Abstract
Bakgrunn
Målet med vårt arbeid var å identifisere gener spesifikt endret i bukspyttkjertelen adenokarsinom og spesielt de som er endret tidlig i kreftutvikling.
metodikk /hovedfunnene
genkopitallet ble systematisk vurdert med en ultrahøy oppløsning CGH oligonukleotid microarray i DNA fra prøvene av kreft i bukspyttkjertelen. Flere nye kreftassosiert variasjoner ble observert. I dette arbeidet har vi fokusert på en av dem, som involverer
reg4
genet. Genkopitallet gevinst på
reg4
genet ble bekreftet av qPCR på 14 kreftprøver. Det ble også funnet med øket kopiantall i de fleste PanIN3 prøver. Forholdet betweena gevinsten i
reg4
genkopitallet og kreftutvikling ble undersøkt på humane bukspyttkjertelkreft cellelinje Mia-PaCa2 xenopodet under huden på nakne mus. Når celler ble transfektert med en vektor som tillater reg4 uttrykk, genereres de tumorer nesten to ganger større i størrelse. I tillegg er disse tumorene var mer resistente mot gemcitabin behandling enn kontrolltumorer. Interessant, ukentlig intraperitoneal administrering av et monoklonalt antistoff for å reg4 halvert størrelsen av tumorer som genereres av Mia-PaCa2 celler, noe som tyder på at antistoffet sjenanse for en parakrin /autokrin mekanisme som involverer reg4 og stimulerende kreft progresjon. Tilsetningen av gemcitabin førte til en ytterligere reduksjon, tumorer blir 5 ganger mindre enn kontrollen. Eksponering for reg4 antistoff resulterte i en betydelig reduksjon i intra-tumor nivåer av Pakt, BCL-XL, Bcl-2, Survivin og cyclin D1.
Konklusjon /Betydning
Det ble konkludert med at adjuvant terapi rettet mot reg4 kunne forbedre standard behandling for kreft i bukspyttkjertelen med gemcitabin
Citation. Legoffic A, Calvo E, Cano C, Folch-Puy E, Barthet M, Delpero JR, et al. (2009)
reg4
Gene, forsterkes i de tidlige stadier av kreft i bukspyttkjertelen Development, er en lovende terapeutisk mål. PLoS ONE 4 (10): e7495. doi: 10,1371 /journal.pone.0007495
Redaktør: Joy Sturtevant, Louisiana State University, USA
mottatt: 8. juni 2009: Godkjent: 28 september 2009; Publisert: 16 oktober 2009
Copyright: © 2009 Legoffic et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra INSERM, Ligue Contre le Cancer og INCA til JLI og ved FIS PI081608 prosjektet, Acción Integrada HF2006-0092 og CIBERehd. CIBERehd er finansiert av Instituto de Salud Carlos III til EF-P og DC. EF-P er mottaker av en Ramón y Cajal kontrakt fra det spanske departementet for utdanning og vitenskap og MF-M er mottaker av en FIS-Instituto de Salud Carlos III kontrakt PI050599. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP utgjør 2% av alle nye krefttilfeller, men fører til 5% av alle kreftdødsfall, med en fem års overlevelse på bare 4% [1]. Diagnosen er forsinket på grunn av fraværet av symptomer og mangel på spesifikke markører som tillater påvisning ved et potensielt kurativ trinn. I den generelle befolkningen bærer bukspyttkjertelkreft en livstidsrisiko på ca 0,5-1% [2]. Genetisk predisposisjon er involvert fordi levetid risiko for kreft i bukspyttkjertelen er 4,7% for førstegradsslektninger av bukspyttkjertelkreft tilfeller og risikoen for kreft i bukspyttkjertelen øker med hver berørte familiemedlem. I tillegg kan det være arvet som en del av en multi-kreft-syndrom, men de aller fleste av bukspyttkjertel kreft er sporadisk. Til slutt, tobakksrøyking og sykdommer som diabetes og spesielt kronisk pankreatitt disponere for kreft i bukspyttkjertelen og ca 10% av pasientene med intrapapillary mucinkjertler svulster (IPMNs) vil utvikle bukspyttkjertel adenokarsinom.
