Abstract
I de senere årene, lang kodende RNA (lncRNAs) har vist seg å spille nøkkel roller i tumorgenesis. Men bidragene fra lncRNAs til livmorhalskreft (CC) er fortsatt i stor grad ukjent. I denne studien forskjellig uttrykt lncRNAs og mRNA i livmorhalskreft og sammenkoblede peritumoral vev ble oppdaget av transkriptomet microarray analyse. Vi fant 708 probe sett av lncRNAs økt og 836 probe sett redusert i CC vev, mens 1288 mRNA differensial probe sett økt og 901 mRNA probe sett redusert. Resultatene ble bekreftet ved kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (qPCR). Deretter fant vi et spesifikt uttrykt forskjellig lncRNA kan fysisk binde seg til enhancer av Zeste homolog2 (EZH2) ved hjelp av RNA immunoprecipitation. Vi betegnet det som EZH2 bindende lncRNA i livmorhalskreft [lncRNA-EBIC]. Sårtilheling analyser og Matrigel invasjonen analysene ble brukt til å bestemme funksjonen av dette lncRNA ved å kneble den. Vi observerte at migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller
in vitro
ble hemmet på undertrykkelse av lncRNA-EBIC av siRNA. Vi fant også at sammenhengen mellom lncRNA-EBIC og EZH2 var nødvendig for undertrykkelse av E-cadherin, som var en viktig molekylær i metastasering av livmorhalskreft.
Konklusjon
Resultatene viste at lncRNA-EBIC var et onkogen lncRNA, noe som kan fremme tumorcelle invasjon i CC ved å binde seg til EZH2 og hemme E-cadherin uttrykk
Citation. Sun Nx, Ye C, Zhao Q, Zhang Q, Xu C Wang Sb, et al. (2014) Long kodende RNA-EBIC Fremmer Tumor Cell Invasion ved binding til EZH2 og undertrykke E-cadherin i livmorhalskreft. PLoS ONE 9 (7): e100340. doi: 10,1371 /journal.pone.0100340
Redaktør: Vinod Scaria, csir Institutt for Genomics og Integrative Biology, India
mottatt: 30 januar 2014; Godkjent: 26 mai 2014; Publisert: 09.07.2014
Copyright: © 2014 Sun et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Science Foundation Nature of China (nr 81272213), https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm, og Foundation Natural Science of Shanghai (13ZR1414300), http: //www. stcsm.gov.cn. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CC) er den nest vanligste diagnosen kreft og den tredje største årsaken til kreftdød blant kvinner [1]. Omtrent 49 000 nye tilfeller av CC ble diagnostisert og 275.000 kvinner ble drept i 2011, som de fleste skjedde i utviklingsland [2], [3]. I tillegg til patogenesen av vedvarende høy risiko humant papillomavirus (HPV) infeksjoner, bidrag fra andre faktorer til utvikling og progresjon av denne malignitet må belyses.
Flere nylig, nye bevis har vist at epigenetiske mekanismer kan være nøkkelen til å initiere tumorigenesis. Forstyrrelse av epigenetisk kontroll av DNA-metylering, RNA regulering, og histon modifikasjon, etc, som resulterer i arvelig variant av gener uten en endring i deres kodende sekvens, er gjennomgående i malignitet [4], [5]. Selv om studier av små ikke-kodende RNA har dominert innen RNA-regulering i de senere år [6], [7], et bredt spekter av cellefunksjoner har også vært forbundet med noen nylig beskrevne klasser av ikke-kodende RNA. En slik klasse, lange ikke-kodende RNA (lncRNAs), er avskrift av mer enn 200 nukleotider uten proteinkodende potensiale. En rekke rapporter har vist at dens misregulation har en funksjonell rolle i en rekke typer av kreft [8]. For eksempel, spiller lncRNA-HEIH en sentral rolle i cellesyklusen regulering av leverkreft celler, og høy lncRNA-HEIH uttrykk korrelerer med økt risiko for tilbakefall og redusert totalpostoperativ overlevelse [9]. Som lncRNAs er fremstår som kritiske komponenter av kreft transkriptomet, er det rimelig å forvente at lncRNAs bidra til utvikling og progresjon av livmorhalskreft. Men studier på rollen lncRNAs i CC er svært foreløpige. Inntil nå bare en forskning har påvist økt nivå av avvikende lncRNA uttrykk i livmorhalsen (CIN) prøver representerer milde, moderate og alvorlige histopatologiske karakterer, henholdsvis, noe som tyder på at lncRNAs kan spille en viktig rolle i utvikling og progresjon av forstadier til kreft eller karsinom [10]. Men den generelle patofysiologiske bidrag fra lncRNAs i CC er fortsatt i stor grad ukjent.
