Abstract
Droplet digital PCR (ddPCR) kan brukes til å oppdage lavfrekvente mutasjoner i onkogen drevet lunge kreft. Utvalget av
KRAS
punktmutasjoner observert i NSCLC nødvendiggjør en multiplex tilnærming til effektiv mutasjonsdeteksjon i sirkulerende DNA. Her rapporterer vi design og optimalisering av tre diskriminerende ddPCR multiplex analyser undersøker ni forskjellige
KRAS
mutasjoner ved hjelp PrimePCR ™ ddPCR ™ Mutasjon Analyser og Bio-Rad QX100 system. Sammen disse mutasjonene står for 95% av nucleotide endringene finnes i
KRAS
i menneskelig kreft. Multiplex reaksjoner ble optimalisert på genomisk DNA ekstrahert fra
KRAS
mutant cellelinjer og testet på DNA ekstrahert fra fast tumor vev fra en kohort av lungekreftpasienter uten forutgående kunnskap om spesifikke
KRAS
genotype. Multipleks ddPCR analysene hadde en deteksjonsgrense på bedre enn en mutant
KRAS
molekyl i 2000 villtype
KRAS
molekyler, som sammenlignet gunstig med en deteksjonsgrense på 1 i 50 for neste generasjon sekvensering og en i 10 til Sanger-sekvensering. Multiplex ddPCR analyser således gi en svært effektiv metode for å identifisere
KRAS
mutasjoner i lunge adenokarsinom
Citation:. Pender A, Garcia-Murillas jeg, Rana S, Cutts RJ, Kelly G, Fenwick K , et al. (2015) Effektiv Genotyping av
KRAS
Mutant Ikke-småcellet lungekreft Ved hjelp av en multiplekset Droplet Digital PCR tilnærming. PLoS ONE 10 (9): e0139074. doi: 10,1371 /journal.pone.0139074
Redaktør: Giuseppe Viglietto, UNIVERSITY Magna Graecia, ITALIA
mottatt: 12 februar 2015; Godkjent: 09.09.2015; Publisert: 28.09.2015
Copyright: © 2015 Pender et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:. forfatterne ønsker å takke for støtten fra dette arbeidet av National Health service (England), gjennom finansiering til National Institute for Health Research Biomedical Research Centre ved The kongelig Marsden Hospital. De har også takknemlig erkjenner midler fra Institutt for kreftforskning og Cancer Research UK, Stratifisert Medicine Programme. Denne forskningen ble også støttet delvis av Revere Charitable Trust, en ubegrenset utdanningstilskudd fra Pierre-Fabre Ltd, European Research Council Advanced Grant RASTARGET og Wellcome Trust Senior Investigator Award, 103799 /Z /14 /Z. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Bevilgningen levert av Pierre-Fabre Ltd. representerer ikke et konkurrerende interesse for alle av forfatterne, og ingen annen relevant erklæring om sysselsetting, rådgivning, patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter som kreves. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis [1] og over 20 000 tilfeller av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ble diagnostisert i Storbritannia i 2012 [2]. De hyppigst muterte onkogener i lunge adenokarsinom er
RAS
familie GTPases og
EGFR plakater (25% og 15% henholdsvis [3]). Kjennskap til molekyl profilen av avansert lunge adenokarsinom er kritisk for terapeutisk beslutnings [4], særlig i anvendelse av EGFR og ALK tyrosinkinaseinhibitorer [5,6]. Tilstedeværelsen av en
KRAS
mutasjon kan også være av terapeutisk relevans hvis MEK hemmer og taxan kombinasjoner bevise effekt hos denne pasient kohort [7]. Innhenting tilstrekkelig svulstvev for avgjørende genotyping i lungekreft kan være problematisk, men [8]. Dråpe digital PCR (ddPCR) er en følsom metode for kvantitativ påvisning mutasjonen [9,10] som har potensial til å nøyaktig genotype pasient-avledet materiale fra en liten mengde av utgangsmateriale.
