Abstract
β-lapachone (β-runde), en NAD (P) H: kinonoksidoreduktase 1 (NQO1) rettet mot antitumor narkotika kandidat i fase II kliniske studier, er metabolsk elimineres via NQO1 mediert kinon reduksjon og påfølgende UDP-glukuronosyltransferaser (UGTs) katalysert glukuronidering. Denne studien har til hensikt å utforske den indre koblingen mellom mobil glukuronidering og farmakokinetikk av β-runde og dens apoptotisk effekt i menneskelige tykktarmskreftceller. HT29 celler S9-fraksjoner viste høy glukuronidering aktivitet mot β-runde, som kan bli hemmet av UGT1A9 kompetitiv hemmer propofol. UGT1A siRNA behandlet HT29 celler S9-fraksjoner viste en tilsynelatende lav glukuronidering aktivitet. Intracellulær akkumulering av β-lap i HCT116-celler var mye høyere enn det som i HT29-celler, korrelert med fravær av UGT1A i HCT116-celler. Den cytotoksiske og apoptotiske virkning av β-lap i HT29-celler var mye lavere enn den i HCT116-celler; Videre β-runde utløst aktivering av SIRT1-FOXO1 apoptotiske reaksjonsvei ble observert i HCT116-celler, men ikke i HT29-celler. Forbehandling av HT29-celler med UGT1A siRNA eller propofol redusert betraktelig β-lap er cytotoksiske og apoptotiske effekter, på grunn av undertrykkelse av glukuronidering og den resulterende intracellulær akkumulering. I konklusjonen, er UGT1A en viktig determinant, via bytte NQO1-utløst redoks sykle til metabolsk eliminasjon, i intracellulær akkumulering av β-runde og deretter sin cytotoksisitet i humane tykktarmskreftceller. Sammen med våre tidligere arbeider, foreslår vi at UGTs bestemt cellulære farmakokinetikk er en viktig determinant i apoptotiske effektene av NQO1 målretting underlag fungerer som cellegifter
Citation. Liu H, Li Q, Cheng X, Wang H, Wang G, Hao H (2015) UDP-Glucuronosyltransferase 1A determinates intracellulær akkumulering og Anti-kreft effekt av β-Lapachone i Human Colon kreftceller. PLoS ONE 10 (2): e0117051. doi: 10,1371 /journal.pone.0117051
Academic Editor: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, USA
mottatt: 28 september 2014; Godkjent: 16 desember 2014; Publisert: 18 februar 2015
Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av Nos 81430091, 81325025 og 81273586, https://www.nsfc.gov.cn/nsfc/cen/xxgk/slzz .html, National Natural Science Foundation of China (HH). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
UDP-glukuronosyltransferaser (UGTs) er viktig fase II metaboliserende enzymer som katalyserer glukuronidering av mange endogene forbindelser som bilirubin, gallesyrer, skjoldbruskkjertel hormon, og steroidhormoner samt betydelige eksogene underlag, inkludert terapeutiske legemidler, kreftfremkallende, og miljøgifter. UGTs vurderes som en viktig avgiftning system for sin evne til å fremme metabolsk eliminering og dermed de biologiske efficacies av substratene [1-3]. Videre er polymorfismer i gener UGT tett forbundet med risiko og forekomsten av ulike typer sykdommer [4]. Selv om rollen av UGTs i kjemoterapeutisk motstand har vært vanlig erkjent, forblir direkte kobling mellom den intracellulære akkumulering av legemidlet med kjemoterapeutisk effekt skal etableres [5,6]. Mer nylig, har vi gjort det klart at en NQO1 substrat, Tanshinone IIA, presenterer en to-elektron-reduksjonen av NQO1 å produsere en meget reaktiv katekol metabolitt som raskt kan glukuronideres med UGTs nærvær. Men hvis UGTs er fraværende eller deres glukuronideringsprosessen aktiviteter er sperret, kan det meget ustabilt katekol mellomliggende vende tilbake til Tanshinone IIA automatisk, og dermed danner et redoks-syklus av kinon reduksjon og auto-oksydasjon, hvor en stor mengde av reaksjonsoksygenarter (ROS ) blir produsert [7]. Disse resultatene antydet at UGTs kan handle i bytte NQO1 utløst apoptotiske effekter metabolsk eliminasjon i kreftceller, og dermed kan være involvert i den iboende chemoresistance av NQO1 rettet mot anti-kreft agenter. For ytterligere å validere dette viktig begrep, utvidet vi vår studie til en annen NQO1 målsøkende middel
β-lapachone (β-runde,. 3,4-dihydro-2,2-dimetyl-2H-naftol [1,2 -b] pyran-5,6-dion) er et naturlig forekommende naftokinon fra Lapacho treet (Tabebuia avellanedae), kjent for å ha forskjellige farmakologiske aktiviteter, inkludert antivirale, antiprotozoal og kreft effekter [8-11]. Det har blitt demonstrert at β-lap oppviser sterk cytotoksisitet mot en rekke dyr og humane kreftcellelinjer [12-14], og kan synergistisk drepe kreftceller i kombinasjon med paklitaxel (Taxol), ioniserende stråling og varmesjokk [15-17 ]. Tallrike hypoteser av mekanismen av β-lap-indusert celledød ble foreslått og markedsført mengder bevis β-runde som en lovende kandidat for kreftterapi [10,18-21].
