Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen (PC) er fortsatt en av de mest dødelige menneskelige maligne med dårlig prognose. Til tross for alle fremskritt i preklinisk forskning, har det ikke vært vesentlige oversettelse av nye behandlingsformer i klinikkene. Utviklingen av genmodifisert mus (GEM) modeller som produserer spontan bukspyttkjertelen adenokarsinom (PDAC) har økt vår forståelse av patogenesen av sykdommen. Selv om disse PDAC musemodeller er ideelle for å studere mulige terapier og spesifikke genetiske mutasjoner, er det et behov for å utvikle syngeniske cellelinjer fra disse modellene. I denne studien, beskriver vi en vellykket etablering og karakterisering av tre cellelinjer avledet fra to (PDAC) musemodeller. Cellelinjen FN-KC-6141 ble avledet fra en bukspyttkjertel svulst i en Kras
G12D; Pdx1-Cre (KC) mus ved 50 ukers alder, mens FN-KPC-960 og FN-KPC-961 cellelinjer var avledet fra bukspyttkjertelen svulster i Kras
G12D; Trp53
R172H, Pdx1-Grobunn (KPC) mus ved 17 ukers alder. Kreft mutasjoner av disse foreldre musene overført til dattercellelinjer (dvs.
Kras
G12D
mutasjon ble observert i alle tre cellelinjene mens
Trp53
mutasjonen ble kun observert i KPC celle linjer). Cellelinjene viste typisk brostein epitelial morfologi i kultur, og i motsetning til tidligere etablert muse PDAC cellelinje Panc02 uttrykte ductal markør CK19. Videre er disse cellelinjene uttrykte epitel-mesenchymale markører E-cadherin og N-cadherin, og også, MUC1 og Muc4 slimstoffer. I tillegg er disse cellelinjene var resistente mot det kjemoterapeutiske legemiddel gemcitabin. Deres implantasjon
in vivo
produsert subkutan samt svulster i bukspyttkjertelen (orthotopic). De genetiske mutasjoner i disse cellelinjene etterligne den genetiske kompendium av menneskelig PDAC, noe som gjør dem verdifulle modeller med et stort potensial for translasjonsforskning relevans for å undersøke diagnostiske markører og terapeutiske legemidler
Citation. Torres MP, Rachagani S, Souchek JJ, Mallya K, Johansson SL, Batra SK (2013) Novel bukspyttkjertelkreft cellelinjer avledet fra genmodifiserte mus modeller av Spontan bukspyttkjertelen adenokarsinom: Programmer i diagnose og terapi. PLoS ONE 8 (11): e80580. doi: 10,1371 /journal.pone.0080580
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 20 august 2013; Godkjent: 14 oktober 2013; Publisert: 20.11.2013
Copyright: © 2013 Torres et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra NIH (TMEN U54 CA163120, EDRN UO1, CA111294, SPORE P50 CA127297, RO1 CA133774, RO1 CA78590, og RO3 CA167342). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for mange fremskritt i forståelsen av molekylære mekanismene som er involvert i bukspyttkjertelkreft (PC) patogenesen i løpet av de siste fire tiårene, forblir sykdommen en av de beste malignitet med verste prognosen [1]. Disse dystre statistikken er en konstant påminnelse om det presserende behovet for å belyse ennå uoppdagede mekanismer for PC patologi som vil bidra til bedre diagnose og behandlingsregimer. For dette formål utvikler prekliniske modeller er av avgjørende betydning, fordi de er viktige for å vurdere nye terapeutiske strategier [2]. Xenografttumorer i atymiske nakne mus er nyttige prekliniske modeller, men de kan ikke gi rollen til immunmekanismer som kan legge til eller forstyrre virkningen av terapeutiske kandidater. Mer nylig, genetisk modifiserte mus (GEM) modeller som produserer spontane pankreatiske adenokarsinomer (PDAC) har i stor grad utvidet vår forståelse av patogenesen PC og også, tillot undersøkelse av nye terapeutiske tilnærminger [3] – [6]. I tillegg kan syngeniske cellelinjer bli isolert fra pankreatiske tumorer produsert av GEM modeller og anvendt for
in vitro
og
in vivo-
screeningsanalyser. Analysen av funksjoner og egenskaper ved spesifikke genetiske mutasjoner og PC biomarkører stede i disse cellelinjene kan kaste lys over utformingen av lovende diagnostiske og terapeutiske strategier.
