anti-CD28-mAbs (2 ug /ml) i 16 timer og inkubert i de siste 3 timene med Brefeldin A (10 ug /ml ). Celler som produserer IFN-γ ble undersøkt med intracellulær cytokin farging og flowcytometri. (A og B). Representative prikk plott fra en pasient viste andelen TIM-3
+ IFN-γ
+ og TIM-3
IFN-γ
+ innen CD8
+ eller CD4
+ T-cellerommet. Viste data er representative for seks uavhengige eksperimenter. C. Den gjennomsnittlige prosentandelen av IFN-γ-produserende CD8
+ eller CD4
+ T-celler blant TIM-3
+ og TIM-3
– fraksjoner er vist
.
i tillegg til CD8
+ Tīls, TIM-3 ble funnet uttrykt på CD4
+ Tīlss i human lungekreft (figur 1), så vel som hos mus transplantert tumor [5]. Tim-3 ble også sterkt uttrykt på Th1 og Th17-celler og viktig for å inhibere funksjonen av disse cellene [10]. Enten TIM-3 karakterer CD4
+ T-celle dysfunksjon er imidlertid ikke sikkert. Vi deretter satt ut undersøke hyppigheten av IFN-y-produserende CD4
+ Tīlss med hensyn til TIM-3 overflate-ekspresjon. Vi har funnet ca 2% av TIM-3
-CD4
+ Tīlss var IFN-y-produkt ved ex vivo stimulering med anti-CD3 (figur 2B). I kontrast, andelen av IFN-γ
+ celler ble betydelig redusert i TIM-3
+ CD4
+ Tīlss (figur 2B og 2C).
Det er vel etablert at regulatorisk T-celler er en dominerende populasjon av CD4
+ T-celler blant Tīlss [3]. Fordi tregs er også funksjonelt anergiske, så bestemte vi oss for å finne ut om TIM-3 er uttrykt i regulatoriske T-celler blant Tīlss bruker foxp3 som markør. Til vår overraskelse, selv om 17% av CD4
+ Tīlss var foxp3
+ Tregs, ca 70% av TIM-3
+ CD4
+ Tīlss var foxp3
+ (Fig. 3A). I tillegg uttrykkes omtrent 60% av foxp3
+ CD4
+ Tīlss TIM-3 på sin overflate (fig. 3A). Dermed TIM-3
+ CD4
+ T-celler var overveiende Tregs og de fleste av tregs innen lungekreft Tīlss sterkt oppregulert TIM-tre uttrykk. I tråd med disse dataene, alt foxp3
+ CD4
+ Tīlss uttrykke PD1 (Fig. 3B). I motsetning til høy ekspresjon av TIM-3 i Tīls, minimal ekspresjon av TIM-3 ble funnet på verken konvensjonelle T-celler eller Tregs i perifert blod (data ikke vist).
Tīlss ble høstet fra lungekreft vev. Cellene ble så farget for CD4, TIM-3, og foxp3 (A) eller CD4, PD-1, og foxp3 (B). -Lymfocytter ble gated for videre analyse av CD4 og CD8 T-celler. Prosentandelen av hver populasjon innenfor CD4
+ T-celledelen ble indikert. Viste data er representative for fem uavhengige eksperimenter.
Siden TIM-3 ble vist å være oppregulert i T-celler ved in vitro kultur i nærvær av TCR stimulering [10], bestemte vi oss for å undersøke om Tregs kan bli stimulert til å uttrykke TIM-3. Som en kontroll, humane CD4
+ og CD8
+ T-celler ble stimulert med anti-CD3 og anti-CD28 i 72 timer. Hver 24. time, undersøkte vi TIM-3 og PD-1 uttrykk. Både PD-1 og TIM-3 ble oppregulert på rundt 48 timer og videre oppregulert på 72 timer i både CD4
+ og CD8
+ T-celler (fig. 4A og 4B). Vi testet om TIM-3 kan være like oppregulert i regulatoriske T-celler. Vi beriket menneske Tregs ved å isolere CD4
+ CD25
høye T-celler ved hjelp av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Deretter stimulert vi at disse T-celler med anti-CD3 og anti-CD28 i nærvær av IL-2 i 72 timer. Ekspresjonen av TIM-3 og foxp3 ble undersøkt etter 48 timer og 72 timer. TIM-3 blir uttrykt ved et ubetydelig nivå i begge ustimulert naive CD4
+ T-celler og Tregs (data ikke vist). Sammenlignet med ikke-stimulerte T-celler, TIM-3 ekspresjon var signifikant oppregulert etter 48 timer og ytterligere øket ved (4C Fig.) 72 timer. Ved 72 timer ca 25% av den foxp3
+ T-celler ble TIM-3 positive (fig. 4C). Til sammen tyder disse data på at TIM-3 er oppregulert på både konvensjonelle T-celler og Tregs ved stimulering via TCR.