En fersk studie har rapportert at en femtedel av alle menneskelige lncRNAs identifisert hittil er fysisk tilknyttet polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2, som består av histon H3 lysin 27 metylase EZH2, SUZ12 og EED), noe som tyder på at de kan ha en generell rolle i rekruttering polycomb-gruppe proteiner til sine mål gener og fører til transcriptional undertrykkelse [11]. EZH2 (Enhancer av Zeste homolog 2) er en kritisk komponent i PRC2, som er involvert i flere viktige reguleringsmekanismer som stamcelledifferensiering, celleproliferasjon, cellesyklus, og onkogenese [12], [13]. Det er økende bevis på at EZH2 er ofte over-uttrykt i mange typer kreft hos mennesker og kan fremme cellevekst, invasjon, og tumor angiogenese [14] – [16]. Dessuten flere lncRNAs, slik som lncRNA-HEIH, H19 og varmluft, har vist seg å binde seg til fysisk EZH2 og spille en viktig rolle i modulering av kreft epigenome [9], [17], [18]. Basert på disse funnene, hypotese vi at noen lncRNAs kan også spille en aktiv rolle i de ondartede biologiske atferd av CC ved å formidle og samarbeide med EZH2.
Så det vil være interessant å finne ut de biologiske funksjonene lncRNAs i CC og om de fungerer for å rekruttere PCG proteiner å målrette gener. I denne studien gjennom transkriptomet microarray analyse, fant vi en rekke lncRNAs opp- eller nedregulert i CC sammenlignet med sammenkoblede peritumoral vev. Vi videre identifisert en ny lncRNA som var oppregulert i CC og kunne fysisk binde seg til EZH2 og delta i regulering av migrasjon og invasjon av CC cellelinjer.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studiet ble godkjent av Spesialutvalget Etikk for biomedisin Forskning av Second Military Medical University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienter for bruken av sine vevsprøver i dette forskningsprosjektet.
Pasient egenskaper og prøver vev
Twenty-åtte par snap-frosne CC og sammenkoblede peritumoral vev var innhentet fra Shanghai Changzheng Hospital med informert samtykke og godkjenning av institusjonelle etiske komité. Kliniske vevsprøver ble verifisert som tumor eller ikke-tumor ved histopatologisk undersøkelse og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Pasientenes egenskaper er beskrevet i tabell S1.
Microarray og beregningsorientert analyse
I korthet ble fem CC vev og fem sammenkoblede peritumoral vev (Tabell S1) som brukes til å syntetisere dobbeltrådet komplementær DNA ( cDNA) ved revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon. Dobbelt cDNA ble hybridisert til Glue Grant Menneskelig transkriptomet arrays (Affymetrix, USA) i henhold til produsentens protokoll, og Affymetrix® Expression Console-programvaren (versjon 1.3.1) ble brukt for microarray analyse. Rådata (CEL filer) ble normalisert ved karakternivået ved hjelp av robust multi-gjennomsnittet metode (RMA arbeidsflyt). Median samandrag av transkripsjon uttrykk ble beregnet. Gene-nivå data representert gener som finnes i Rfamdb, fRNAdb, Ensembl, Noncodedb, og RefSeq databaser. Ved bruk av samme metode, ekson-nivå data representert i full-lengde-transkripter. Den tilfeldige variansen modellen (RVM) t-test ble brukt til å identifisere differensielt uttrykte gener mellom CC og peritumoral grupper, uten å øke frekvensen av falske positiver [19]. Vi valgte forskjellig uttrykt gener ifølge RVM og falske funnrate (FDR) analyser, med en forhåndsdefinert P-verdi terskel 0,05 [20]. Hierarkisk clustering (Cluster3.0) og Utforsker analyse (Stanford University, USA) ble utført basert på resultatene av forskjellig uttrykt gener. Microarray data omtalt i denne artikkelen har blitt sendt til Nasjonalt senter for Bioteknologi Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO), og er tilgjengelig gjennom (GEO) Series tiltredelse antall GSE55940 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/query/acc.cgi?acc=GSE55940).