Mutasjoner i
KRAS
,
CDKN2A
,
TP53
, og
SMAD4 /DPC4
gener er ofte observert i PDAC svulster fra PC-pasienter [7]. I betraktning av disse resultater flere musemodeller som produserer spontan PDAC, har blitt utviklet i de siste tiår [3], [4], [6]. Denne studien fokuserer på mus som bærer
Kras Hotell og
Trp53
mutasjoner. Rollen onkogen
Ras
i PC ble undersøkt ved å dirigere endogen uttrykk for
Kras
G12D
i stamceller i bukspyttkjertelen i Kras
G12D; Pdx1-Cre (KC ) mus [3], mens rollen som den endogene uttrykk for
Trp53
R172H Hotell og
Kras
G12D
ble undersøkt i bukspyttkjertelen av Kras
G12D; Trp53
R172H, Pdx1-Cre (KPC) mus [4]. Resultatene tyder på at de spontane pankreastumorer produsert av disse musemodeller rekapitulere de kliniske, histopatologiske og genomiske trekk ved menneskelig PDAC.
Mus PDAC cellelinjer med større klinisk relevans til PC er svært nødvendig. Den tiden tilgjengelig Panc02 cellelinje har blitt brukt i løpet av de siste tre tiårene [8]. Det ble utledet fra PDAC tumorer indusert ved implantering av 3-metyl-cholanthrene (3-MCA)-mettet tråder av bomull i bukspyttkjertelen fra C57BL /6-mus. Til tross for sin omfattende bruk i å vurdere ulike terapeutiske strategier, Panc02 cellene mangler sterk klinisk betydning for PC på grunn av fravær av mutasjonsspekteret i forhold til sykdom hos mennesker. Derfor har lykkes i å oversette behandling indikeres av denne modellen vært begrenset. I dette manuskriptet, beskriver vi generasjon og karakterisering av tre nye PDAC cellelinjer avledet fra spontane musemodeller av PC. En cellelinje ble avledet fra et KC-mus 50 uker gamle, og to andre ble avledet fra KPC mus ved 17 ukers alder. Den vellykkede etablering og
in vitro Hotell og
in vivo
karakterisering av disse cellelinjene er omfattende beskrevet, inkludert markører kjente for bukspyttkjertelsvulster.
Materialer og Metoder
Etableringen av cellelinjer
komplett medium besto av DMEM som inneholdt varme-inaktivert FBS, L-glutamin (200 mM), 100 x ikke-essensielle aminosyrer (100 mM), natriumbikarbonat, HEPES-buffer, Gentamicin (50 mg /ml), og penicillin /streptomycin (100 ug /ml). Umiddelbart etter resecting tumoren, ble 200 mg av pankreatisk tumorvev overført til en petriskål inneholdende sterilt PBS og gentamicin (20 pg /ml).
De oppsamlede Vevene ble vasket 3 ganger med PBS-gentamicin og overført til en petriskål som inneholdt det komplette medium. Tumoren ble finsk hakket med en steril skalpell og overført til et sterilt sentrifugerør med komplett medium inneholdende Kollagenase P (Roche, Indianapolis, IN) (10 mg /ml) sikret blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Rørene ble snudd etter tre minutter for å sikre riktig blanding. Etter to vaskesykluser i komplett medium, ble det oppnådd etter sentrifugering pellet suspendert i fullstendig medium. Etter å la røret stå i 2 minutter, ble cellesuspensjonen uten vevsrester overført til en ny steril 10 cm petriskål.
Etter inkubering over natten ved 37 ° C i 5% CO
2, mediet var erstattet med friskt medium. Cellene ble trypsinert gang sammenflytende. For å hindre vekst av fibroblaster, ble differensial trypsinering utført, hvor trypsin ble tilsatt til cellene, og etter 10 sek, ble cellene vasket med PBS og ferskt medium ble tilsatt. I tillegg medium ble supplert med kolera toksin (400 ng /ml) i de første passasjene 7 som det er tidligere blitt rapportert at det har en forbedret mitogen effekt på epitelceller, men ikke på fibroblast-celler [9]. Etter 10 passasjer ble cellelinjene overført til normal fullstendig medium (dvs. DMEM-medium supplert med 10% FBS, 100 ug /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin) og holdt ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fuktet inkubator. Tre cellelinjer ble etablert vellykket. Cellelinjen stammer fra en Kras
G12D; Pdx1-Cre (KC) mus ble kåret til FN-KC-6141 og de to cellelinjer avledet fra Kras
G12D; Trp53
R172H, Pdx1-Cre (KPC ) mus ble kåret til FN-KPC-960 og FN-KPC-961 (UN utpeker University of Nebraska Medical Center).