(A og B). Menneske naive T-celler ble renset fra PBMC helse givere. Cellene ble deretter stimulert med plate-bundet anti-CD3 pluss anti-CD28-mAb. 24, 48 og 72 timer senere ble cellene samlet opp og farget for CD4, CD8, TIM-3 og PD-1. Ekspresjon av PD-1 og TIM-3 ble analysert ved hjelp av strømningscytometri på gated CD4
+ (A) eller CD8
+ (B) T-celler. C. CD4
+ CD25
høye T-celler ble isolert fra perifert blod ved FACS. Disse celler ble deretter stimulert med anti-CD3 og anti-CD28 i nærvær av IL-2 (200 U /ml). 24, 48 og 72 timer senere ble cellene høstet og farget for CD4, TIM-3 og foxp3. Uttrykket av TIM-3 på CD4
+ foxp3
+ T-celler er vist. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Siden TIM-3 er sterkt uttrykt i Tīlss isolert fra lungekreft vev, så bestemt vi om TIM-tre uttrykk hatt noen klinisk betydning ved å korrelere TIM-tre uttrykk med kliniske patologiske parametere. Vi har funnet andelen av CD4
+ og CD8
+ T-celler i Tīlss ble ikke assosiert med kliniske patologiske parametere. Forholdet mellom CD4 versus CD8 også unnlatt å vise noen klinisk betydning (tabell 1). I tillegg gjorde hyppigheten av TIM-3 på CD8 T-celler ikke viser noen klinisk betydning (tabell 2). I kontrast, jo høyere frekvens av TIM-3
+ CD4
+ Tīlss viste signifikant sammenheng med lymfeknutemetastase og mer avanserte kreft stadier (tabell 2). Dermed blir TIM-tre uttrykk på CD4
+ Tīlss er assosiert med lungekreft progresjon.
I tillegg til menneskelig foxp3
+ Tīlss, vi undersøkte Tim-3 uttrykk på mus foxp3
+ Tīlss. Vi brukte B16 modellen fordi Tim-3
+ CD4
+ Tīlss ble nylig beskrevet i denne modellen [5]. Innenfor B16 svulst, fant vi ca 50% av den foxp3
+ CD4
+ Tīlss uttrykt Tim-3 (fig. 5). I motsetning til dette, foxp3
-CD4
+ Tīlss uttrykt neglisjerbare nivåer av Tim-3 (fig. 5). Tim-3 ble uttrykt i minimale nivåer i milt og lymfeknute CD4
+ -T-celler, uavhengig av foxp3 ekspresjon (fig. 5). Dermed Tim-3 er hovedsakelig til stede på en undergruppe av foxp3
+ CD4
+ regulatoriske T-celler i både mennesker og mus svulster.
6-8 uker gamle C57BL /6 mus var inokulert med 2 × 10
5 B16F0 celler id, tumorprøver, milten og lymfeknuter ble fjernet når tumor størrelser nådde rundt 15 mm i diameter på dag 20. Tīlss, splenocytes og lymfeknute celler ble isolert for analyse av strømning cytometri. Tim-tre uttrykk på mus CD4
+ foxp3
+ eller CD4
+ foxp3
– T-celler er vist. Viste data er representative for fem uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi TIM-tre uttrykk i Tīlss fra NSCLC prøver. Vi fant høye nivåer av TIM-tre uttrykk på både CD4
+ og CD8
+ Tīlss. Viktigere, selv om TIM-tre overflate uttrykk har blitt rapportert å indikere et funksjonelt anergiske tilstand av CD8
+ Tīlss, fant vi at TIM-tre uttrykk på CD8
+ Tīlss ikke klarte å assosiere med clinicopathological parametre i lungekreft, men hyppigheten av TIM-tre uttrykk på CD4
+ Tīlss gjorde forbinder med lymfeknutemetastase og mer avanserte kreft stadier. Videre analyser viste at TIM-3
+ CD4
+ T-celler var overveiende foxp3
+ og flertallet av foxp3
+ CD4
+ T-celler uttrykte TIM-3. Vår studie viser en ny rolle TIM-3 i svulsten mikromiljøet via sin dominerende uttrykk i regulatoriske T-celler.