Påvisning av
KRAS
hotspot mutasjoner av ddPCR har blitt begrenset av mange potensielle alleler innenfor tilstøtende loci, selv om noen
KRAS
mutasjoner oppstår oftere i kreft enn andre (tabell 1 og 2). De fire vanligste mutasjoner står for 80% av alle KRAS nucleotide endringer som finnes i kreft hos mennesker (85% av alle endringer i NSCLC), mens de ni vanligste mutasjonene står for 95% av alle endringer og 97,5% av endringer i NSCLC. Fluorophore-merkede digital PCR prober utfylle et bestemt mutant DNA sekvens og så bare oppdage en bestemt
KRAS
mutasjon. Ved hjelp av disse analyser i duplex med en probe for å detektere mutant allel og en sonde for å påvise villtype-allelet tillate mutant allel brøkregning for en gitt mutasjon, men denne tilnærmingen krever potensielt flere analyser og bruk av mer materiale før korrekt identifikasjon av genotypen. Utvikling av en multipleks assay som kombinerer flere forskjellige mutant-prober i den samme reaksjons er derfor et attraktivt alternativ. Multiplex
KRAS
digitale PCR-analyser har blitt beskrevet med regndråpe ™ Digital PCR system (Raindance Technologies, Billerica, Massachusetts, USA) i avansert kolorektal kreft [11], men ikke ennå med Bio-Rad QX100 system, en rimelig digital PCR system med kommersielt tilgjengelige prober for flere
KRAS
mutasjoner, og heller ikke har en multiplex verktøy blitt brukt i lungekreft.
Vi setter ut for å designe multiplex digital PCR-analyser som ville nøyaktig identifisere ni forskjellige
KRAS
mutasjoner og for å demonstrere anvendelsen av disse analysene til pasient-avledet materiale ved hjelp av Bio-Rad QX100 system.
materialer og Metoder
Digital PCR-prøveassays
Hver digital PCR sonde er et oligonukleotid spesifikt til regionen av interesse med en 5 «fluoroforen og en 3» drikk. Fluoroforen er enten HEX for prober som er spesifikke for villtype-sekvenser eller FAM for mutante prober.
KRAS
c.35G T (G12V;. Katt ingen dHsaCP2500592), c.35G A (G12D;. Katt ingen dHsaCP2500596), c.35G C (G12A;. Katt ingen dHsaCP2500586), c .34G A (G12S;. katt ingen dHsaCP2500588), c.34G C (G12R;. katt ingen dHsaCP2500590), c.34G T (G12C, dHsaCP2500584), c.37G T (G13C;. katt ingen dHsaCP2500595 ), c.38G A (G13D;. katt ingen dHsaCP2500598), c.183A C (Q61H;. katt ingen dHsaCP2000133), WT for c.35G T (WT for G12V;. katt ingen dHsaCP2500593), WT for c.35G A (WT for G12D;. katt ingen dHsaCP2000002), WT for c.35G C (WT for G12A;. katt ingen dHsaCP2000004), WT for c.34G A (WT for G12S,. katt ingen dHsaCP2000012 ), WT for c.34G C (WT for G12R;. katt ingen dHsaCP2000010), WT for c.34G T (WT for G12C,. katt ingen dHsaCP2000008), WT for c.37G T (WT for G13C; cat ingen dHsaCP2500595), WT for c.38G . A (WT for G13D;. katt ingen dHsaCP2000014) og WT for c.183A C (WT for Q61H;. katt ingen dHsaCP2000132) 20x PrimePCR ™ ddPCR ™ mutasjonstest (som inneholder både primere og ddPCR prober) ble kjøpt fra Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA) og brukt i denne studien.