Genomisk endringer kan indusere over- eller under uttrykket av gener, med store konsekvenser når onkogener eller tumorsuppressorgener er involvert. De genetiske avvik som oppstår i de forstadier [3], så vel som under initiering og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen er delvis beskrevet [4] – [7]. Faktisk analyser komparativ genomisk hybridisering (CGH) identifisert hyppige gevinster på kromosomer 1q, 3, 5, 7 p, 8Q, 11q, 12p, VED BETJENING 17Q, 19q og 20Q, og tap på kromosomene 3p, 6, 8p, 9p, 10Q, 13q, 15Q, 17p og 18q [8] – [13]. Målet med vårt arbeid var å identifisere, ved hjelp av en ultrahøy oppløsning CGH oligonukleotid microarray, genene spesielt endret i bukspyttkjertelen adenokarsinom celler og spesielt de som er endret tidlig i kreftutvikling. Flere kandidater ble identifisert ved hjelp av denne tilnærmingen, blant som
reg4
genet [14] viste genkopitallet gevinst i 14/14 analyserte prøvene. Dette er så vidt vi vet den første rapporten fra
reg4
genkopitallet gevinst i bukspyttkjertelkreft.
I denne artikkelen vi rapportere at
reg4
genet, plassert på kromosom 1p13 0,1-p12, er til stede i økt kopiantall i kreft i bukspyttkjertelen celler og i slutten av forstadier bukspyttkjertelen lesjoner. Studier på en xenopodet bukspyttkjertelkreft cellelinjen viste at reg4 overekspresjon stimulerer tumorvekst og, omvendt, at blokkering av sirkulerende reg4 protein med et spesifikt antistoff som hemmer tumorvekst.
Resultater
reg4
genet er tilstede i økt kopiantall i kreft i bukspyttkjertelen celler og i Panin 3 forstadier til kreft
Ved hjelp av en Affymetrix microchip-baserte DNA skanning tilnærming, identifiserte vi flere gener med en unormal kopi nummer i DNA fra kreft i bukspyttkjertelen celler. Vi først fokusert på gener endret i alle 14 DNA-prøver og fant at
reg4
viste systematisk økt kopiantall. Alle microarray data rapportert i manuskriptet er beskrevet i samsvar med MIAME retningslinjer. Fullstendige data som beskriver andre DNA avvik vil bli publisert andre steder.
reg4
genet økte kopiantall var spesielt interessant fordi dens uttrykk ble tidligere involvert i aggressivitet av flere typer kreft [15] – [17], inkludert bukspyttkjertel [18]. Figur 1 viser den forsterkede locus, som omfatter
reg4
genet i DNA fra disse pasientene. Vi overvåkes også kopiantallet av
reg4
i bukspyttkjertelen forstadier til kreft oppkalt PanINs. Kombinerer en laser capture tilnærming og en qPCR metode, målte vi antall reg4 kopier i de tre graderinger av Panin lesjoner og fant en økt kopi antall
reg4
i 0/6, 1/7 og 6/7 av PanIN1, PanIN2 og PanIN3 lesjoner, henholdsvis (figur 2). Som kontroll, kopiere numre av
TERT plakater (Telomerase revers transkriptase) og
RPP21 plakater (RNaseP protein p21) gener ble vurdert på samme DNA-prøver og to eksemplarer ble alltid funnet (data ikke vist) . Til sammen disse dataene tyder på at
reg4
genkopitallet ofte økt i kreft i bukspyttkjertelen og i den siste fasen av forstadier til kreft (PanIN3), men sjelden i tidligere stadier (PanIN1 og PanIN2).
Alleliske forhold ble beregnet med Partek Genomics Suite, versjon 6.4. HapMap (270 sampler) ble brukt til å opprette utgangskopiantall. Genomisk segmentering ble brukt til å detektere kopiantall gevinst eller tap. Regioner ble påvist ved hjelp av følgende segmenterings parametre: minimum 10 genomiske markører; segmentering p-verdi terskelen lavere enn 0,001; en signal-til-støy er lik 0,3. A. Skjematisk fremstilling av
reg4
locus. Plassering av de 7 genene som finnes i dette locus er indikert: fra venstre til hø:
ZNF697
,
PHGDH
,
HMGCS2
,
REG4
,
NBPF7
,
ADAM30 Hotell og
NOTCH2
. B. Plassering av kopiantallet gevinst segmentet finnes i alle 14 DNA-prøver fra kreft i bukspyttkjertelen, som inkluderer
reg4
genet. C. Genomisk endringer i den forsterkede delen av
reg4
locus, bestemmes av Affymetrix Genome-Wide Menneskelig SNP Array 6,0 analyse i de 14 bukspyttkjertelkreft prøver. Genetiske gevinster er vist som røde streker og tap som blå søyler, grå søyler som tilsvarer 2 eksemplarer som angitt i skalaen som vises under. Legg merke til overvekt av gevinster (røde) i
reg4
regionen. D. Detalj av gevinst /tap i
reg4
genet og dets flankeregioner for alle 14 analyserte prøvene.