data~~POS=TRUNC filtrering og etablering av et gen co-uttrykk nettverk
en spørring design av Microsoft Office Access 2013 ble brukt til å overlappe forskjellig uttrykte gener med livmorhalskreft Gene Database (CCDB) av genet symbol. Co-uttrykk nettverksanalyse ble utført mellom genene Skille og differensial lncRNAs å identifisere genet interaksjoner [21]. Co-ekspresjon nettverk ble bygget i henhold til den normaliserte signalintensiteten av spesifikke uttrykte gener. For det første, konstruerte vi nettverket naboskapsmatrisen som tidligere beskrevet [22]. For det andre, beregnet vi Pearson korrelasjon for hvert par av gener og valgte fremtredende korrelasjons par for å konstruere nettverket. For å gjøre en visuell representasjon, ble bare de gener med den sterkeste interaksjon (0,865 eller høyere) valgt. I nettverket analyse, er en grad den viktigste parameteren for sentralitet av et gen i et nettverk som bestemmer den relative viktighet. Degree sentralitet er definert som antall lenker en node har til en annen. For å utforske graders forskjell fra visse hub gener og naboer mellom kreft og peritumoral grupper | diffK | ble introdusert til analyse. The | diffK | er lik forskjellen i de standardiserte grader av hub gener i 2 grupper og foreslår at navet genet kan ha en sterkere evne til regulering i kreft eller peritumoral regionen.
Cell kultur
Menneske livmorhalskreft cellelinjer (HeLa, Siha, CaSki) ble kjøpt fra Shanghai Institute of Life Sciences Cell Resource Center, Shanghai, Kina. Alle cellelinjer ble dyrket i DMEM-medium (Gibco, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin (BioWest, Frankrike). Normale cervical vev ble oppnådd fra premenopausale kvinner som gjennomgikk hysterektomi på grunn av myom eller adenomyoma ved Institutt for obstetrikk og gynekologi ved Shanghai Changzheng Hospital. Primære cervikale epitel-celler ble spaltet fra vevene ved DispaseII (Roche, Sveits) og Trypsin-EDTA-løsning (BioWest, Frankrike) og ble opprettholdt i keratinocytt-SFM (Gibco, USA). Alle cellekulturer ble opprett ved 37 ° C i en 5% CO
2, fuktet inkubator.
Kvantitativ real-time PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert fra frosne vevsprøver og celle linjer ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, USA) og revers-transkribert ved hjelp av tilfeldige primere og en M-MLV revers transkriptase Kit (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Ekspresjonen av filtrerte lncRNAs og tilhørende kodende genene ble målt ved hjelp av TaqMan probe kvantitativ real-time PCR (qPCR) ved anvendelse av Premiks Ex Taq (TakaraBio, Japan) på en Applied Biosystems StepOne Real Time PCR-system (Applied Biosystems, USA) i henhold til produsentens instruksjoner . H18S ble anvendt som en intern standard, og hver prøve ble analysert i triplikat. Relativ genekspresjon (endring) ble beregnet ved hjelp av to
– △△ Ct metode. Sondene og tilsvarende primere i denne studien ble utformet og syntetisert av GenePharma (Shanghai, Kina). Sekvensene til primere og prober i qPCR er oppført i Tabell S2. Primerne av U6 ble utformet og syntetisert av RiboBio (Guangzhou, Kina) .De sekvenser av primere er ikke gitt av selskapet.