analysen optimalisering og DNA kvantifisering
Digital PCR-analyser ble optimalisert ved bruk av cellelinje genomisk DNA (gDNA), eller syntetiske oligonukleotider som er aktuelt. Cellelinjer som benyttes for denne studien ble autentisert bruker STR profilering av celle Services anlegget på Cancer Research UK London Research Institute og Institute of Cancer Research. Disse inkluderte NCI-H727 (
KRAS
G12V, lunge), NCI-H358 (
KRAS
G12C, lunge), A549 (
KRAS
G12S, lunge), SK- LU-en (
KRAS
G12D, lunge), A427 (
KRAS
G12D, lunge), HCT-116 (
KRAS
G13D, tykktarm) og NCI-H1975 (
KRAS
WT, lunge). Alle cellelinjer ble gitt direkte av Cancer Research UK Cell Services med unntak av HCT-116 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, katt ingen ATCC
®CCL-247
TM.). Cell gDNA ble ekstrahert med DNeasy ™ blod og vev Kit (Qiagen, Venlo, Limburg, Nederland) i henhold til produsentens anvisninger. Alle DNA brukes i påfølgende digitale PCR reaksjoner, bortsett fra syntetiske oligonukleotider, ble kvantifisert på en QX100 ddPCR systemet med menneskelig RNase P TaqMan® Kopier nummer Referanse analysen (Life Technologies Corporation, Carlsbad, California, USA). 1 ul av eluatet ble tilsatt til en digital PCR-reaksjon inneholdende 10 ul ddPCR Supermix for prober (Bio-Rad) og 1 pl av TaqMan Copy Number referanse Assay, human, RNase P (Life Technologies) i et totalvolum på 20 ul. Reaksjonen ble delt inn ~ 14 000 dråper per prøve i en QX-100 dråpegenerator i henhold til produsentens instruksjoner. Emulgert PCR-reaksjoner ble kjørt på en 96-brønners plate (Eppendorf, Stevenage, UK) på en G-Storm GS4 thermal cycler (G-Storm, Somerton, Somerset, UK) inkubering av platene ved 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 60 sekunder, etterfulgt av 10 minutters inkubering ved 98 ° C. Temperaturen rampen tilveksten var 2,5 ° C /sek for alle trinn. Platene ble avlest på en Bio-Rad QX-100 dråpe leseren bruker QuantaSoft v1.4.0.99 programvare (Bio-Rad). Minst én negative kontrollbrønner uten DNA ble inkludert i hvert løp. Mengden av forsterkbare RNase P-DNA ble kvantifisert fra konsentrasjonen gitt av programvaren. Etter kvantifisering, ble cellelinje DNA fordøyd hjelp Hind 3-HF ™ restriksjonsenzym (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA) ved 37 ° C i 1 time.
Droplet digital PCR for KRAS mutasjonsdeteksjon
PCR-reaksjonsblandinger ble fremstilt i et totalvolum på 20 pl inneholdende: 10 ul 2x Supermix for prober uten dUTP (Bio-Rad), relevante primer probe assays, DNA (variabelt volum) og nuklease-fritt vann (Life Technologies Corporation, Carlsbad, California, USA). Flere brønner ble benyttet hvis det er nødvendig for å analysere den nødvendige DNA-eluat. Minst 500 pg ekvivalent av DNA eluatet ble analysert i hver multipleks assay for hver enkelt pasient. 20 ul av PCR-reaksjonsblandingen ble overført til en prøvebrønn i et engangsdråpegeneratoren kassett (Bio-Rad). 70 pl dråpe generasjon olje (Bio-Rad) ble deretter lastet inn i oljebrønnen for hver kanal og kassetten som er lagt inn i en QX100 dråpegeneratoren (Bio-Rad). Dråpene ble deretter overført til en 96-brønners PCR-plate. Emulgert PCR-reaksjoner ble kjørt på en G-Storm GS4 thermal cycler inkubering av platene ved 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder og 54 ° C i 60 sekunder, etterfulgt av 10 minutters inkubering ved 98 ° C. Temperaturen rampen tilveksten var 2,5 ° C /sek for alle trinn. Platene ble avlest på en Bio-Rad QX-100 dråpe leseren bruker QuantaSoft v1.4.0.99 programvare fra Bio-Rad. I det minste en negativ kontrollbrønn uten DNA ble inkludert i hvert løp. Hver brønn ble deretter leses ved hjelp av QX100 Droplet Reader (Bio-Rad) og dråper analysert for utslipp i HEX eller FAM bølgelengder. To-dimensjonale amplitude plott som viser målt HEX og FAM amplitude for hver dråpe vise fire hoveddråpe populasjoner; dråper som ikke inneholdt amplifisert DNA, dråper med bare mutant-DNA og høy FAM amplitude, dråper med bare villtype DNA og høy HEX amplitude og dråper med både villtype og mutant amplifisert DNA og høy FAM og HEX amplitude. Hvis flere kopier av villtype og mutant DNA finnes i samme dråpene, dråper med høyere FAM og HEX amplitude vil bli lest. Disse dråpene har blitt ekskludert fra alle analysene i denne studien.