Det er interessant at vi har funnet uttrykk for TIM-3 på en stor andel av tregs innen lungekreft vev. Våre data mining avslørte også at Tim-3 mRNA ble uttrykt i naturlig foxp3
+ CD4
+ T-celler som er blitt adoptivt overført til Rag1 mangelfulle mus og foxp3 er nødvendig for Tim-3-ekspresjon i disse treg-celler (figur S2) [17], som tyder på Tim-3 ekspresjon i Tregs kan være en integrert del av foxp3 regulert nettverk innenfor naturlig Tregs. Vi har videre vist at TIM-3 ikke blir konstitutivt uttrykt ved Tregs i humant perifert blod, men kan induseres ved TCR-stimulering. Grunnen til at TIM-3 er sterkt uttrykt i foxp3
+ CD4
+ Tīlss kan skyldes konstant stimulering av tumorassosierte antigener i tumorstedet.
Den eksakte rolle TIM-3 i svulsten infiltrere tregs er fortsatt ikke kjent. Våre data antyder at TIM-3
+ Tregs i lungekreft vev kan være avledet fra naturlige Tregs ved kronisk TCR-stimulering av tumorantigener. PD-1 ligand B7-H1 og TIM-3-ligander så som galectin-9 og apoptotiske celler i tumorvevet kan være viktig for å opprettholde antallet og funksjon av TIM-3
+ PD-1
+ Tregs. I transplantasjon innstilling, ble Tim-3 vist seg å regulere allospesifikk Treg aktivering [14]. Det ble vist at Tim-3-Tim-3L-sensitive veien var involvert i den funksjonelle generasjon av donorspesifikke Tregs ved administrering av tolerer behandlinger [14]. I samsvar med denne ideen, og Tim-3 har nylig blitt rapportert å bli uttrykt i omtrent 15% av foxp3
+ Treg celler i milten under allo-transplantasjon [18]. Vår studie, ved å avsløre høye nivåer av TIM-tre uttrykk på tregs innenfor menneskelig svulst, tyder på at TIM-3 kan spille en direkte rolle i den funksjonelle modning av tumor infiltrerer Tregs ved å levere et signal innenfor Tregs eller kan være viktig for å opprettholde det immunsuppressive funksjonen til disse Tregs i svulsten mikromiljøet.
i tillegg til naturlig tregs, TIM-3 og PD-1 kan også spille en rolle i generering av adaptive Tregs. Faktisk ble PD-1 ligand vist seg å være involvert i genereringen av adaptive Tregs i tumor drenering lymfeknuter [19]. Galectin-9 ble vist å beskjedent øke foxp3 ekspresjon in vitro modell av Tregs induksjon av TGF-β [18], [20]. Hvorvidt Tregs funnet i våre studier er adaptive eller naturlige treg vil bli gjenstand for videre studier.
TIM-3 har dukket opp som et lovende mål for kreft immunterapi [21]. Nyere studier har fokusert på rollen som TIM-tre uttrykk på CD8
+ T-celler i perifert blod samt innenfor svulster [4], [5]. Disse studie elegant demonstrert at TIM-3 merker funksjonelt utslitte CD8
+ T-celler og er trolig ansvarlig for svikt i immunosurveillance og tumor vaksinasjon. Vår studie viser at uttrykket av TIM-3 på CD4
+ Tīlss celler signifikant assosiert med dårligere kliniske patologiske parametre i lungekreft. Derfor TIM-3 spiller sannsynligvis en viktig rolle i tumorprogresjon ved å opprettholde den tumor immunundertrykkende miljøet via Tregs. Ytterligere karakterisering av TIM-tre uttrykk og funksjon innenfor ulike Tīlss undergrupper bør forbedre vår kunnskap om de underliggende mekanismene for TIM-3-mediert immunsuppresjon innen svulsten mikromiljøet.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
TIM-tre uttrykk ved flowcytometri. Tumor infiltrerer lymfocytter (Tīlss) ble høstet fra lungekreft vev, tilstøtende normalt vev, og perifert blod monouclear celler (PBMC) fra fullblod av pasientene. Cellene ble så farget for CD4 og TIM-3 eller CD4 pluss en kontroll IgG-antistoff. Celler i lymfocytt gate ble videre analysert for CD4 og TIM-tre uttrykk
doi:. 10,1371 /journal.pone.0030676.s001 plakater (PPT)
Figur S2.
Tim-tre uttrykk i native Tregs og sin avhengighet av foxp3. NCBI GEO profildatabase ble forespurt for Tim-tre uttrykk i tregs. Et resultat viste at Tim-3 er nedregulert i foxp3 mangel innfødte Tregs som vist her. Datasett Record GDS2525
doi:. 10,1371 /journal.pone.0030676.s002 plakater (PPT)
Takk
Forfatterne takker legene. Olivera Finn, Larry Kane, og Lujun Chen for å lese manuskriptet og nyttig diskusjon.