In vitro
karakterisering og tumorigene studier ble gjort etter 35 passasjer i cellekultur. Den murine PDAC cellelinje Panc02 ble inkludert i
in vitro
funksjonelle analyser.
Sekvensering av cellelinjer for
Kras Hotell og
p53
Mutasjoner
De sub-konfluente kulturer av FN-KC-6141, UN-KPC-960, og FN-KPC-961 ble lysert med cellelyse løsning som inneholder beta-merkaptoetanol og total RNA ble isolert med RNeasy MINIKIT (Qiagen, German , MD). cDNA ble syntetisert fra total RNA ved å bruke oligo (dT) primer og 18 Superscript II revers transkriptase (Life technologies ™, Carlsbad, CA). PCR-amplifisering av murine
Kras
kodon 12 (ekson 1) og
p53
kodoner 172 (Exon 5) ble utført ved hjelp av sett av primere for hver enkelt gen (
Kras
-seqF: 5′-ACTTGTGGTGGTTGGAGCTG-3 «,
Kras
-seqR: 5′-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3′,
p53
-seqF: 5′-CACGTACTCTCCTCCCCTCA-3 «og
p53
-seqR: 5′-ATTTCCTTCCACCCGGATAA-3 «), noe som resulterer i en 168 bp (
Kras
) og 229 bp (
p53
) PCR-produkter. PCR-produktene ble renset med PCR produkt rensing kit (Qiagen, Germantown, MD) og de rensede PCR produktene ble sekvensert ved hjelp av
Kras
-seqR: 5′-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3 «for
Kras
og
p53
-seqF: 5′-CACGTACTCTCCTCCCCTCA-3 «for
p53
genet
vekst Kinetics
for vekstkinetikk studier, hver cellelinje. ble sådd ut i fire eksemplarer i en 96-brønns plate (1.000 celler /brønn) i fullstendig medium. Etter inkubering over natten, ble mediet erstattet med medium supplementert med 1% FBS og penicillin /streptomycin (100 ug /ml). Hver dag, 10 pl av celleproliferasjon Reagens WST-1 (Roche, Indianapolis, IN) ble tilsatt til hver brønn, og etter tre timers inkubering, ble absorbans-verdier målt ved 450 nm. Absorbans-verdiene ble subtrahert fra verdier registrert ved referansebølgelengden (600 nm), som angitt av produsenten. Fremgangsmåten ble gjentatt i 7 dager. Den dobling tid (T
D) for hver cellelinje ble beregnet under eksponentiell vekstfase ved hjelp av formelen T
D = 0.693t /ln (N
t /N
0), hvor t = tidsforskjellen i h, N
t = absorbans verdi ved tidspunktet t, og N
0 = absorbans verdi ved første tiden [10].
real time PCR
RNA ble isolert og renset fra FN-KC-6141, UN-KPC-960, FN-KPC-961, Panc02, og NIH3T3 (musefibroblastere) celler ved hjelp av RNeasy MINIKIT (Qiagen, Germantown, MD). cDNA ble syntetisert fra total RNA ved å bruke oligo (dT) primer og 18 Superscript II revers transkriptase (Life technologies ™, Carlsbad, CA) som beskrevet av oss i en tidligere publikasjon [11]. Real-time PCR ble utført i LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Amplifikasjonen ble utført i en to-trinnsprosess (95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 10 sek, 60 ° C i 10 sek, og 72 ° C i 10 sek) ved hjelp av LightCycler 480 SYBR grønn jeg Master Mix (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) og cDNA fra hver prøve.