Digital PCR-analyse
For å vurdere mutant allel brøkdel, konsentrasjonen av mutant DNA (kopier av mutant DNA per dråpe) ble beregnet fra Poissonfordelingen. Antall mutante kopier per dråpe MMU = lN (1- (NMU /n)), der NMU = antall dråper positive for mutant FAM sonde og n = totalt antall dråper. DNA-konsentrasjonen i reaksjonsblandingen ble beregnet som følger: MDNAconc = -lN (1- (nDNAcon /n)), hvor nDNAconc = antall dråper som var positive for mutant FAM sonde og /eller vill-type HEX sonde og n = totalt antall dråper. Mutant allelet brøkdel = MMU /MDNAconc. Den målte mutant allel frekvens beskriver mutant allel brøkdel uttrykt i prosent.
FFPE vev DNA-tilgang og utvinning
formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) tumorprøver fra NSCLC pasienter overskudd til klinisk arbeid var samlet med skriftlig pasienten samtykke på The Royal Marsden NHS Foundation Trust. FFPE vev DNA ble ekstrahert (etter macrodissection hvis det er nødvendig for å sikre 10% tumor innhold) ved hjelp av Qiagen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) i henhold til produsentens anvisninger. Det eluerte DNA ble lagret ved -20 ° C.
Etikk uttalelse
Alle pasienter gitt skriftlig samtykke til dette studie (etikk godkjenning 13 /LO /1389, NRES Committee London-Central), som innlemmet overskudd somatisk DNA fra Cancer Research UK Stratifisert Medicine Programme (etikk godkjenning 11 /EE /0202, NRES Committee East of England).
Sanger-sekvense
regionen av interesse ble forsterket ved hjelp av 10 um fremover (5′-TATTATAAGGCCTGCTGAAAATG-3 «) og revers (5′-TTGGATCATATTCGTCCACAA-3») grunning, 10 mL AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Life Technologies) og 3 ng templat FFPE-avledet DNA eller 5 ng gDNA. PCR-betingelsene var som i henhold til produsentens anbefalinger. Renset PCR produkt deretter gjennomgikk en ytterligere PCR skritt med kjede-terminer dideoksynukleotider (BigDye® 1.0, Life Technologies) ble og påfølgende DNA-sekvensen leses på en automatisert sequencer.
Ion torrent proton sekvense
Sequencing bibliotekene ble utarbeidet med Ion AmpliSeq ™ Cancer hotspot Panel v2 (Life Technologies) ved hjelp av Ion AmpliSeq Bibliotek Forberedelse protokoll med 3-5ng av DNA, i henhold til produsentens instruksjoner. Etter barcoding, ble biblioteker kvantifisert ved hjelp av qPCR og fortynnet til 100 pm. Bibliotekene ble malbasert med Ion OneTouch2 system (Life Technologies) og sekvensert på en PI chip med Ion PI OT2 200 Kit (Life Technologies), 520 strømmer og en gjennomsnittlig amplicon lengde på 112 baser til en gjennomsnittlig dybde på x2721307. Sekvenser resulterte i 45272-11767856 leser per prøve.
Ion torrent Variant innringer v4.0-r73742 uten hotspot-regionen og konfigurasjon «Germ Linje lav stringens» ble brukt for å kalle varianter. Les teller for alle stillingene er beregnet ut pile-up (SAMtools v1.1 [12]) og disse dataene ble analysert for mulige varianter ved hjelp av tilpassede Perl og R skript. Varianter på 3% rapportert av både analysemetoder og ikke rapportert i 1000 genomer Prosjektarkiv (www.1000genomes.org) ble identifisert som mulige somatiske mutasjoner. Dataene ble kryss refererte mot Cosmic databasen v70 (cancer.sanger.ac.uk) for å identifisere mulige hotspot mutasjoner.
Statistisk analyse
Lineær regresjon ble utført ved hjelp av formelen r
2 = 1- (SS
reg /SS
tot) hvor SS
reg refererer til summen av kvadratene av avstandene til beste tilpasning lineære regresjonslinjen og SS
tot refererer til summen av kvadratene av vertikale avstander fra nullhypotesen (y = gjennomsnittet av alle y-verdier) ved hjelp GraphPad Prism versjon 6.0a (GraphPad programvare, La Jolla, California, USA).