Homogene populasjoner av celler ble nøye microdissected ved hjelp av en laser Capture mikrodisseksjon System. PanINs ble gradert 1-3 som en funksjon av betydningen av arkitektoniske og cytologiske abnormiteter. DNA fra kreft i bukspyttkjertelen prøver innhentet av endoskopisk ultralyd (EUS) -Guidede tynn nål aspirasjon ble brukt. DNA fra blod leukocytter ble anvendt som kontroll.
reg4
genkopitallet ble bestemt ved qPCR utført in triplo, og resultatene ble analysert ved anvendelse av programvaren RealQuant.
reg4 overekspresjon stimulerer celle vekst og øker motstanden mot gemcitabin behandling i MiaPaCa2 celler
in vitro
Det ble tidligere vist at tvang reg4 overekspresjon
in vitro
øker cellevekst og motstand mot programmert celledød i ikke-kreft i bukspyttkjertelen-deriverte celler. Vi fikk Mia-PaCa2 celler som overuttrykker reg4 protein (Mia-PaCa2 /reg4) ved transduksjon av en rekombinant retrovirus (figur 3) og analysert deres evne til å vokse og til å motstå til antitumor stoffet gemcitabin
in vitro
. Vi observerte at celler som uttrykker reg4 vokste ca 50% raskere enn Mia-PaCa2 /tomme celler. Vi har bekreftet at økt cellevekst skyldes reg4 overekspresjon av knockingdown reg4 med en spesifikk siRNA transfeksjon og fant et tap av denne kapasitet, som vist i figur 4. På samme måte, når Mia-PaCa2-celler ble behandlet med 50 uM gemcitabin i 48 timer, motstanden til stoffet ble øket i celler som overuttrykker reg4, sammenlignet med kontroll, men tapt i celler etter hvert transfektert med et siRNA mot reg4 (figur 4). Disse resultatene indikerer at reg4 er involvert i cellevekst og resistens mot anticancer legemidler i bukspyttkjertel kreft-avledede celler som tidligere er foreslått i ikke-pankreas-celler.
hele den kodende sekvensen til reg4 cDNA ble subklonet inn i pLPCX retrovirale vektor. Phoenix amfotropisk emballasje-celler ble transfektert med den retrovirale plasmidet under dannelse av supernatanten inneholdende retrovirale partikler. Target Mia-PaCa2-celler ble platet i nærvær av supernatanten inneholdende retrovirale partikler som er beskrevet i Materiell og Metoder seksjon. Bestandene av reg4-uttrykke Mia-PaCa2 (Mia-PaCa2 /reg4) og kontrollceller (Mia-PaCa2 /tom), infisert med tom vektor, ble isolert ved puromycin utvalg. Ekspresjon av REG4 ble målt ved hjelp av western blot på celleekstrakter, ved hjelp av anti-reg4 monoklonalt antistoff. Etter utvikling, ble membranen strippet og re-analysert for β-aktin.
Mia-PaCa2 /reg4 og Mia-PaCa2 /tomme celler ble transfektert med et spesifikt siRNA mot reg4 (A) eller inkuberes i nærvær av et anti-REG4 monoklonalt antistoff (B) og deres vekst, og deres motstand mot gemcitabin behandlingen ble målt ved hjelp av MTS-analysen. Resultatene ble uttrykt som prosent av ubehandlede Mia-PaCa2 /tomme celler.
