Abstract
microRNAs (mirnas) er små, ikke-kodende RNA som regulerer genuttrykk ved målrettet undertrykkelse av transkripsjon og oversettelse. I denne studien viser vi at miRNA-23b (MIR-23b) fungerer som en tumor suppressor i blærekreft. Kvantitativ real-time PCR-analyse viste at MIR-23b er betydelig nedregulert i blærecancercellelinjer og tumorvev sammenlignet med ikke-maligne celler og prøver normale vev. Vi viser også at Mir-23b uttrykk har et potensial til å være diagnostisk og prognostisk biomarkør i blærekreft. Høy MIR-23b uttrykket er positivt korrelert med høyere total overlevelse av blærekreftpasienter som avslørt av Kaplan-Meier analyse. ROC-analyse viste at Mir-23b uttrykk kan skille mellom normale og blære kreft vev. Ytterligere belyst vi den biologiske betydningen av Mir-23b i blærekreft. Over-uttrykk for MIR-23b i blæren kreftceller hemmes celleproliferasjon og nedsatt kolonidannelse. Fluorescens aktivert celle sortering (FACS) analyse viste at gjen uttrykk for MIR-23b i blæren kreft celler indusert G0 /G1 cellesyklus og apoptose mens hemme celle migrasjon og invasjon. Luciferase reporter-analyser viste at Zeb1, en viktig regulator av epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), er et direkte mål for MIR-23b i blærekreft. Disse resultatene viser at tapet av MIR-23b overfører en proliferativ fordel og fremmer blærekreft cellemigrering og invasjon. Videre kan re-uttrykk for MIR-23b være en gunstig terapeutisk strategi for behandling av human blærekreft
Citation. Majid S, Dar AA, Saini S, Deng G, Chang jeg, Greene K, et al. (2013) mikroRNA-23b Fungerer som en tumor suppressor ved å regulere Zeb1 i blærekreft. PLoS ONE 8 (7): e67686. doi: 10,1371 /journal.pone.0067686
Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA
mottatt: 17 mars 2013; Godkjent: 20 mai 2013; Publisert: 02.07.2013
Copyright: © 2013 Majid et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Center for Forskning Resources av National Institutes of Health gjennom tilskuddsordninger tall RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, I01BX001123, VA Merit anmeldelse og VA Program prosjektet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den fjerde vanligste kreftformen i USA og en av de dyreste til klinisk administrere [1]. Mer enn 90% av urinblæren svulster består av overgangsordning celle carcinoma (TCC) som oppstår fra overgangs epitel [2]. Urinblæren svulster er klassifisert i to forskjellige kategorier: ikke-muskel og muskel invasiv blærekreft [3], [4]. De fleste svulster (75-80%) til stede som lav grad av papillær ikke-invasive svulster som sjelden utvikle seg til å bli dødelig, men nesten alltid går igjen. Denne typen kreft kalles «overfladisk» blærekreft og krever dyre langsiktig forvaltning. Resten er høy grad av muskel invasive svulster (~15%) som raskt kan utvikle seg til å bli metastatisk og føre til død [4]. Etiologiske faktorer involvert i blæren kreft være uidentifiserte, og effektive molekylære markører for sykdommen er begrenset.
microRNAs (mirnas) er små, ikke-kodende RNA som regulerer genuttrykk ved målrettet undertrykkelse av transkripsjon og oversettelse. Flere studier har gjort en global analyse av miRNA ekspresjon i humane cellelinjer og vev og funnet sykdomsspesifikke ekspresjonsmønstre [5], [6]. Det er også økende bevis for at miRNA uttrykk profiler kan være en indikasjon på sykdomsrisiko og byrde. Således mirnas blir vurdert som potensielle biomarkører for hjelp ved diagnose og prognose av forskjellige typer kreft [7], [8]. Flere menneskerettighets mirnas har vist seg å være dysregulerte i blærekreft, inkludert MIR-1280, MIR-203, MIR-125b og MIR-133a [9], [10], [11], [12] og bidra til utvikling og progresjon av sykdommen. Her rapporterer vi at Mir-23b er betydelig nedregulert i blære kreft vev og cellelinjer og at høyt uttrykk nivå av Mir-23b positivt korrelert med høyere total overlevelse av pasienter etter operasjonen. I tillegg undersøkte vi den funksjonelle betydningen av MIR-23b og identifisert Zeb1 som et direkte mål for Mir-23b i blærekreft. For første gang denne studien viser at Mir-23b er en potensiell biomarkør og tumor suppressor i blærekreft direkte rettet mot onkogen Zeb1.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cellekultur
SV-HH-1, T24 og J82-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i henhold til ATCC protokoller. Disse human-avledede cellelinjer ble bekreftet ved DNA korte tandem gjentagelse analyse ved ATCC. Forsøkene med cellelinjer ble utført innen 6 måneder etter deres innkjøp /lungeredning. SV-HH-1-celler ble dyrket i F-12K Medium (ATCC) med 10% FBS. T24-celler ble dyrket i McCoys 5A medium supplert med 10% FBS og J82-celler ble dyrket i minimalt essensielt medium (MEM) supplert med 10% FBS. Celler ble opprettholdt i en inkubator med en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C.