KRAS multiplex analyse spesifisitet
92 brønner på
KRAS
villtype gDNA ble analysert med hver multiplex. Deteksjonsgrensen ble satt til 0,05% for å reflektere våre målte resultater med piggete
KRAS
mutante gDNA arter (S8 Fig). Individuelle dråper ble gruppert etter deres HEX amplitude i to grupper som bruker kMeans algoritme. En terskel for mutanter ble beregnet basert på 1,5 ganger medianen av FAM verdiene av disse dråpene som tilhører klyngen med høyere HEX kategorier. Falske positive «mutant» dråper ble klassifisert som dråper som var i den nedre HEX klyngen, men hvis FAM verdien overstiger terskelen for å reflektere FAM og HEX amplitudene målt for noen av KRAS muterte arter testet for i det multiplex analyse. En falsk positivt resultat ble definert som tre falske positive «mutant «dråper som per Sjeldne mutasjonsdeteksjon Best Practices retningslinjer [13]. For å vurdere spesifisitet, vi beregnet binomiske sannsynligheten for å oppnå færre enn tre «mutant «dråper per 6000 vill type dråper for hver multiplex analyse.
Resultater
KRAS
mutasjon duplex ddPCR
Vi har testet alle
KRAS
ddPCR analyser for seg over en annealing temperaturgradient å optimalisere termo forhold. Hver analyse ble testet med det passende gDNA eller oligonukleotid alene og deretter i duplex med vill-type og
KRAS
-mutant-DNA og begge relevante FAM og HEX prober som er tilstede. Avtagende annealing temperaturen økt FAM amplitude av mutant sonde til et platå på 54 ° C for
KRAS
G12V, D, A, S, R og C og G13C og 13D prober (fig 1).
KRAS
Q61H sonde hadde en ytterligere minimal økning i FAM amplitude ved 53,4 ° C i forhold til 54 ° C. Alle prober ble testet viste god separasjon av de fire forskjellige dråpegrupper ved 54 ° C, noe som gir klar identifikasjon og kvantifisering av forskjellige DNA-populasjoner.
Droplet populasjoner observert for hver dupleks analysen testes med vill-type og mutante aktuelle cellelinjen gDNA eller oligonukleotid på det optimale annealing temperaturen f.eks G12V panel øverst til venstre viser dråpe populasjoner sett med WT for G12V analysen, G12V analysen, NCI-H727 gDNA og NCI-H1975 gDNA stede. HEX amplitude er opp til 6000 på x-aksen og FAM amplitude opp til 11 000 på y-aksen av hvert panel. Key. Svart drops- tomme dråper, blue-mutant DNA FAM positive dråper, klimavilltype DNA HEX positive dråper, brun-villtype og mutant DNA dobbel positive dråper
KRAS
multiplex ddPCR analysen design
Vi har konstruert en digital PCR-basert multiplex verktøy for å skjerme for den vanligste
KRAS
mutasjoner i lunge adenokarsinom; G12C, G12D og G12V (https://www.sanger.co.uk/cosmic). Vill-type-probe assays for hver mutasjon ble testet i kombinasjon med varierende konsentrasjoner av mutant-probe assays, som gir opphav til mutantdråpe populasjoner av varierende amplitude FAM (Fig 2). Den HEX amplitude av alle villtype probe analyser ble funnet å være svært like og så WT for G12C, WT for G12V og WT for G12D analysene ble valgt som referanser for alle etterfølgende
KRAS
G12 og G13 mutante analyser . Av de ulike kombinasjoner av mutant analyser forsøksordning, multipleks analysen som ga beste separasjon av dråpe populasjoner brukt 900 nM primere og 500 nM G12C sonde, 562.5 nM primere og 312,5 nM G12D sonde og 225 nm primere og 125 nM G12V probe (fig 2 , øverst til venstre panel).