RNA immunoprecipitation
Nuclear og Cytoplasmatiske Protein Extraction Kit (Beyotime, Kina) i kombinasjon med RNA-Binding Protein Immunoutfelling Kit (Millipore, USA) ble anvendt ved utførelse av RIP eksperiment i henhold til produsentens instruksjoner. Den EZH2 antistoff som brukes for RIP er D2C9 (Cell Signaling Technology, USA). Co-utfelt RNA ble oppdaget av revers-transkripsjon PCR (RT-PCR), agarosegel-elektroforese (AGE) og qPCR. Total RNA (inngangsstyre) og kontroller ble også analysert for å demonstrere at de detekterte signalene var fra RNA spesifikt å binde seg til EZH2. De genspesifikke primerne anvendt i RIP forsøk er presentert i Tabell S2.
siRNA transfeksjon
HeLa og Siha celler ble sådd ut på en 6-brønners plate i antibiotika-fritt vekstmedium supplert med 10 % FBS og dyrket inntil 50-70% sammenflytende. Sirnas ble blandet med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) i redusert serum medium (Opti-MEM, Gibco, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Transfeksjon ble utført i 48 timer, fulgt av høsting av behandlede celler for videre studier. sirnas ble utformet og syntetisert av GenePharma (Shanghai, Kina). SiRNA sekvenser av lncRNA-EBIC, EZH2 og negativ kontroll brukt i denne studien er oppført i Tabell S2.
Sårtilheling analysen
For å utføre sårtilheling analysen, celler ble sådd på 6- vel plater og transfektert for 48 timer med enten lncRNA-EBIC siRNA eller negativ kontroll siRNA, etterfulgt av etableringen av en kunstig, homogen scratch sår på en konfluent monolag kultur for HeLa og CaSki celler med en 200-mL pipette tips. Serum-fritt medium ble tilsatt i ytterligere 24 timers inkubering, og cellene ble fotografert ved 3 forskjellige tidspunkter (0, 12, og 36 h) ved bruk av et invertert mikroskop. Prosent for sårheling ble beregnet med bilde J 1,47 programvare. Hvert forsøk ble utført in triplo.
Matrigel invasjon assay
Matrigel invasjons analyser ble utført in triplo ved bruk av Transwell
® gjennomtrengelige bærere (Corning, USA) i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. I korthet ble cellene transfektert med enten lncRNA-EBIC siRNA eller negativ kontroll siRNA i 48 timer som beskrevet ovenfor, etterfulgt av plettering på en Matrigel-belagt membran i det øvre kammer i en 24-brønns satt inn (8 um porestørrelse) inneholdende serumfritt media. Den nederste kammer inneholdt DMEM media med 10% FBS. Celler ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 i 48 timer etter plating, hvoretter bunnen av kammeret innskudd ble fiksert med metanol og farget med krystallfiolett. Celler som forble i det øvre kammeret ble fjernet med en bomullspinne. Antallet celler som invaderte gjennom membranen ble bestemt fra digitale bilder tatt på et invertert mikroskop og kalkulert med bilde J 1,47 software.
Western blot-analyse
Cellene ble høstet i RIPA lysebuffer ( Beyotime, Kina). Like mengder protein ble separert ved SDS-PAGE og overført på polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, USA). Membranene ble blokkert i fosfat-bufret saltvann /Tween-20 inneholdende 5% ikke-fettholdig melk og inkubert med antistoff i EZH2 (Cell Signaling Technology, USA) eller β-aktin (Santa Cruz Bioteknologi). Deretter ble membranene inkubert med HRP-merket IgG (KPL, USA) og påvises ved hjelp av Epson Perfection V300 Photo Scanner (Epson, Japan). Kvantitativ analyse ble utført ved hjelp AlphaEase FC programvare (Alpha Innotech, USA). Protein nivåer ble normalisert til p-aktin.