Plasmider, forløpere og Transfeksjon
TaqMan prober og forløpere for HSA -miR-23b og negativ kontroll pre-Mir ble kjøpt fra Applied Biosystems (Foster City, CA). pmir-GLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspresionsvektor ble kjøpt fra Promega. mikroRNA-23b, ble kontroll-mikroRNA og sirnas brukt på 50 nM konsentrasjon og Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ble brukt for alle trans.
RNA Utvinning
miRNA og total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer ved hjelp av en miRNeasy Mini Kit og en RNeasy Mini Kit (Qiagen). mirnas fra kliniske prøver ble hentet ved hjelp av laser capture mikrodisseksjon teknikker med en miRNeasy FFPE kit (Qiagen).
Menneskelige kliniske prøver
Kliniske prøver ble innhentet fra San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center . Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av UCSF komité for menneskeforskning (Godkjenningsnummer: H9058-35751-01).
Kvantitativ Real-time PCR
Moden mirnas ble analysert ved bruk av TaqMan mikroRNA Analyser i samsvar med produsentens instruksjoner (Applied Biosystems). Alle RT reaksjoner, inkludert ingen-mal kontroller og RT minus kontroller, ble kjørt i en 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). RNA-konsentrasjoner ble bestemt med en Nanodrop (Thermo Scientific, Rockford, IL). Prøvene ble normalisert til RNU48 (Applied Biosystems). Genuttrykk nivåer ble kvantifisert ved hjelp av 7500 Fast Real Time Sequence detection system programvare (Applied Biosystems). Sammen real-time PCR ble utført i tre eksemplarer, inkludert ingen-mal kontroller. Relativ ekspresjon ble beregnet ved hjelp av sammenlignende Ct.
celleviabilitet og Clonability Assays
Cellenes levedyktighet ble bestemt ved 24, 48 og 72 timer ved hjelp av CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit ( Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens protokoll. Absorbansen ble målt ved 490 nm ved hjelp Spectramax 190 (Molecular Devices). Data er presentert som middelverdi for triplikate eksperimenter sammenlignet med den negative kontroll. For kolonidannelse analysen ble cellene sådd ut ved lav tetthet (1000 celler /skål) og fikk vokse til synlige kolonier ble vist. Deretter ble cellene farget med Giemsa og kolonier ble talt opp.
Migrasjon og Invasion Analyser
Cytoselect 24-brønn celle migrasjon og invasjon analysesett (Cell Biolabs, Inc) ble brukt for migrasjon og invasjon analyser i henhold til produsentens protokoll. Kort sagt ble T24 og J82-celler transfektert med Pre-MIR miRNA forløper eller negativ kontroll høstet 72 timer etter transfeksjon og re-suspendert i serumfritt Opti-MEM. -Celler (10 x 10
4 pr 300 ul medium uten serum) ble tilsatt til det øvre kammer og det nedre kammer ble fylt med 500 ul medium inneholdende 10% FBS. Celler ble inkubert i 16 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Etter 16 timer ble ikke-overførte /ikke-invaderende celler fjernet fra oversiden av trans-brønn membran filterinnsatser med en bomullspinne. Migrerte /invaded celler på nedsiden var farget og absorbansen ble avlest ved 560 nm i henhold til produsentens protokoll.