GAPDH
ble anvendt som den interne kontroll-genet som alle genene ble normalisert. Fold-endring i genekspresjon av
Amylase Hotell og
CK19
mRNA i kreftcellelinjer ble sammenlignet i forhold til mRNA nivåer hentet fra normal mus bukspyttkjertelen hjelp av to
-ΔΔCt metode, mens fold-endring av
Muc1
og
Muc4
ble sammenlignet i forhold til mRNA ekstrahert fra muse fibroblast cellelinje NIH3T3. Sekvensen av primerne brukt i denne studien er oppført i Tabell 1.
Antistoffer
Den anti-CK19 hybridom (TROMA-III) er utviklet av Dr. Rolf Kemler ble hentet fra den utviklingsstudier hybrid Bank utviklet i regi av den NICHD og opprettholdt ved The University of Iowa (Iowa City, IA). Antistoff mot muse-E-cadherin ble erholdt fra Cell Signaling (Danvers, MA). N-cadherin antistoff var en slags gave fra Dr. Keith R. Johnson fra UNMC (Omaha, Nebraska). β-aktin og Amylase-antistoffer ble anskaffet fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO). For confocal studier de sekundære antistoffer konjugert til Alexa Fluor® (568, 488) ble hentet fra Life Technologies ™ (Carlsbad, California). De sekundære antistoffer konjugert til pepperrotperoksidase brukes til western blot analyse ble innhentet fra GE Healthcare og biovitenskap (Uppsala, Sverige). Anti-mus Muc1 antistoff (monoklonalt muse-antistoff som gjenkjenner den cytoplasmiske hale av Muc1) ble kjøpt fra Abcam® (Cambridge, MA, USA). Den anti-Muc4 (4A-kanin polyklonale) antistoff ble designet i denne lab og utviklet av GenScript (Piscataway, NJ, USA) som har blitt beskrevet tidligere [12].
Konfokalmikroskopi
protein-ekspresjon ble analysert ved konfokal mikroskopi. 2 x 10
5-celler suspendert i fullstendig medium ble podet på glass dekkglass plassert i en 12-brønns plate. Den neste dag ble cellene fiksert i iskald metanol. Etter vasking i PBST og blokkering med 10% geiteserum (Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, PA) ble cellene inkubert med antistoffer for Amylase (1: 500), CK19 (1: 1000), E-cadherin (01:50 ), N-cadherin (01:20), og Muc1 (1: 100) over natten. De ble vasket fire ganger med PBST, 5 minutter per vask. Cellene ble inkubert med de respektive sekundære antistoffer (mus /kanin) konjugert med Alexa Fluor (568, 488) (Life Technologies ™, Carlsbad, CA) og etter gjentatte vasketrinnene, ble dekkglass montert på objektglass med Vectashield montering medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Cellene ble fotografert på en laser konfokalt mikroskop LSM 510 (Carl Zeiss GmbH, Thornwood, NY) i de respektive bølgelengder ved en forstørrelse på x 63.
Western Blot analyse
For western blot-analyse , celler ble sådd i hver brønn av en 6-brønns plate i fullstendig medium. Ved ~80% konfluens ble cellene lysert med radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer (RIPA) inneholdende protease og fosfatase-inhibitorer. Lysatene ble underkastet flere fryse-tine-sykluser for å sikre fullstendig lysis. Konsentrasjonen av lysatene ble bestemt med mikro-bicinchoninic syre protein estimering kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Proteinkonsentrasjonene ble justert og oppløsningene ble fremstilt under reduserende betingelser (dvs. β-merkaptoetanol). 2% SDS-agarose-geler ble brukt for analyse av Muc4 uttrykk. 40 ug av protein lysater ble lastet og gelen ble kjørt i 4 timer ved 100 V. E-cadherin og N-cadherin ekspresjonsnivåer ble analysert ved SDS-PAGE. 40 ug av protein lysater ble lastet og separasjon ble utført ved 80 mA i en time. Løst proteiner ble overført til polyvinylidendifluorid-membraner, blokkert i 5% melk i PBS, og inkubert med primære antistoffer over natten. Etter vasking med PBST, ble de tilsvarende sekundære antistoffer tilsatt og etter gjentatte vasketrinnene, ble proteinene detektert av luminol (Thermo Scientific, Middletown, VA) etter eksponering for røntgenfilmer.