REG4 er en 16 kDa sekretorisk protein. For å teste hvorvidt effektene av REG4 på cellevekst og motstand mot gemcitabin behandling var på grunn av dens endokrine /parakrin funksjon i bukspyttkjertelen celler, tilsatte vi et spesifikt monoklonalt antistoff mot REG4 protein i dyrkningsmediet, for å blokkere dens aktivitet. Under disse forholdene, effekter av reg4 overekspresjon forsvant nesten helt, som vist i figur 4. Disse resultatene indikerer at REG4 utøver sin virkning på cellevekst og motstand mot gemcitabin gjennom en endokrin /parakrin måte.
reg4 overekspresjon øker tumorigenicity og motstand mot gemcitabin behandling
Vi har sammenlignet kapasiteten til Mia-PaCa2 /tomt og Mia-PaCa2 /reg4 celler til å danne svulster etter subkutan injeksjon i nakne mus. Som vist i figur 5, svulster som er dannet av celler som over-uttrykker reg4 protein vokste hurtigere enn celler som ikke uttrykker genet. Tumor volum var 70% større ved bruk av Mia-PaCa2 /reg4 celler enn med kontroll Mia-PaCa2 celler. Interessant, når mus ble behandlet med gemcitabin, tumorer over-uttrykker reg4 protein som vises øket motstand mot behandling, sammenlignet med tumorer dannet med Mia-PaCa2 /tomme celler. Mens volumet av tumorer som er generert med Mia-PaCa2-celler reduseres med 60% etter behandling gemcitabin, volumet av reg4-uttrykkende celler ble redusert med bare 20%.
Omtrent 2 x 10
6 Mia-PaCa- 2-celler ble inokulert subkutant med 0,1 ml av Matrigel i nakne mus. Gemcitabin (100 mg /kg) ble injisert intraperitonealt to ganger i uken. Tumor dimensjoner ble målt en gang i uken og tumorvolum beregnes med formelen lengde × bredde × dybde × 0,5236. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt +/- SE seks målinger.
Systemisk behandling med et antistoff mot reg4 avtar tumorigenicity
Neste skritt var å analysere effekten av å blokkere reg4 med et spesifikt monoklonalt antistoff på vekst av svulster indusert ved subkutan injeksjon av Mia-PaCa2 celler. Som vist i figur 6, behandling med den reg4 antistoffet redusert tumorutviklingen med omtrent 50%. I tillegg, ved å kombinere reg4 antistoff behandling med gemcitabin førte til en ytterligere reduksjon av tumorvolumet. Til sammen indikerer disse resultatene at målretting reg4 protein kan brukes i samarbeid med gemcitabin for å behandle kreft i bukspyttkjertelen.
Omtrent 2 x 10
6 Mia-PACA-2-celler ble inokulert subkutant med 0,1 ml av Matrigel i nakne mus. En dag før tumoral celle inokulering, kontrollgruppen mottok en intraperitoneal injeksjon av 150 ul PBS, mens analysegruppen mottok 0,25 mg reg4 monoklonalt antistoff i 150 ul PBS. Bærerbuffer eller anti-reg4 antistoff ble injisert hver uke i dyr. Tumor dimensjoner ble målt en gang i uken og tumorvolum beregnes med formelen lengde × bredde × dybde × 0,5236. Gemcitabin (100 mg /kg) ble injisert intraperitonealt to ganger i uken. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt +/- SE (n = 6).
intraperitoneal injeksjon av reg4 antistoff reduserer nivåene av antiapototic proteiner og cellesyklusassosierte proteiner i Mia-PaCa2-induserte svulster
Fordi systemisk behandling med antistoffet reduserer tumorvekst og øker følsomheten til gemcitabin behandling, anvendte vi western blot-analyse for å overvåke i tumorer påvirkning av reg4 antistoffbehandling på de intracellulære nivåer av proteiner forbundet med apoptose (fosforylert AKT, Bcl- 2, BCL-xL og survivin) og cellesyklus (cyclin D1). Som forventet nivå av fosforylert AKT, BCL-2, Bcl-xL og survivin ble betydelig redusert i svulster fra mus behandlet med reg4 antistoffet sammenlignet med kontroll. Nivå av cyclin D1 ble også funnet redusert i reg4 antistoff-behandlede mus (figur 7). Disse funnene trolig står for den observerte redusert veksttakt.
Kreft vevsprøver ble lysert i en homogenisering buffer som inneholder en cocktail av antiproteaser. Celleavfall og uoppløselige materialer ble fjernet ved sentrifugering, og løselige fraksjoner ble lastet inn i Laemmli-buffer på en 12,5% SDS-polyakrylamidgel. Proteinene ble overført til nitrocellulosemembran og membranen inkubert med anti fosforylert AKT (fosfo-Ser473), anti-pan AKT, anti-Bcl-2, anti-Bcl-xL, anti-Survivin eller anti-cyklin D1 antistoffer. Etter utvikling, ble membranen strippet og reprobed for β-aktin.