Immunoblotting
Protein ble isolert fra sammenflytende (70-80%) plater av dyrkede celler ved hjelp av M-PER pattedyr Protein Extraction Reagent (Pierce Biotechnology, Rockfield, IL) etter produsentens anvisninger. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bradford-metoden. Like mengder protein ble løst på 4-20% natrium-dodecyl-sulfat (SDS) polyakrylamidgeler og overført til en nitrocellulosemembran ved spenningsgradienten overføring. De resulterende Blottene ble blokkert med 5% ikke-fet tørrmelk og probet med spesifikke antistoffer. Blottene ble deretter inkubert med passende konjugert sekundære antistoffer og visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
Nedbryting av Zeb1 bruke små interfererende RNA (siRNA)
T24 blærekreft cellene ble sådd ut i 24 timer før transfeksjon. Ved 40 til 50% konfluens, ble cellene transfektert ved å bruke lipofektamin-2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) med siRNA tomannsboliger spesifikt for humant Zeb1 (SR304746; Origene Technology, Rockville, MD), eller å styre ikke-stanse (NS) siRNA i 72 timer . Til å begynne med ble to forskjellige sett med siRNA duplekser testet for å evaluere målet spesifisitet og effektivitet knockdown. En siRNA duplex ble brukt for videre eksperimenter på 50 nM konsentrasjon.
luciferaserapportørplasmid analysen
En pmirGLO Dual-Luciferase miRNA mål ekspresjonsvektor ble brukt til 3′-UTR luciferasepreparater analyser (Promega, Madison , WI). Målet onkogen av miRNA-23b ble valgt på grunnlag av online mikroRNA Måldatabasen https://www.microrna.org/microrna/home.do. Primersekvensene for villtypen 3’UTR var: Spiss 5 «CGCGGCCGCTAGTATTATGTTTTTTAAAATGTGAGT 3» og bakover 5 «CTAGACTCACATTTTAAAAAACATAATACTAGCGGCCGCGAGCT 3». For mutant 3’UTR, primersekvensene var: Spiss 5 «CGCGGCCGCTAGTATCGTGCGCACTAAGGCTCACTT 3» og reversere 5 «CTAGAAGTGAGCCTTAGTGCGCACGATACTAGCGGCCGCGAGCT 3». For lucifease analysen, ble T24 og J82 celler transfektert med HSA-Mir-23b og pmirGLO Dual-Luciferase miRNA mål ekspresjonsvektorer med villtype eller mutant målsekvens hjelp Lipofectamine 2000. Firefly luciferase aktiviteter ble målt ved hjelp av Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI) 18 timer etter transfeksjon, og resultatene ble normalisert med Renilla luciferase. Hver reporter plasmid ble transfektert minst tre ganger (på forskjellige dager), og hver prøve ble analysert i triplikat.
Statistical Analysis
Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism 5 og MedCalc versjon 10.3.2 . Alle kvantifiserte data representerer et gjennomsnitt på minst triplikate prøver eller som angitt. Feilstolpene representerer standardavviket av gjennomsnittet. Alle testene ble utført to tailed og
p-
verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Receiver Operating kurver (ROC) ble beregnet til å avgjøre potensialet i MIR-23b for å diskriminere mellom maligne og ikke-maligne prøver. For overlevelsesanalyse, Kaplan-Meier (log-rank test) analyse ble utført.
Resultater
Mir-23b Expression er oppbrukt i blæren svulster og kreft cellelinjer
Preliminary mikroRNA mikroarray data viste at MIR-23b var sterkt nedregulert i blærecancercellelinjer, sammenlignet med den ikke-maligne SV-HUC1 cellelinje. Vi validert microarray data ved miRNA-kvantitativ RT-PCR (MIR QRT-PCR) analyser og resultater bekreftet at Mir-23b ble nedregulert i blærekreft cellelinjer J82, T24 sammenlignet med ikke-ondartet cellelinje SV-HUC1 (figur 1A) . For å undersøke den biologiske relevansen av MIR-23b, var dens uttrykk analysert i laser fanget microdissected (LCM) human blære tumorvev og sammenlignet med normale matchet kontroll vev. Ekspresjonen av MIR-23b ble funnet å være signifikant nedregulert i alle tumorprøver, sammenlignet med deres matchede normale prøver (figur 1A). Videre er ekspresjon av MIR-23b i normalt vev korrelert med den for den ikke-ondartet cellelinje og som av tumor korrelert med kreftcellelinjer (figur 1A) som indikerer at disse kreftcellelinjer representerer et modellsystem for å analysere MIR-23b funksjon i blærekreft. Resultatene tyder også på en antatt tumor suppressor rolle for Mir-23b i blærekreft.