Statistisk analyse
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS versjon 18,0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL) og GraphPad Prism 5.0 software. Numeriske data ble presentert som gjennomsnitt og standardfeil. Forskjeller mellom proporsjoner ble evaluert av paret eller uparet t-test. P-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
lncRNA og mRNA uttrykk profiler i CC
Fem CC og sammenkoblede peritumoral vev ble analysert for potensielle transkriptom endringer i CC. ved hjelp av en Affymetrix Glue Grant menneskelig transkriptom array. Hierarkisk clustering viste systematiske variasjoner i uttrykket av lncRNAs og mRNA mellom CC og sammenkoblede peritumoral vev. Sammenlignet med sammenkoblede peritumoral vev, 708 probe sett av lncRNAs økt og 836 probe sett redusert i CC vev (Figur 1a), mens 1288 mRNA differensial probe sett økt og 901 mRNA probe sett redusert (figur 1B).
Bruk varmekart hierarkisk clustering analyse, identifiserte vi 1544 lncRNAs (A) og 2189 mRNA (B) som ble forskjellig uttrykt i CC vev, men ikke i de sammenkoblede peritumoral vev (c, kreft vev, P peritumoral vev; P 0,05). Oppregulering eller nedregulering er representert som rødt eller grønt, henholdsvis.
Gene co-uttrykk nettverk og kandidat lncRNAs
En RVM t-test ble brukt for å identifisere antall av forskjellig uttrykt lncRNAs og mRNA fra microarray analyse av CC og sammenkoblede peritumoral vev. For å filtrere dataene, må vi først overlappet differensial uttrykk mRNA med livmorhalskreft Gene Database (CCDB.) Vi er fast bestemt 12 nedregulert og 48 oppregulert mRNA (tabell S3), inkludert APOD, ESR1, MMP1, PCNA, og EZH2, ble utført etc. Co-uttrykk nettverksanalyse mellom 60 filtrerte mRNA og 1545 forskjellig uttrykt lncRNAs. Nettverket strukturen i CC (figur 2A) og peritumoral (figur 2B) vevsprøver var markert annerledes, implyapp: addword: antyde at co-uttrykk mønstre av mRNA og lncRNAs mellom CC og sammenkoblede peritumoral vev er forskjellige. Nylige studier har vist at oncoproteinene E7 av høy-risiko HPV16 kunne aktiv ekspresjon av EZH2 på transkripsjonsnivået som bidro til spredning og apoptotiske motstand av CC-celler [23]. Videre EZH2 er over-uttrykt i CC vev og sin høye uttrykk korrelerer signifikant med aggressivitet [24]. Mer nylig, har studier antydet at deregulerte lncRNAs kan ha en generell rolle i å indusere genom-wide re-målretting av PRC2 som vil resultere i avvikende ekspresjon av gener, til syvende og sist føre til kreft eller andre sykdommer [11], [18]. Derfor valgte vi EZH2, en kjerne subenhet av PRC2, for påvisning av potensielle lncRNAs involvert i CC fordi det presentert som en hub node med høy grad sentralitet. Elleve mRNA og ni lncRNAs (TI17313, TI13831, TI10124, TI18382, TI21327, TI18318, TI22687, TI09485, og ASK00420, (tabell S4) som tett interaksjon med EZH2 (interaksjon ≥0.865) ble valgt fra EZH2 subnettet i co-uttrykk nettverk av peritumoral gruppen.
A visning av lncRNA-mRNA nettverk for den 60 filtrerte mRNAer og 1545 differensielt uttrykte lncRNAs i CC (A) og parede peritumoral vev (B) er vist. oppregulert RNA er vist i rødt, og nedregulert RNA er presentert i blått. noder med en grønn ring representerer lncRNAs. noder uten en grønn ring representerer mRNA. Node størrelse representerer graden sentralitet.
Validering av kandidaten lncRNAs i CC vev og cellelinjer
For å validere microarray data, må vi først analysert TI17313, TI13831, TI10124, TI18382, TI21327, TI18318, TI22687, TI09485, og ASK00420 uttrykk i 23 paret CC og peritumoral prøver ved hjelp QRT -PCR. resultatene viste at ekspresjonen av disse lncRNAs ble enten økt eller redusert i CC vev sammenlignet med parede peritumoral vev (figur 3A) og var i overensstemmelse med microarray resultater. LncRNA ekspresjon ble deretter analysert i CC-celler og normale, primære cervikale epitel-celler i den samme måte. Nivåene av TI17313, TI13831, TI10124, og TI18318 ble økt i 3 kreftcellelinjer (HeLa, Siha, og CaSki) sammenlignet med normale, primære livmorhals epitelceller (Figur 3B). Uttrykk for de 5 andre lncRNAs var under deteksjonsgrensen i dyrkede celler (data ikke vist). Hensyntatt uttrykk og forskjellen på kandidat lncRNAs i vev og celler, valgte vi TI17313, TI13831, TI10124, og TI18318 for videre studier.