Diskusjoner
I denne studien vår hypotese var at tidlig genomiske avvik forekommer i kreft i bukspyttkjertelen celler er ansvarlig for dårlig prognose av pasientene og for mangel på adekvat respons på anti-kreft medikamenter, inkludert gemcitabin. Flere DNA-områder med endret genkopitallet ble faktisk observert i tumorer fra pasienter uten påvisbare metastaser på tidspunktet for undersøkelsen. I dette arbeidet, fokuserte vi vår oppmerksomhet på kromosomet regionen inneholder
reg4
gen fordi det viste økt kopiantall på alle 14 pasienter analysert. I tillegg ble det en økt kopiantall i denne regionen også funnet i nesten alle PanIN3, den siste fasen av forstadier bukspyttkjertelen lesjoner, noe som tyder på at
reg4
genamplifisering er en tidlig hendelse i bukspyttkjertelkreft utvikling. reg4 er en liten utskilt protein som inneholder en enkelt godt konservert karbohydrat-gjenkjenning domene [14], [15]. reg4 er medlem av en multigenic familie som heter
reg plakater (anmeldt i 19). Hos mennesker har fem strukturelt-relaterte medlemmer blitt identifisert til dato og gruppert i tre undergrupper basert på de primære strukturer av de kodede proteiner nemlig REG1A og REG1B (Type 1), REG3A og REG3G (Type 3) og REG4 (Type 4). I motsetning til
reg1A
,
reg1B
,
reg3A Hotell og
reg3G
gener, som alle ligger på kromosom 2p12,
reg4
er på kromosom 1p13.1-p12. Flere rapporter i litteraturen tyder på en stor rolle for REG4 i kreft. For eksempel synes REG4 uttrykk for å være ansvarlig for celle motstand mot kreft narkotika som 5-fluouracil og metotreksat [15], [20], det fremmer AKT fosforylering og over-uttrykk for antiapoptotic proteiner BCL-2, BCL-XL og survivin [21], [22], aktiverer den EGF reseptor /Akt /AP1 signalveien [21] og dens uttrykk korrelerer med forbedret peritoneal metastaser i mage karsinom [22], [23]. Den er systematisk overuttrykt i kreft vev avledet fra tykktarmen [15], [24], mage [16], prostata [25] og bukspyttkjertel [18] og i sykdommer som disponerer for kreft i tykktarmen som ulcerøs kolitt [14], [26] , Crohns sykdom [14] og kolorektal adenom [24]. Den tidlige amplifisering av dets gen i kreft i bukspyttkjertelen er beskrevet i denne undersøkelsen (figur 1 og 2) og dets onkogene aktivitet rapportert i litteraturen fikk oss til å ytterligere studere rollen til REG4 i bukspyttkjertelen og tumorgenisitet i motstanden av kreft i bukspyttkjertelen til gemcitabin behandling. Den første observasjon var at bukspyttkjertelkreft-avledede celler som overuttrykker proteinet REG4 vokste hurtigere og var mer resistente overfor gemcitabin behandling (figur 4). Den andre, mer viktig observasjon var at i en xenograft modell, tumorer indusert med Mia-PaCa2 celler som uttrykker reg4 vokste raskere enn kontroll svulster, oppnås med innfødte Mia-PaCa2 celler (figur 5). I tillegg fant vi at svulster forårsaket av Mia-PaCa2 celler som uttrykker reg4 var mer motstandsdyktig mot gemcitabin behandling enn kontroll svulster, etter avtale med
in vitro
data og tidligere rapporter antyder involvering av REG4 i celle motstand mot kreft narkotika [15], [20] og svar på kjemoradioterapi [27]. Den tredje, meget spennende resultat ble oppnådd når mus med Mia-PaCa2-induserte tumorer ble behandlet med systemisk administrering av et spesifikt anti-reg4 antistoff (figur 6). Vi observerte en viktig reduksjon i tumorstørrelse og økt følsomhet for gemcitabin behandling hos mus som er gitt en gang i uken anti-reg4 antistoff. Fordi den begrensede effektivitet av kreft i bukspyttkjertelen behandling med gemcitabin kan være på grunn av tilstedeværelsen av stroma