Cytotoksisk Assay
cytotoksisk effekt av det kjemoterapeutiske legemiddel Gemcitabin på KC og KPC-cellelinjer ble sammenlignet med den cytotoksiske virkning på Panc02. Den injiserbare løsning av gemcitabin, GEMZAR® (Eli Lilly Company, Indianapolis, IN) ble vennlig levert av apoteket på Lied Transplant Center på UNMC. For det cytotoksiske analysen, 1 x 10
4 celler suspendert i fullstendig medium ble podet i hver brønn i en 96-brønns plate. Den neste dag ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av gemcitabin-oppløsning (100 nM-100 uM) i kvadruplikat-brønner. Etter inkubering av cellene med Gemcitabin i 48 timer, ble medium inneholdende tiazolyl blå tetrazolium-bromid-reagens (Sigma Aldrich, St Louis, MO) tilsatt til cellene. Etter 4 timers inkubering ble de formazankrystaller som produseres av metabolsk aktive celler som oppløses med 100 ul DMSO. Absorbans verdier ved 540 nm ble anvendt for å beregne cytotoksiske prosenter. Den halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC-50) av gemcitabin ble bestemt i hver cellelinje fra interpolere verdier i grafen (% Cytotoksisitet vs. gemcitabin Konsentrasjon).
tumorigenitet studier
tumorigenicity av cellelinjene ble bestemt etter orthotopic implantasjon av mus PC cellelinjer (UN-KC-6141 /FN-KPC-960 /UN-KPC-961) i hodet av bukspyttkjertelen etter 35 passasjer. Basert på musene bakgrunn fra hvor cellelinjer ble generert, FN-KC-6141 celler (1 x 10
6) ble injisert i C57BL /6 mus, mens FN-KPC-960 og FN-KPC-961 celler ( 1 x 10
6) ble injisert i blandet bakgrunn (dvs. B6.129) mus (N = 7). Mus PC-celler suspendert i 50 ul steril PBS ble injisert orthotopically ved å bruke den samme fremgangsmåte som er beskrevet av oss [13], [14]. Subkutan tumorvekst ble evaluert med FN-KPC-961 cellelinje bare. 5 x 10
6-celler ble injisert (N = 12) i blandede B6.129 bakgrunns mus på den laterale brystet. Tumorveksten ble overvåket ved palpasjon /Vernier kalibermålinger i tilfelle av subkutane tumorer. Gjennom hele forsøket ble dyrene utstyrt med mat og vann ad libitum og ble underkastet en 12-timers mørke /lys syklus. Dyrestudier ble utført i henhold til US Public Health Service «Retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr» under en godkjent protokoll ved University of Nebraska Medical Center Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). Etter euthanization ble pankreastumorer dissekert ut, veid og fiksert i 10% formalin (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) for H E farging. Brutto metastatiske lesjoner ble undersøkt i fjerne organer og behandlet for histologisk analyse
Hematoxylin og eosin farging (H E).
Etter festing vev i 10% formalin i minst 48 timer, vevet ble innebygd i parafin og serie vevssnitt (4 mikrometer tykk) ble kuttet. Seksjonene ble deparaffinized bruker EZ-DeWaxTM (Bio Genex, San Roman CA, USA) og rehydrert progressivt. Etterpå ble seksjonene farget med hematoxylin og eosin (H E). Flekker og undersøkt av en sertifisert patolog
statistikker
Vesentlige forskjeller i de eksperimentelle verdier ble bestemt ved å beregne p-verdier ved hjelp den JMP® Statistiske Discovery Software (Cary, NC). En t-test ble brukt til å beregne den tilsvarende
p-verdi product: (
p-verdier
0,05 ble betraktet som statistisk signifikant).