KRAS
G12C mutant dråpe populasjoner er merket med en rød stiplet firkant,
KRAS
G12D mutant populasjoner av en blå stiplet firkant og
KRAS
G12V mutant populasjoner av en gul stiplet firkant. Hver multiplex analyse, som kombinerer alle relevante FAM og HEX analyser,
KRAS
WT gDNA og G12V, D og C mutant gDNA, er vist i toppanelet. Den tilsvarende duplex analysen for hver mutasjon, med samme FAM og HEX analysen konsentrasjon med
KRAS
WT DNA og riktig
KRAS
mutant DNA til stede, er vist i panelene under hver multiplex analyse. Multiplex 1 (øverst til venstre panel) er en analyse kombinasjon av 900 nM primere og 500 nM G12C sonde, 562.5 nM primere og 312,5 nM G12D sonde og 225 nm primere og 125 nM G12V probe med 450 nm primere og 250 nM WT for G12C sonde. Multiplex 2 bruker samme konsentrasjon av G12V og WT for G12C analysen som Multiplex 1, men inneholder også 450 nm primere og 250 nM G12C sonde og 675 nM primere og 375 nM G12D sonde. Multiplex 3 anvender den samme konsentrasjonen av
KRAS
mutant-assays som i multipleks 2, men med WT for G12V sonde assay tilstede, anvendt i samme konsentrasjon som den WT for G12C assay i multipleks 1. multipleks 4 er et assay kombinasjonen av den G12C analysen som i multipleks 2 med 225 nM primere og 125 nM G12D sonde og 675 nM primere og 375 nM G12V sonde med WT for G12D analyse ved den samme konsentrasjon som den WT for G12C assay i multipleks 1. nøkkel: svart – tomme dråper, blås mutant DNA FAM positive dråper, klimavilltype DNA HEX positive dråper, brun-villtype og mutant DNA dobbel positive dråper. Samme skala brukes for alle paneler (HEX amplitude opp til 7000 og FAM amplitude opp til 22000).
Evnen til å teste for flere
KRAS
mutasjoner ville bidra til å oppdage under -clonal populasjoner ved å bruke multipleks tilnærming til kliniske prøver som utgangsmaterialet er mangelvare. For å modellere dette, vi ansatt cellelinje avledet gDNA for de tre mutasjoner og testet den med hver sonde i duplex å sikre spesifisitet (S1 fig). I nærvær av den G12D mutant sonden og
KRAS
G12D, V og C-mutant-DNA, et andre mutert populasjon av små dråper ble identifisert ved lavere FAM amplitude til den G12D mutante DNA-populasjonen (rød stiplede boksen, venstre øvre panel ). Denne populasjonen ble ikke observert når hver mutant DNA-arter ble testet i dupleks med G12D probe (venstre andre panel). En tilsvarende andre mutant populasjon ble observert med G12V mutant sonden og alle de tre mutante DNA-arter sammenlignet med hver mutant DNA i dupleks (venstre nedre paneler). Denne andre befolkningen, spesielt sett med G12D mutant sonde, kan falle i den forventede FAM amplitude av en annen
KRAS
mutasjon i multiplex analysen og føre til falske positive mutasjonsdeteksjon. For ytterligere å utforske denne, FFPE vev DNA fra et individ kjent for å ha en
KRAS
12/13 mutasjon (F124), som bekreftet ved COBAS® testing (COBAS®
KRAS
Mutation Test, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) ble analysert (S1 figur, høyre panel). Multipleks analysen identifisert en mutant dråpe befolkning med FAM amplitude som ble tolket som en G12D eller G12V mutasjon. Når prøven ble testet med hver dupleks analyse individuelt, ble det ikke mutert populasjon i enten G12V eller G12C observert, mens en populasjon med en lavere FAM amplitude enn forventet med G12D mutant Analysen ble observert. På påfølgende sekvensering og videreutvikling av den digitale PCR-analyse av vevet DNA, ble denne prøven senere identifisert som
KRAS
G12A mutant (tabell 3).
Kryssreaksjoner av
KRAS
probe analyser på kombinasjonen
på grunn av den nære likheter mellom DNA-sekvenser av ulike
KRAS
mutasjoner, betydelig kryssreaktivitet ble notert mellom prober utformet for mutasjoner innenfor samme region. Dette var spesielt tydelig med prober utformet for erstatninger på samme nukleotid dvs.
KRAS
G12V, D og A og
KRAS
G12S, R og C. kryssreaktivitet av sonden analysen med « umake «DNA som bærer en annen
KRAS
mutasjon (S2 og S3 figurene) resulterer i en dråpe populasjon av varierende FAM og VIC amplituder relativt nær tom dråpe befolkning og en annen befolkning nær den ekte villtype dråpe befolkningen . Plasseringen av disse ekstra dråpe populasjoner dikterer utformingen av multiplex analyser for å redusere potensiell feiltolkning av
KRAS
genotyper. Derfor ble tre multipleks-analyser utviklet av hver kombinere en probe for en mutasjon ved nukleotid posisjon 35, en sonde for en mutasjon i posisjon 34 og en probe for en mutasjon i en av posisjonene 37, 38 eller 183.