i tumorer [28], har vi sett hvorvidt overekspresjon reg4 påvirket omfanget av stroma dannelse i subkutant xenopodet Mia-PaCa2 celler. Semikvantitativ analyse viste ingen signifikant forskjell mellom svulster overekspresjon eller ikke REG4, eller behandlet med REG4 antistoff, alle av dem viser svært begrenset stroma (data ikke vist). Imidlertid kan resultatene bli forklart, i det minste delvis, av det faktum at nivåene av antiapoptotic-assosierte proteiner som aktivert AKT, Bcl-2, Bcl-xL og overlevende, i tillegg til cellesyklus-assosiert protein cyclin D1 , var sterkt redusert (figur 7) indikerer at apoptose og cellesyklus er regulert av reg4. Fordi antistoffene ikke er ment for å trenge inn i tumorceller i store mengder, må en autokrin eller parakrin virkning tas i betraktning. Ved sekresjon av tumorceller, ville reg4 aktivere, sannsynligvis gjennom spesifikke reseptorer, intracellulære trasé som favoriserer kreft progresjon. Disse dataene er i overensstemmelse med resultater funnet i tykktarm og magekreftceller
in vitro product: [21], [22]. Til sammen tyder disse resultater på at overekspresjon av REG4 protein, indusert ved sin tidlig gevinst i genkopitallet, spiller en viktig rolle i bukspyttkjerteltumorutvikling og resistens mot anticancer legemidler. Målrette sirkulerende REG4 protein ser ut som en lovende adjuvant til dagens behandling av bukspyttkjertel adenokarsinom, basert på gemcitabin administrasjon.
Materialer og metoder
Utredning av
reg4
genkopitallet i bukspyttkjertelkreft
Fjorten påfølgende kreft i bukspyttkjertelen prøver ble innhentet av endoskopisk ultralyd (EUS) -Guidede tynn nål aspirasjon cytologi mellom juni 2007 og september 2007 på sykehuset Nord, Marseille. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Seks prøver ble oppnådd fra pasienter uten påvisbar metastaser, mens 8 presentert med metastaser ved tidspunktet for punksjon. DNA ble ekstrahert, forsterket og hybridisert på Affymetrix Genome-Wide menneskelig SNP rekke 6,0 i henhold til produsentens instruksjoner (Affymetrix Inc.). Den Affymetrix Genome-Wide Menneskelig SNP Array 6,0 har mer enn 1,8 millioner markører for genetisk variasjon, inkludert mer enn 906,600 enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) og mer enn 946,000 prober for deteksjon av kopiantall variasjon. Median inter-markør avstand tatt over alt 1,8 millioner SNP og kopiere antall markører kombinert er 696 baser. Matrisen inneholder også 202,000 prober rettet mot 5.677 kjente regionene i kopiantall variasjon, løse inn 3,182 forskjellige, ikke-overlappende segmenter, fra Toronto Database of Genomic Varianter. Hybridisering, vasking, farging, og chip skanning ble utført av CRCHUL microarray kjernen Facility med materialer og metoder fra produsenten (Affymetrix Inc.).
Totalt hybridisering kvalitet ble anslått av takst indeksen hentet fra Genechip genotyping Analysis Software (GTYPE, fuglefrø algoritmen med standard parameterinnstillingene). Allele forhold ble beregnet med Partek Genomics Suite, versjon 6.4 (Partek Inc., St. Louis, MO) ved hjelp av proprietære standard parametere. A 270 HapMap prøvene ble brukt til å lage kopi nummer fra baseline. Genomisk segmentering ble benyttet som en metode for å detektere endringer kopitall. Regioner ble påvist ved hjelp av følgende segmenterings parametre: minimum 10 genomiske markører; segmentering p-verdi terskelen lavere enn 0,001; og en signal-til-støy er lik 0,3. Ved hjelp av disse parametrene, ble 10263 segmenter detektert. Utvalgte segmenter ble visualisert i en genomisk sammenheng med Partek® Genomics Suite.