Resultater
In vitro
etablering av KC og KPC cellelinjer
mus PC cellelinjer ble vellykket generert fra spontane pankreastumorer produsert av Kras
G12D; Pdx1-Cre (KC) og Kras
G12D; Trp53
R172H, Pdx1-Cre (KPC) mus i 50 uker og 17 uker gamle, henholdsvis. En cellelinje avledet fra KC mus ble kåret til FN-KC-6141, og to andre cellelinjer avledet fra KPC mus ble kåret til FN-KPC-960 og FN-KPC-961. Alle tre cellelinjer vokste i over 50 passasjer i normal media med ingen tegn til alderdom. Ettlagskulturer i alle tre cellelinjene viste typisk brostein morfologi med lukket kontakt øy formasjon (fig 1A). For å kontrollere at disse cellelinjer opprettholdes de genetiske mutasjoner av deres respektive foreldre mus (KC og KPC), mutasjonsstatus av
Kras plakater (Fig. 1B) og
Trp53 plakater (Fig. 1C ) loci ble undersøkt. Som forventet, alle tre cellelinjer gjennomført
Kras
G12D
punktmutasjon, mens FN-KPC-960 og FN-KPC-961 bar
Trp53
R172H
aktivere mutasjon .
(A) Inverterte mikroskop bilder (4x) FN-KC-6141, UN-KPC-960, og FN-KPC-961 PDAC cellelinjer etter 35 passasjer. De tre cellelinjer vises typisk brostein epitelial morfologi. Genetisk sekvensanalyse av (B)
Kras
G12D Hotell og (C)
Trp53
R172H
mutasjon i mus PC-cellelinjer. Blå skraverte områdene representerer kodon der mutasjonen er plassert. En gul rektangel indikerer nukleotid ansvarlig for mutasjonen. En bukspyttkjertel fra et Pdx1-Cre mus (mus tag FN-KPC-1207) ble brukt som en negativ kontroll for
Kras
mutasjon.
Vekstkinetikk disse tre muse PC cellelinjer ble sammenlignet med Panc02 celler (figur 2A). FN-KPC-961 celler proliferated den raskeste med en dobling tid (T
D) av 33 h (
p
0,0001 i forhold til Panc02). FN-KPC-960 og Panc02 vokste med lignende priser (T
D ≈ 60 h), mens FN-KC-6141 viste den tregeste vekstrate (T
D 70 h) (figur 2B).
(A) Celler ble podet i kvadruplikat-brønner på 96-brønners plater og deres vekst ble fulgt hver dag ved å måle absorbansen etter inkubasjon med WST-1 reagens. Data blir representert som den midlere absorbans (λ
Prøve = 450 nm, λ
Ref = 600 nm) av fire replikater ± standard feil. Statistikk ble beregnet i forhold til vekstkurve for Panc02 (*
p
0,01, **
p
0,001, ***
p
0,0001 ). (B) Dobling tid (T
D) av cellepopulasjon ble beregnet ved hjelp av ligningen T
D = (0.693t) /ln (N
t /N
0), der t = tidsforskjellen i h under log fase, N
t = absorbans verdi ved tidspunktet t, og N
0 = absorbans verdi ved første tiden.
KC og KPC-avledede cellelinjer har ductal- lignende egenskaper
PDACs antas å oppstå fra epitelceller i bukspyttkjertelen duct [7]. Eksokrin pankreas inneholder både acinar og ductal celler. Bukspyttkjertelen akinærceller er karakterisert ved amylase ekspresjon og mangel på ekspresjon av enten cytokeratin 19 (CK19) eller slimstoffer, og de ductal cellene er kjennetegnet ved ekspresjon av CK19 og slimstoffer, men ingen ekspresjon av amylase [15], [16]. Faktisk har tidligere studier rapportert pankreastumorer fra KC og KPC mus uttrykt CK19 og ofte, mucin, indikerer deres ductal arv [3], [4]. For å validere om våre KC og KPC avledet-cellelinjer hadde disse duktale egenskaper, undersøkte vi amylase og CK19 uttrykk ved real time PCR og konfokalmikroskopi. Panc02 celler ble inkludert i disse analysene for sammenligning, og normal pankreatisk vev ble anvendt for å beregne relativ genekspresjon. Real-time PCR eksperimenter viste høy uttrykk for CK19 ductal markør i våre tre nye PDAC cellelinjer (
p
0,005) sammenlignet med Panc02 (Fig. 3A). Til vår overraskelse, gjorde Panc02 celler ikke viser noen CK19 uttrykk, selv om det har blitt referert som en muse ductal PDAC cellelinje for nesten tre tiår [8]. Ingen av de fire cellelinjer viste amylase uttrykk, mens det normale bukspyttkjertel uttrykte dette acinar markør. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved konfokalmikroskopi analyse (Fig. 3B).