KRAS
multiplex ddPCR analysen optimalisering
multiplex A er en kombinasjon av FAM analyser for
KRAS
G13C, G12C og G12V. Flere forskjellige kombinasjoner av mutant-probe-konsentrasjoner ble testet, og bruken av en villtype-probe for G12C og G13C ved varierende konsentrasjoner (S4 Fig). Det var betydelig overlapping mellom HEX amplituden av dråpe populasjoner vill-type, og på grunn av nærheten av de aktuelle nukleotidbasene og den beregnede lengde av sonden, ble det følt at 450 nM primere og 250 nM G12C, V eller D vill typen probe var tilstrekkelig for kvantifisering av både G12 og G13 villtype-populasjoner. Den optimale multiplex analysen (S4 figur, øverst til venstre panel) består 900 nM primere og 500 nM G13C mutant sonde, 450 nM primere og 250 nM G12C sonde og 225 nm primere og 125 nM G12V sonde. Multiplex B er en kombinasjon av FAM analyser for
KRAS
G12S, G12D og G13D. Av alle de konsentrasjonene som ble testet, den optimale kombinasjonen av mutante probe analyser var 675 nM primere og 375 nM G12S sonde, 450 nM primere og 250 nM G12D sonde og 225 nm primere og 125 nM G13D probe (S5 figur, venstre panel). Multiplex C analyserer
KRAS
mutasjoner ved G12R, G12A og Q61H. Det krever en villtype-probe for både G12 /13 posisjon og Q61 posisjon for nøyaktig kvantifisering av mutant allel frekvens. Analysen ble optimalisert med 450 nM primere og 250 nM G12C sonde og 900 nM primere og 500 nM Q61H sonde som villtype-analyser. Den beste separasjon av mutant dråpe populasjoner ble oppnådd ved bruk av 675 nM primere og 375 nM G12R sonde, 450 nM primere og 250 nM G12A sonde og 900 nM primere og 500 nM Q61H mutant probe (S6 figur, venstre panel).
Alle optimalisert multiplex analyser (fig 3) ble testet for kryssreaksjon med ulike arter av
KRAS
mutant DNA (S7 fig). Det er ingen overlapping mellom de ønskede dråpe populasjoner og bestander for andre
KRAS
muterte DNA-arter i alle tre signalpakker. I tillegg er posisjonen til dråpe populasjoner på grunn av kryss-reaktivitet er meget reproduserbar og kan brukes til å starte for å identifisere hvilke
KRAS
genotype er til stede i en multipleks-analyse inneholder andre mutante prober.
multiplex A (øverst til venstre panel) er en analyse kombinasjon av 900 nM primere og 500 nM G13C probe (rød stiplet firkant), 450 nm primere og 250 nM G12C probe (blå stiplet firkant) og 225 nm primere og 125 nM G12V probe (gul stiplet firkant). Multiplex B (øverste midtre panelet) er en analyse kombinasjon av 675 nM primere og 375 nM G12S probe (rød stiplet firkant), 450 nm primere og 250 nM G12D probe (blå stiplet firkant) og 225 nm primere og 125 nM G13D probe (gul stiplet firkant). Multiplex C (panel øverst til høyre) er en analyse kombinasjon av 675 nM primere og 375 nM G12R probe (rød stiplet firkant), 450 nm primere og 250 nM G12A probe (blå stiplet firkant) og 900 nM primere og 500 nM Q61H probe (gul stiplet firkant). Multiplex C har 900 nM primere og 500 nM Q61H villtype-probe i tillegg til en G12C vill-type assay. Alle andre villtype dråpe populasjoner er vist, med unntak av Q61H dupleks-analysen, er 450 nm primere og 250 nM G12C vill-type sonde. Alle paneler i venstre og midtre kolonner viser en FAM amplitude opp til 18 000 og en HEX amplitude opp til 6000. paneler i høyre kolonne har en FAM amplitude opp til 18 000 og en HEX amplitude opp til 11000.