Ni kandidat lncRNAs ble validert i 23 paret CC og peritumoral vevsprøver ved hjelp QRT -PCR (A). Expression nivåer av TI17313, TI13831, TI10124, og TI18318 i CC cellelinjer i forhold til nivåene i normale, primærlivmorhals epitelceller (B) vises. * P 0,05, ** P. 0,01
lncRNA-TI17313 var assosiert med EZH2
For å undersøke om det er en fysisk interaksjon mellom de fire kandidat lncRNAs og EZH2, RIP ble utført ved hjelp av en EZH2 antistoff og atom ekstrakter av HeLa og Siha celler. Vi har observert at bare TI17313 beriket kraftig med EZH2 antistoffet sammenlignet med IgG (kontroll-antistoff) (figur 4A, 4B), og det var ingen anrikning ofβ-aktin og TI13831 (kontroll RNA) (figur 4C). Videre, for å bestemme den intracellulære lokalisering av TI17313, separert vi cytoplasmisk og nukleær RNA fra HeLa-celler ved Cytoplasmatisk derfor betegnet vi TI17313 som EZH2-bindende lncRNA i livmorhalskreft (lncRNA-EBIC).
(A, B) RIP eksperimenter ble utført i Siha og HeLa-celler ved hjelp av EZH2 antistoff (Ab) for å immunoutfelle og spesifikk primere for å oppdage TI17313, TI13831, TI10124, og TI18318 henholdsvis, og relative enrichments vises. * P 0,05. (C) RIP eksperimenter ble utført ved hjelp av EZH2 antistoff (Ab) til immunpresipitere en primer for å påvise β-aktin og TI13831.
lncRNA-EBIC lyddemping svekket CC celle migrasjon og invasjon in vitro
for å evaluere effekten av lncRNA-EBIC på cellulær oppførsel, ble CC cellelinjer behandlet med siRNA til taushet lncRNA-EBIC signalering. lncRNA-EBIC nivåene ble betydelig redusert i HeLa og Siha celler behandlet med siRNA (figur 5A). Celle-telling Kit-8-analyser og Annexin V-FITC strømningscytometri-analyse ble utført, og celleproliferasjon og apoptose ble ikke åpenbart påvirket av nedregulering av lncRNA-EBIC (data ikke vist). En sårheling migrasjon analysen bestemt at siRNA-mediert lncRNA-EBIC lyddemping svekket CC cellemigrasjon
in vitro plakater (figur 5B). En Matrigel invasjonen assay viste redusert invasjon gjennom matrigel i lncRNA-EBIC forstummet celler sammenlignet med kontroll (figur 5C). Disse data tyder på at lncRNA-EBIC positivt regulerer migrasjon og invasjon av CC celler.