(A) Real-time PCR-analyse av
Amylase Hotell og
CK19
i mus PDAC celler. Disse mRNA-transkripter ble sammenlignet i forhold til mRNA-nivåer i normal pankreas. Dataene representerer gjennomsnittlig gangers økning av tre replikater ± standard feil. Statistikk ble beregnet i forhold til normal bukspyttkjertelen (*
p
0,005, **
p
0,0001). (B) Et protein ekspresjon av amylase og CK19 ble vurdert på mus PDAC cellelinjer ved konfokal analyse. Amylase ble visualisert etter farging med et sekundært antistoff konjugert til Alexa Fluor® 568 (Red lysrør) og CK19 ble visualisert etter farging med Alexa Fluor® 488 (grønt fluorescerende). Cellekjerner ble farget med DAPI.
KC og KPC cellelinjer har epitel-mesenchymale egenskaper
epitel-mesenchymale overgang induserer tap av celle adhesjon, noe som tilsvarer E-cadherin downregulation og økt ekspresjon av N-cadherin, som fører til initiering av PDAC metastase [17]. Vi undersøkte E-cadherin og N-cadherin uttrykk ved konfokalmikroskopi og western blot analyser i de tre nyetablerte KC og KPC cellelinjer. E-cadherin uttrykk ble observert i FN-KC-6141, UN-KPC-960, og FN-KPC-961 celler, en indikasjon på deres epitel natur (Fig. 4A-B). I motsetning Panc02 celler viste minimal E-cadherin uttrykk. Mønsteret av N-cadherin ekspresjon var lignende, blir mer fremtredende i KC og KPC-cellelinjer, sammenlignet med ekspresjon i Panc02 celler (Fig. 4C-D).
(A) Konfokalmikroskopi bilder av E -cadherin (Alexa Fluor® 568, Red lysrør) uttrykk i musecellelinjer. Cellekjerner ble farget med DAPI. (B) Western blot-analyse av E-cadherin i musecellelinjer. Protein lysates ble vedtatt med 10% SDS-PAGE. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. (C) Confocal microsocopy bilder av N-cadherin (Alexa Fluor® 488, grønt fluorescerende) uttrykk i musecellelinjer. Cellekjerner ble farget med DAPI. (D) Western blot-analyse av N-cadherin i musecellelinjer. Protein lysates ble vedtatt med 10% SDS-PAGE. β-actin ble brukt som lasting kontroll.
KC og KPC cellelinjene uttrykker høye nivåer av Muc1 og Muc4
Ulike typer slimstoffer er uttrykt i bukspyttkjertelen under PC progresjon [12 ], [18]. Videre PC-forstadier i genetisk modifiserte mus PDAC modeller som KC og KPC mus, er kjent for å fremstille muciner [3], [4]. Nylig har vi også vist at i bukspyttkjertelen av KC mus, uttrykk for Muc1, Muc4, og MUC5AC gradvis økt i sammenheng med PDAC utvikling [12]. Vi undersøkte hvorvidt ekspresjonen av disse slimstoffer kan bekreftes i KC og KPC-avledede cellelinjer. For dette formål ble real-time PCR, western blot, og konfokalmikroskopi analyser utført. Resultatene indikerte at relative transkripsjonsnivåer av transslimstoffer
Muc1 product: (
p
0,001) og
Muc4 product: (
p
0,05) var betydelig høyere i FN-KC-6141, UN-KPC-960 og FN-KPC-961 celler (fig. 5A) sammenlignet med kontrollceller (NIH3T3 fibroblaster). I Panc02 celler, de relative transkripsjonsnivåer av
Muc1
og
Muc4
ble forhøyet, men de var ikke statistisk signifikant. Ikke desto mindre, Panc02 celler og de to cellelinjer avledet fra KPC mus viste høyere Muc4 protein enn det KC-avledet cellelinje (Fig. 5B). På den annen side, Muc1 protein i Panc02 var lavere enn i de KC og KPC-avledede celler (fig. 5C). Til vår overraskelse, MUC5AC var ikke detekterbar i noen av cellelinjene, enten ved transkript eller proteinnivåer (data ikke vist), og dette kan være en konsekvens av evolusjonære endringer forbundet med cellekultur.