KRAS
multiplex ddPCR analysen karakterisering
Felle mengder av NCI-H358 (
KRAS
G12C) og A549 (
KRAS
G12S) gDNA ble tilsatt i
KRAS
villtype gDNA (NCI-H1975) og testet i den aktuelle
KRAS
multiplex analyse. Deteksjonsgrensen for
KRAS
G12C mutant-DNA i multiplex A var 0,03% og for
KRAS
G12S DNA i multiplex B var 0,045% (S8 figur, topplater) Den målte mutant allel frekvens korrelert godt med avtagende mengder av piggete
KRAS
mutant gDNA i signal A og B (r2 = 0,9992 og 0,0998 henholdsvis), som viser linearitet av mutasjonsdeteksjon i multiplex analyser. Mutant allel frekvens viste liten intra godt variasjonen for enten multiplex analyse og høy reproduserbarhet mellom to ulike operatører på tre alternative dager for en rekke allelfrekvenser (S8 figur, midtre og nedre paneler).
I likhet
KRAS
allelfrekvens ble observert ved hjelp av multiplex eller duplex analyser i begge cellelinje DNA (enkelt art
KRAS
mutant gDNA og kombinasjoner av
KRAS
mutant gDNA med varierende allelfrekvenser) eller oligonukleotider og FFPE vev DNA (figur 4; r2 henhold = 0,9302 og 0,9542)
Vi har analysert flere brønner av NCI-H1975
KRAS
villtype gDNA med hver av de tre
KRAS
multiplex analyser og beregnet sannsynligheten for falske positive mutasjonsdeteksjon, sette deteksjonsgrensen på 0,05% for å reflektere våre målte resultater med piggete
KRAS
mutante gDNA arter (S8 Fig). Spesifisitet av hver multiplex er 99,99995%, 99,99857% og 99,85578% for signal A, henholdsvis B og C (S1 tabell).
Sammenligning av
KRAS
multiplex analyse mutant deteksjon med Sanger-sekvensering
En rekke prøver som inneholder avtagende mengder av NCI-H358 (
KRAS
G12C) eller A549 (
KRAS
G12S) gDNA tilsatt i
KRAS
vill skriv DNA (NCI-H1975) var samtidig analysert ved hjelp av digital PCR og Sanger-sekvensering.
KRAS
G12C-mutant-DNA var påvisbar ved hjelp av multipleks-A ned til et mutant allel frekvens på 0,2%, mens mutant topp på kromatogrammet er kun synlig ved et mutant allel frekvens på 31,5%, og ikke under 10% (S9 fig, topp paneler).
KRAS
G12S mutant DNA forblir påvisbar ved digital PCR ved anvendelse av multiplex B til en mutant allel frekvens på 0,1%, men er kun synlig ved hjelp av Sanger-sekvensering ved 17%. (S9 figur, lavere paneler).
Påvisning av
KRAS
mutasjoner i FFPE vev DNA
FFPE vev DNA ekstrahert fra 11 tilfeller av avansert
KRAS
mutant NSCLC (S2 tabell) ble analysert ved anvendelse av hver multiplex analyse. Tilstedeværelsen av en
KRAS
12/13 mutasjonen var kjent fra før COBAS® testing (COBAS®
KRAS
Mutation Test, Roche), men etterforskerne ble blindet for den spesifikke
KRAS
genotype. Minst en
KRAS
mutasjonen ble oppdaget i hvert enkelt tilfelle og to tilfeller hadde to påviselig
KRAS
kloner (figur 5). Mutasjoner ble bekreftet med riktig duplex analysen. Den lave frekvensen G12D mutasjon i tilfelle S011 kan representere FFPE gjenstand på grunn av hyppige deaminering av guanin nukleotider under vev bevaring prosessen [14]. Den G12F mutasjon i S018 ble identifisert ved påfølgende sekvensering av vevsprøve etter observasjon av kryss-reaktivitet dråpe populasjonen i alle multipleks-analyser. I tillegg ble to arter av KRAS mutant gDNA tilsatt i en bakgrunn av
KRAS
villtype DNA (NCI-H1975) gDNA for å skape tre prøver inneholdende en større og mindre KRAS klon; C1 er en kombinasjon av NCI-H358 (
KRAS
G12C) og A549 (
KRAS
G12S) gDNA, er C2 en kombinasjon av NCI-H358 (
KRAS
G12C) og A427 (
KRAS
G12D) gDNA og C3 er en kombinasjon av A427 (
KRAS
G12D) og A549 (
KRAS
G12S) gDNA.