LncRNA-EBIC nivåene var signifikant redusert i HeLa og Siha celler behandlet med lncRNA-EBIC siRNA (A). Sårheling (B) og matrigel invasjons assays (C) indikerte at motilitet og invasjon av HeLa og Siha celler ble svekket etter behandling med lncRNA-EBIC siRNA sammenlignet med mock og negativ kontroll. Cellular profiler er representativ for 3 uavhengige eksperimenter. Statistiske analyser er vist som høyre panel hhv. * P. 0,05
lncRNA-EBIC forbundet med EZH2 trykt uttrykk for E-cadherin
Forstyrrelse av celle-celle adhesjon og ned-regulert E-cadherin er den innledende fasen av tumorinvasjon. Økende bevis har vist at E-cadherin uttrykk er undertrykt i kreft og redusert uttrykk har vært knyttet til metastasering. Videre har studier vist at EZH2 kunne mekle transcriptional stanse av E-cadherin av trimethylation av H3 lysin 27 [18], [25]. Dermed har vi spekulert i at sammenhengen mellom lncRNA-EBIC og EZH2 kan senere føre til en reduksjon av E-cadherin uttrykk for å fremme CC celle invasjon. For å teste det, undersøkte vi endringer av E-cadherin mRNA og protein uttrykk nivåer i lncRNA-EBIC siRNA transfekterte HeLa og Siha celler. Vi fant ut at lncRNA-EBIC siRNA behandling kan øke uttrykket nivåer av E-cadherin i mRNA og protein, forlater EZH2 uttrykk uendret (figur 6A, 6B). Deretter ble EZH2 siRNA kombinert med lncRNA-EBIC eller NC siRNA brukes til å transfektere CC celler henholdsvis, og vi videre observert at E-cadherin uttrykk nivåer ble også økt i begge gruppene (figur 6C). Effektiviteten av EZH2 siRNA er presentert i figur S2. Disse data antydet at lncRNA-EBIC kunne hemme E-cadherin ved å assosiere med EZH2, og lncRNA-EBIC kan fungere som en tilrettelegger i å rekruttere EZH2 til arrangøren regionen E-cadherin. lncRNA-EBIC og EZH2 kan være to gjensidig avhengige komponenter i H3K27me3 prosessen.
I mellomtiden ble det utført western blot-analyse av EZH2 og E-cadherin i CC-celler behandlet med siRNA (A, B, høyre panel). Analyse av E-cadherin mRNA og proteinnivåene ble utført i CC celler behandlet med EZH2 siRNA + lncRNA-EBIC siRNA eller EZH2 siRNA + negativ kontroll. * P. 0,05
Diskusjoner
Genome-wide transkriptom studier viste at nesten 10 til 20 ganger mer genomisk sekvens er transkribert til lncRNA enn til protein-kodende RNA. Finne nye molekyler og mekanismer kan belyse kompleksiteten av ulike biologiske prosesser, herunder cellulær utvikling og sykdommer hos mennesker [26], [27].
Økende bevis i de siste årene viser at avvik lncRNA uttrykk fremstår som en hovedkomponent av kreft transcriptome. Imidlertid er den samlede patofysiologisk bidraget av lncRNAs til initiering og progresjon av CC fremdeles i stor grad ukjent. Nylig har et utslett studier avslører at lncRNAs er viktige cis- /trans-regulatorer av genaktivitet, hvilket innebærer de fleste lncRNAs kan innebære i reguleringen av genekspresjon [28]. Således er den ko-ekspresjon nettverk mellom lncRNAs og mRNAer en betydelig tilnærming for å studere de mulige funksjoner av lncRNAs. For å undersøke hvilken rolle lncRNAs i livmorhalskreft, vi først brukt en transkriptomet microarray for å evaluere lncRNA og mRNA uttrykk profiler i CC og paret peritumoral vev. Microarray kombinert med genet co-uttrykk analyse viste et sett med forskjellig uttrykt lncRNAs og mRNA.
EZH2, en kjernekomponent i PCR2, er en sentral enzym i histone modifikasjon som spiller en nøkkelrolle i kata H3K27me3, noe som resulterer i transcriptional stanse av målgener [29]. For eksempel har studier antydet at EZH2 kan hemme E-cadherin uttrykk gjennom denne metylering, og dermed øke kreft invasivitet og metastase [4], [14]. Men relativt lite er kjent om hvordan EZH2 rekrutteres til målet gener [30]. Nylig har noen studier indikerte at lncRNAs har evnen til å rekruttere PRC2 å målrette loci hos pattedyr via EZH2. For eksempel kan hotair indusere PRC2 å lokalisere med tilhørende arrangører, som fører til epigenetisk stanse av metastase suppressor gener ved brystkreft [18]. For et annet eksempel, kan lncRNA H19 hemme E-cadherin uttrykk ved transkripsjonen undertrykkelse av arrangøren gjennom berikelse av EZH2 [17].