A) Kvantitativ RT-PCR analyse av Mir-23b i cellelinjer og i matchet laser fanget microdissected vevsprøver. B) Spredning av J82 og T24 celler etter Mir-23b transfeksjon ble betydelig redusert i forhold til forts-MIR. C) MIR-23b over-uttrykk hemmer betydelig kolonidannende evne blæren kreftceller.
mikroRNA-23b Regulerer blærekreft celleproliferasjon og Colony Forming
For å bestemme den funksjonelle betydningen av MIR-23b løpet uttrykk i blærekreft, transfektert vi blære kreft cellelinjer J82 og T24 med Mir-23b forløpere. Ektopisk uttrykk for Mir-23b betydelig redusert celledeling i forhold til celler som uttrykker forts-MIR (figur 1B). MIR-23b transfekterte celler hadde lav kolonidannelse egenskaper som antall foki i MIR-23b uttrykkende celler ble redusert sammenlignet med cont-MIR transfekterte celler (figur 1C). Disse resultatene indikerer anti-proliferativ effekt av Mir-23b i blærekreft.
Mir-23b Triggere cellesyklus arrest og induserer apoptose i blærekreft Cells
FACS (fluorescens aktivert cellesortering) analyse avslørt at re-ekspresjon av MIR-23b førte til en betydelig økning i antall celler i G0 /G1-fasen av cellesyklusen (59% til 67%), mens S-fasen populasjonen ble redusert fra 18% til 9% i J82 celler (Figur 2A). Lignende resultater ble observert i T24-celler med en økning i G0 /G1 cellepopulasjon (70% til 84%) og en reduksjon i S-fase populasjonen (15% til 5%) (figur 2B). Dermed tyder på at Mir-23b utløser G0 /G1 arrest i Mir-23b transfektert celler i forhold til forts-MIR. FACS-analyse for apoptose ble utført ved anvendelse av Annexin-V-FITC-7-AAD fargestoff. Prosentandel av apoptotiske celler (tidlig apoptotiske + apoptotisk) betydelig høyere (4% til 19%) som reaksjon på MIR-23b over-ekspresjon sammenlignet med forts-MIR med et tilsvarende 14% reduksjon i levedyktige cellepopulasjonen i J82-celler (Figur 2C). I T24 celler, ble en økning (4% til 9%) i apoptotiske celler observert med Mir-23b over-uttrykk i forhold til forts-MIR (figur 2D). Disse resultatene indikerer en tumor suppressor rolle for Mir-23b i blærekreft.
A-B) Representative bilder av FACS analyse viser Mir-23b over-uttrykk induserer G0 /G1 cellesyklus arrest i J82 og T24 celler med en tilsvarende reduksjon i S-faseceller. C-D) MIR-23b over-ekspresjon induserer apoptose i J82 og T24-celler med en samtidig reduksjon i levedyktige antall celler. Data vises fra tredoble eksperimenter ± SD.
Mir-23b Undertrykker blærekreft Cell migrasjon og invasjon
Over-uttrykk for MIR-23b hadde anti-trekkende og anti-invasive effekter på blære kreft cellelinjer. Mindre absorbans ble observert ved 560 nm med Mir-23b transfekterte blære kreftceller sammenlignet med forts-Mir i migrasjon analysen (figur 3A) og Mir-23b over-uttrykk også betydelig redusert invasivitet av blærekreftceller (Figur 3B).
A) Migrasjons analyser av J82 og T24 celler transfektert med Mir-23b. B) Representative bilder av migrasjon analysen. C) Invasion analyser viser en betydelig reduksjon i antallet av invaderende J82 og T24-celler transfektert med MIR-23b. D) Representative bilder av invasjonen analysen.
Oncogene Zeb1 er et direkte mål fra Mir-23b
Zeb1 har blitt rapportert å være en viktig molekyl som driver blærekreft cellemotilitet. Ved hjelp av en online mikroRNA Måldatabasen vi fant onkogen Zeb1 å være et potensielt mål fra Mir-23b med en utfyllende 3’UTR bindingssete for frøet sekvens av MIR-23b (figur 4A). Vi utførte Western analyse med Mir-23b transfekterte celler og funnet ut at Mir-23b svekket uttrykk for Zeb1 protein sammenlignet forts-Mir i både J82 og T24 blære kreft celler (figur 4B). For å sjekke om en direkte interaksjon er involvert mellom Mir-23b og målet onkogen Zeb1, utførte vi luciferaserapportørplasmid analyser. Vi har funnet at ko-transfeksjon av MIR-23b sammen med villtype 3’UTR av Zeb1 forårsaket en signifikant nedgang i luciferase-aktivitet sammenlignet med kontroller (figur 4C). Disse resultatene tyder på at Mir-23b rettet onkogen Zeb1 direkte.