(A ) real time PCR-analyse av
Muc1 Hotell og
Muc4
i mus PDAC cellelinjer. De mRNA-transkripter ble normalisert til mRNA-nivåer i mus fibroblast cellelinje NIH3T3. Dataene representerer gjennomsnittlig gangers økning av tre replikater ± standard feil. Statistiske betydninger ble beregnet i forhold til NIH3T3 (*
p
0,05, **
p
0,001, **
* p
0,0001). (B) Western blot-analyse av Muc4 i musecellelinjer. Protein lysates for Muc4 analyse ble løst ved 2% SDS agarosegel. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting og det ble løst i 10% SDS-PAGE. (C) konfokalmikroskopi bilder av Muc1 (Alexa Fluor® 568, Red lysrør) uttrykk i musecellelinjer. Cellekjerner ble farget med DAPI.
KC og KPC cellelinjer er motstandsdyktig mot gemcitabin
Til tross for nylige rapporter om at PC-pasienter viser større overlevelse ved behandling med FOLFIRINOX (en kombinasjon av oksaliplatin, irinotecan, fluorouracil og leucovorin) i stedet for gemcitabin [19], er det sistnevnte fortsatt er den mest brukte stoffet i PC kjemoterapi [20]. Derfor bruker MTT analysen undersøkte vi gemcitabin cytotoksisitet på FN-KC-6141, UN-KPC-960, FN-KPC-961 og Panc02 celler (fig. 6A). Panc02 celler var de mest Gemcitabin-resistent med en halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC-50) av 15 uM etter 48 timer fra behandlingen (fig. 6B). IC-50-verdier for de KC og KPC cellelinjer som varierte fra 0,5 uM til 5 uM. Selv om Panc02 celler var mer resistente overfor gemcitabin, er disse IC-50-verdier er i tilsvarende utvalg av humane PC-celler [21], [22]. Interessant, gemcitabin ved høyere konsentrasjoner (30-100 uM) (fig. 6A), de FN-KPC-961-celler viste større Gemcitabin motstand enn de Panc02 cellene.
(A) Gemcitabin cytotoksisitet i mus PDAC cellelinjer ble bestemt ved MTT cytotoksisk analyse. Celler ble sådd ut i fire brønner og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av gemcitabin (100 nM-100 uM) i 48 timer. Etter utskifting media med MTT reagens og oppløse formazankrystaller med DMSO, cytotoksisitet ble beregnet basert på absorbansverdier (λ = 540 nm) i celler behandlet med kun medium. De presenterte data er gjennomsnitt av Cytotoksisiteten i kvadruplikat-brønner ± standard feil. Statistisk signifikans ble beregnet i forhold til Panc02 (*
p
0,01, **
p
0,001, ***
p
0,0001). (B) Den halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC-50) av gemcitabin i hver cellelinje ble bestemt etter interpolering i grafene til% Cytotoksisitet vs konsentrasjon.
Transplanterte KC og KPC cellelinjer indusere bukspyttkjertelen svulster hos mus
etableringen av KC og KPC cellelinjer i kultur gitt muligheten til å undersøke deres tumorigenicity i passende mus bakgrunn som de ble hentet. FNs-KC-6141 celler ble testet i C57BL /6 mus, mens FN-KPC-960 og FN-KPC-961 celler ble undersøkt hos mus med blandet B6.129 bakgrunn. En måned etter orthotopic implantasjon av FN-KC-6141 celler i C57BL /6 mus, svulster som dannes i bukspyttkjertelen (Fig. 7A), og metastatiske lesjoner i leveren, ble milt, tynntarm, mesenteriets lymfeknuter og peritoneal vegg observert. Tumor forekomst for FN-KC-6141 celler var 100%. De to KPC-avledet celler (UN-KPC-960 og FN-KPC-961) også dannet svulster etter orthotopic implantasjon (Fig. 7A), men de dukket opp ved lavere priser og svulstene tok over to måneder å vokse. Den forholdsvis langsomme tumorvekstkinetikken til de KPC celler kan ha blitt forårsaket av genetiske forskjeller mellom KC og KPC-celler, så vel som de forskjellige bakgrunn av deres respektive verts mus. Interessant, FN-KPC-961 celler syntes å være mer tumorigent (tumor forekomst 86%) enn de FN-KPC-960 celler (tumor forekomst 43%).