Med hensyn til CC, noen tidligere studier viste også at over uttrykk for EZH2 er assosiert med aggressivitet og ondartet progresjon av CC [23], [24]. Som vår microarray viste uttrykket nivået av EZH2 ble oppregulert i tumorvev og presentert som en hub node med høy grad sentralitet. Derfor valgte vi EZH2 for påvisning av potensielle lncRNAs involvert i CC. Ifølge gen co-uttrykk analyse, bestemt vi ni søker lncRNAs som tett interaksjon med EZH2.
I disse kandidat lncRNAs, fant vi at lncRNA-TI17313 uttrykk nivåer var signifikant økt i CC vev og cellelinjer. TI17313 er en 1201bp i lengde kodende RNA transkribert fra en bearbeidet pseudogen ligger i kromosom 16q og kodet RP11-144N1.1 (Ensembl versjon ENSG00000262904). Som med de fleste lncRNAs viser TI17313 også lavere bevaring blant artene. Dens sekvens sparer bare blant primater (https://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Location/Compara_Alignments?align = 654 db = vega g = OTTHUMG00000177355 r = 16% 3A74701404-74702604 t = OTTHUMT00000436401). Videre undersøkte vi funksjonen, og mekanismene for denne kandidaten lncRNA. RIP viste en fysisk interaksjon av lncRNA-TI17313 med EZH2; derfor vi heter lncRNA-TI17313 som lncRNA-EBIC. Deretter tap-av-fuction analyser viste at redusert uttrykk for lncRNA-EBIC hemmet CC celle migrasjon og invasjon in vitro. Disse studiene antydet at lncRNA-EBIC kan fungere som et onkogen gjennom samarbeid med EZH2. I mellomtiden, foreningen av lncRNA-EBIC med EZH2 også gitt et hint til kompliserte Reguleringen av EZH2.
Tumor migrasjon og invasjon er de viktigste katalysatorene av sykelighet og dødelighet hos kreftpasienter. E-cadherin er et tumor suppressor gen som spiller en avgjørende rolle i ondartet progresjon av epiteltumorer og hemmer epitelial til mesenchymale overgang [31]. CC presenterer ofte med redusert ekspresjon av E-cadherin og er forbundet med HPV E6 og E7 oncoproteiner [32]. Over-ekspresjon av EZH2 har blitt rapportert å redusere nivået av E-cadherin genekspresjon gjennom H3K27me3 i E-cadherin-promoteren [4], [14]. I vår studie fant vi at nedregulering av lncRNA-EBIC kan øke uttrykket nivåer av E-cadherin. I mellomtiden, mink EZH2 uttrykk nivå, men forlater lncRNA-EBIC uendret også kunne fremme E-cadherin uttrykk.
Fordi det er ingen eksplisitt informasjon om transkripsjon start /terminalsteder og full-lengde sekvens av lncRNA-EBIC, vi er for tiden ikke er tilgjengelige for å utføre forsterkning-av-funksjon av lncRNA-EBIC og studere mulig mekanisme i mer detalj. Men foreningen av lncRNA-EBIC med EZH2 foreslo en rolle lncRNA-EBIC i epigenetisk kontroll av genuttrykk. Mer viktig, i denne forskningen, må vi først avslørte differencially uttrykt lncRNAs i CC. Blant disse kandidat lncRNAs, viste vi at en oppregulert lncRNA i CC vev og celler var assosiert med EZH2, kalt lncRNA-EBIC. lncRNA-EBIC kunne fremme CC celler invasjon ved å assosiere med EZH2 og senere undertrykke E-cadherin uttrykk, noe som tyder på at lncRNA-EBIC kan fungere som en tilrettelegger i å rekruttere EZH2 å målrette gener. Dermed tyder våre resultater en viktig rolle for epigenetiske mekanismer i cervical CC patogenesen. En bedre forståelse av hvilken rolle lncRNAs i modulere epigenetisk aktivitet vil gi flere mål for kreftbehandling, og derfor er lovende for individualisert behandling av livmorhalskreftpasienter.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
å bestemme intracellulær lokalisering av lncRNA-EBIC, Cytoplasmatiske