DNA fra Panin lesjoner
Syv micron seksjoner fra formalinfiksert, parafininnebygd vevsblokker ble farget med hematoksylin og eosin. Homogene populasjoner av celler ble nøye microdissected bruker en PixCell II Laser Capture mikrodisseksjon System (Arcturus, Mountain View, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. PanINs ble gradert 1-3 i henhold til gjeldende retningslinjer (https://pathology.jhu.edu/pancreas_panin/og [29]) som en funksjon av betydningen av arkitektoniske og cytologiske abnormiteter. Syv menneskelige bukspyttkjertelen Prøvene ble analysert der vi fant systematisk PanIN2 og PanIN3 lesjoner men PanIN1 lesjoner ble funnet i bare seks av dem. Totalt 300 celler ble samlet for hver kategori fra seriesnitt vev. Oppsamlede celler ble overført til et Eppendorf-rør og resuspendert i 20-50 pl av lyseringsbuffer inneholdende 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 (pH 8,3), og 5 pl proteinase K (20 mg /ml). Prøvene ble inkubert i 24 timer ved 55 ° C, etterfulgt av koking i 10 min for å inaktivere proteinase K. DNeasy Tissue Kit (Qiagen) ble anvendt for å ekstrahere DNA i henhold til produsentens protokoll. Ekstrahert DNA ble kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nano-Drop Technologies, Wilmington, DE).
reg4
genkopitallet estimering av Real-Time PCR
reg4
genkopitallet ble bestemt ved bruk av hreg4-F: 5′-TTTACTCCCTGTGGTCTGGG-3 «og hreg4-R: 5′-CTCTTTTCTCCAGCAAGGCA-3» primere. Amplifikasjon ble utført i en LigthCycler 480 (Roche Diagnostic) ved hjelp av følgende skjema: 10 s denaturering ved 95 ° C, 45 sykluser av 8 s denaturering ved 95 ° C, 7 s glødning ved 60,5 ° C og 14 s av forlengelse ved 72 ° C. Smelting kurve ble oppnådd ved oppvarming ved 20 ° C /s til 95 ° C, avkjøling ved 20 ° C /s til 65 ° C og oppvarming ved 0,1 ° C /s til 95 ° C med fluorescens datainnsamling ved 0,1 ° C intervaller. Standardkurver ble generert ved anvendelse av en 10-gangers fortynningsserie i området fra 0,1 ng til 100 ng. Vi utførte qPCR for hver enkelt i triplikat, og bestemt normalisert i forhold kopiantallet ved å generere en standardkurve og å normal tvers av prøver. PCR resultater ble analysert ved anvendelse av programvaren RealQuant (Roche Diagnostic). De samme 14 DNA-prøver fra bukspyttkjertelkreft brukes for hybridisering på Affymetrix Genome-Wide menneskelig SNP rekke 6.0 ble brukt for qPCR. DNA fra blod leukocytter erholdt fra tilsynelatende friske individer ble anvendt som kontroll.
Retroviral vektor og retrovirus-mediert genoverføring
hele den kodende sekvensen til reg4 cDNA ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av primer-par 5 «-GGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGCGG-3′ (fremover) og 5»-GGCTCGAGCTATGGTCGGTACTTGCACAGG-3 «(revers), som inneholdt EcoRI og Xhol-restriksjonsseter (understreket). Produktet ble subklonet inn i EcoRI-Xhol-restriksjonssetene av den pLPCX retrovirale vektor oppnådd fra S. Lowe (Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Phoenix amfotropisk emballasje-celler (10
6) ble sådd ut i en seks-brønns plate, inkubert i 24 timer og transfektert med polyetylenimin med 5 ug av retroviral plasmid. Førtiåtte timer senere ble mediet som inneholdt viruset filtrert (0,45 um filter, Millipore) for å oppnå den første supernatanten. Target Mia-PaCa2 ble sådd ut i 2 x 10
5 celler per 35-mm fatet og inkubert over natten. For infeksjon ble kulturmediet erstattet med en passende blanding av den første supernatanten og kulturmedium (v /v), supplert med 4 ug /ml polybrene (Sigma), og cellene ble inkubert ved 37 ° C. Befolkningen i reg4-uttrykke Mia-PaCa2 (Mia-PaCa2 /reg4) ble isolert ved valget i nærvær av puromycin (1 mg /ml). Mia-PaCa2 infisert med tom vektor (Mia-PaCa2 /tom) ble brukt som kontroll.
in vitro
studier
Cell dyrkningsforhold og siRNA transfeksjon.