A) gratis Mir-23b bindende sekvenser i Zeb1 3’UTR. B) Western blot analyse viser at Mir-23b undertrykker oversettelse av Zeb1 protein i J82 og T24 blære kreftceller. C) luciferase analyser som viser redusert reporter aktivitet etter co-transfeksjon av enten villtype eller mutant Zeb1-3’UTR med Mir-23b i J82 og T24 celler. Mut- mutert Zeb1 3’UTR sekvens.
Nedbryting av Zeb1 av RNA interferens ligner Mir-23b Tilberedning i blærekreft
Phenocopy forsøk ble også utført av siRNA hemming av Zeb1 (figur 5). Vi har validert to sett av siRNA (Si-1 og Si-2) som resulterte i betydelig knockdown av Zeb1 på proteinnivå (figur 5A) i T24 blærekreftceller og anvendt en siRNA dupleks for videre eksperimenter ved 50 nM konsentrasjon. Våre resultater viste at siRNA inhibering av Zeb1 forårsaket redusert cellelevedyktighet (figur 5B), vandrende og invasive evne (Figur 5C-D) av T24 kreftceller. Vi observerte også at siRNA hemming av Zeb1 økte med ca. 7% av den apoptotiske fraksjonen av celler i Zeb1 siRNA transfekterte celler sammenlignet med mindre enn 1% i ikke-spesifikt kontroll (figur 5E). Disse resultatene tyder på at siRNA utarming av Zeb1 etterligner effekten av MIR-23b over-uttrykk i blærekreft.
A) Zeb1 protein nivåer ble betydelig svekket med 50 nM siRNA tomannsboliger (SI) sammenlignet med en ikke-lyddemping siRNA duplex (Con) i T24 celler. B) Virkning på celle-proliferasjon. C-D) Effekt på migrasjon og invasjon av T24 blæren kreftceller. E) Apoptose analyse som viser induksjon av apoptose etter Zeb1 knockdown etter siRNA i T24-celler. * P. 0,05
diagnose- og prognose Betydningen av Mir-23b i blærekreft
For å finne ut om Mir-23b uttrykk kan diskriminere mellom blæren svulster og normalt vev, og forutsi pasientens overlevelse, utførte vi ROC analyse og Kaplan-Meier analyse. De kliniske demografi pasientens kohort er oppsummert i figur 6A. Arealet under ROC-kurven (AUC) på 0,885 (P 0,0001; 95% CI = 0,75 til 0,97) (figur 6B) antydet at MIR-23b ekspresjon kan diskriminere mellom maligne og ikke-maligne vev og potensielt bli anvendt som en diagnostisk markør for blærekreft. For å avgjøre om Mir-23b har noen prognostisk betydning, fordelt vi pasientens vev inn i lav (uttrykk T /N 1,2 ganger) og høy (uttrykk T /N 1,2 ganger) Mir-23b grupper og utført Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Kaplan-Meier analyse viste at høy Mir-23b gruppen hadde signifikant høyere total overlevelse sannsynlighet i forhold til den lave Mir-23b gruppe (Logrank Test p 0,03, Hazard Ratio (HR) = 4,3, 95% KI = 2-14) ( Figur 6C). Disse funnene tyder på at Mir-23b er potensielt en diagnostisk og prognostisk markør for blærekreft om studier på ekstra prøver for å styrke disse resultatene.
A) Clinicopathological karakteristikk av pasient kohort. B) ROC kurven analyse som viser evne til Mir-23b uttrykk for å diskriminere mellom maligne og ikke-maligne vevsprøver. C) Kaplan-Meier analyse for total overlevelse basert på Mir-23b uttrykk.
Diskusjoner
microRNAs kan ha store effekter ved å regulere uttrykk for en rekke gener under pattedyr utvikling og kreftutvikling. Som et resultat, har forstå mekanismene og funksjon av de enkelte mirnas vakt stor interesse. Til tross for å akkumulere bevis om rollen til ulike miRNAs i kreft, er svært begrenset informasjon om funksjonen av miRNAs i blærekreft, og bare noen få miRNA mål har blitt identifisert.
Her er vi rapportere at Mir-23b til bli nedregulert i blærecancer vev sammenlignet med normale tilstøtende vev, og dette ble også observert i blærekreft og ikke-maligne cellelinjer. Våre data tyder på en mulig diagnostisk /prognostisk rolle for Mir-23b i å forutsi total overlevelse og diskriminerende ondartet fra normalt vev og indikerer at Mir-23b er en tumor suppressor i blærekreft.