bukspyttkjertelcancercellelinjer Mia-PaCa2 /reg4 og Mia-PaCa2 /tomme ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum og 2 mM L-glutamin i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Dagen før siRNA transfeksjon ble cellene sådd ut i 6-brønns plater til slutt å gi 30-50% konfluens. Etter fjerning av medium, ble cellene vasket en gang med serumfritt medium og transfeksjon ble utført i serumfritt medium ved tilsetning av en blanding bestående av 10 ul Oligofectamine reagens (Invitrogen) og 200 pmol siRNA (reg4 siRNA [5’CTTCAGGAAGCTGAGGAAC3 « ] eller kontroll siRNA [5’AATTCTCCGAACGTGTCACGT3 «] målrettet sekvenser) fortynnet i 240 ul serumfritt medium. Etter en inkubasjonstid på 4 timer ved 37 ° C, ble transfeksjon medium inneholdende sirnas erstattet med friskt medium.
Cellevekst og gemcitabin behandling.
10
4 celler /brønn var sådd ut på 96-brønners plater i 100 ul kulturmedium. Den neste dag, gemcitabin (kjøpt fra Eli Lilly) ble tilsatt i 100 ul av medium til en endelig konsentrasjon på 50 uM i nærvær eller ikke av ett mikrogram av reg4 monoklonalt antistoff. Etter 48 timer 20 ul MTS ([3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium] reagenset oppnådd fra Promega) ble satt , ble platene inkuberes ved 37 ° C i 30 min, og absorbansen avlest ved 490 nm.
in vivo
studier
Vurdering av
in vivo
tumorvekst.
institusjonelle retningslinjer for forsvarlig og human bruk i forskning ble fulgt. Omtrent 2 x 10
6 Mia-PACA-2-celler ble inokulert subkutant med 0,1 ml av Matrigel (BD Biosciences Discovery Labware) til 6 uker gamle hann nakne mus. En dag før tumoral celle inokulering, kontrollgruppen mottok en intraperitoneal injeksjon av 150 ul PBS (kjøretøy), mens analysegruppen mottok 0,25 mg reg4 monoklonalt antistoff i 150 ul PBS. Bærerbuffer eller anti-reg4 antistoff ble injisert hver uke i dyr. Tumor dimensjoner ble målt en gang i uken og tumorvolum beregnes med formelen lengde × bredde × dybde × 0,5236 som tidligere rapportert [30]. Gemcitabin (100 mg /kg) ble injisert intraperitonealt to ganger i uken. Alle studiene ble utført i henhold til EU-reglene for dyreforsøk. Forsøkene ble godkjent av etisk komité ved Marseille universitet.
Western blot analyse.
Mia-PaCa2 celler og prøver svulstvev ble lysert i en homogenisering buffer som inneholder pepstatin (1,45 mM), leupeptin (2,1 mM), DTT, trietanolamin (50 mM) og EDTA /EGTA (0,1 mM). Celleavfall og uoppløselige materialer ble fjernet ved sentrifugering (14.000 g, 30 minutter ved 4 ° C), og løselige fraksjoner ble analysert enten umiddelbart eller lagret ved -80 ° C inntil bruk. Totalt protein (50 ug) ble lastet inn i Laemmli-buffer på en 12,5% SDS-polyakrylamid-gel i en Mini-celle (Bio-Rad). Proteinene ble overført til nitrocellulosemembraner i 1 time ved bruk av en Mini Trans-Blot elektroforetisk overføring Cell (Bio-Rad). Membranen ble blokkert i 1 x PBS /0,05% Tween 20/5% fettfri tørrmelk over natten ved 4 ° C. Etter to vaskinger i 1 x PBS /0,005% Tween 20, ble primære antistoffer tilsatt i 1-2 timer. Etter tre vaskinger til ble det sekundære antistoff tilsatt i 1,5 time. Membranen ble utviklet ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL) kit (Amersham Life Science) på Kodak film i det mørke rommet. Membranen ble deretter strippet og reprobed for β-aktin ved hjelp av protokollen beskrevet i ECL Kit
Antistoffer
Anti-humant reg4 monoklonalt antistoff (klon 200214) ble innkjøpt fra R D Systems; BCL-2 (C21), BCL-XL (H-62), Survivin (FL-142), cyclin D1 (C20) og β-aktin (N-21) kanin polyklonale antistoffer var fra Santa Cruz Biotechnology; fosforylert AKT (fosfor-Ser473) polyklonale antistoff var fra Upstate Biotechnology Inc;