For å finne den biologiske relevansen av MIR -23b i blærekreft, utførte vi funksjonelle analyser. Ektopisk uttrykk for Mir-23b resulterte i betydelig hemming av celleproliferasjon, kolonidannelse, migrasjon /invasjon og induksjon av cellesyklus og apoptose i blæren kreftceller. Ekspresjon av MIR-23b i kreft er noe kontroversiell fordi det er blitt funnet å være enten oppregulert og onkogent i nyrekreft hvor det forårsaket translasjonell undertrykkelse av tumor suppressor PTEN-genet [13] eller nedregulert og en tumor suppressor i prostata cancer hvor det direkte rettet mot Src kinase og Akt onkogener [14], mens vår studie indikerer at det er en tumor suppressor i blærekreft. Tidligere studier har vist at microRNAs er svært spesifikke vev, og de kan fungere som tumor suppressor eller onkogener [15], [16]. MicroRNAs har flere funksjoner som gjør dem attraktive kandidater som nye prognostiske biomarkører og kraftige verktøy for tidlig diagnose av kreft [17]. I denne studien fant vi at Mir-23b var prediktiv av total overlevelse slik at pasienter med høyere Mir-23b uttrykk hatt lengre total overlevelse sammenlignet med pasienter med lav Mir-23b uttrykk. MikroRNA-23b uttrykk var også i stand til å skille ondartet fra normalt vev som indikerer den diagnostiske betydning av Mir-23b i blærekreft selv flere studier med et større kohort av vevsprøver er nødvendig.
En vesentlig hindring for å forstå miRNA funksjon har vært den relative mangelen på eksperimentelt validerte mål. For å bestemme effektorer fra Mir-23b, in-silico algoritmer og funksjonelle analyser identifisert Zeb1 som sitt mål. Vi viste at Mir-23b rettet direkte 3’UTR av Zeb1, som sin overuttrykk var forbundet med undertrykkelse av luciferase aktivitet. I tillegg ble en betydelig nedregulering i nivået av Zeb1 protein observert etter Mir-23b over-uttrykk, noe som indikerer post-transcriptional regulering av Zeb1 via målrette sin 3’UTR. Funksjonelle analyser utført etter Zeb1 utarming av siRNA transfeksjon lignet resultatene oppnådd med Mir-23b overekspresjon. Disse resultatene tyder på at effekten av Mir-23b i blærekreft er dels direkte rettet mot Zeb1, men andre mål kan også være involvert siden microRNAs kan målrette tusenvis av gener. Zeb1 er en av de viktige regulatorer av epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) [18], og har vist seg å spille en viktig rolle i invasjon og metastasering av epiteltumorer [19]. Relevansen av ZEB proteiner til tumorprogresjon er undersøkt i flere kreft hos mennesker. Ekspresjon av ZEB1 korrelert med en aggressiv fenotype i ulike histologiske typer av endometriet og ble detektert i sarcomatous rommet for endometrial carcinosarcoma [20]. I tykktarmskreft, ble ZEB1 uttrykt ved invasiv forsiden av tumorer, i forbindelse med forbigående tap av basalmembraner [21]. Gjensidig uttrykk for ZEB1 og E-cadherin har også blitt observert i ikke-småcellet lungekreft [22]. En direkte sammenheng mellom ZEB1 immunoreaktivitets og Gleason grad har blitt rapportert i menneskelige prostatakreft [23] og i blærekreft, har ZEB1 blitt rapportert å være over-uttrykk og ansvarlig for økt bevegelighet [18]. I denne studien fant vi at overuttrykk av MIR-23b resulterte i undertrykkelse av onkogen Zeb1 i blæren kreftceller som tyder på at Mir-23b kan megle EMT, og dermed representerer en mulig mekanisme som det påvirker blærekreft migrasjon og invasjon.
i konklusjonen, viser denne studien at Mir-23b har diagnostisk /prognostisk betydning og mål onkogene Zeb1 i blærekreft direkte. MIR-23b over-uttrykk resulterte i undertrykkelse av blærekreft celleproliferasjon og invasjon, indusere apoptose, og cellesyklus arrest. Til slutt denne studien indikerer at Mir-23b over-uttrykk kan være en terapeutisk nyttig strategi for behandling av blærekreft.
Takk
Vi takker Dr. Roger Erickson for hans støtte og hjelp med utarbeidelsen av manuskriptet.