Siden β-lap er også hovedsakelig elimineres via NAD (P) H: quinon oksidoreduktase 1 (NQO1) og påfølgende UGT katalysert metabolisme [7,22], antok vi at ekspresjon og aktivitet av UGTs i kreftceller kan også være en viktig bestemmende faktor i anti-kreft-effekten av β-runde, lik den som er observert fra vår tidligere studie av Tanshinone IIA. I lys som β-lapachone er for tiden på kliniske fase II-studier, er validering av om UGTs mediert cellulær metabolisme kan indusere iboende motstand svært viktig for den videre utvikling og dens fremtid klinisk bruk som kjemoterapi narkotika. β-lap-indusert celledød ble karakterisert ved dramatisk ROS dannelse, cellesyklusarrest i G
0 /G
1, omfattende DNA-skade, uttømming av NAD
+ /ATP-nivåer, hyperaktive av poly (ADP -ribose) polymerase-1 (PARP-1), og proteolytisk spalting av PARP-1 [10]. Denne studien fokuserer på å belyse hvilken rolle UGTs i å bestemme intracellulær akkumulering, ROS formasjon, apoptotisk effekt og SIRT1-FOXO1 vei aktivering av β-runde i humane tykktarmskreftceller.
Eksperimentell del
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og transfections
Menneskelig tykktarm kreft cellelinjer HT29 og HCT116 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). Celler ble dyrket i McCoys 5a med 10% FBS, 100 U /ml penicillin, og 100 mg /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2.
celler ble transfektert med UGT1A siRNA eller negativ kontroll siRNA (Invitrogen) ved hjelp lipofektamin RNAiMAX transfeksjon reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens revers transkripsjon protokollen.
Kjemikalier og reagenser
β-lapachone ble hentet fra Sørøst Pharmaceuticals, Inc . (Jiangsu, Kina). Propofol, N-acetylcystein (NAC), dikumarol (DIC), 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), glukose-6-fosfat, glukose-6-fosfat-dehydrogenase, β-nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADP), uridin-5′-difosfat-glukuronsyre (UDPGA), D-sukkersyre 1,4-lakton, β-D-glukuronidase og chlorzoxazone, ble alle innkjøpt fra Sigma Aldrich. Diazepam er innhentet fra Statens institutt for kontroll av farmasøytiske og biologiske produkter (Beijing, Kina).
Kvantitativ RT-PCR-analyse
Totalt mRNA ble isolert ved hjelp TRIzol (Invitrogen) og revers transkribert til cDNA i henhold til produsentens protokoll (Takara). QRT-PCR ble utført med SYBR Premiks ExTaq II (Takara) i et reaksjonsvolum på 10 ul. PCR-betingelsene var 95 ° C i 1 minutt, 40 sykluser med 95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder. β-aktin-genet ble anvendt som en endogen kontroll.
Western Blot Assay
For Western blotting, ble cellene ekstrahert i lyseringsbuffer, løst ved hjelp av SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Proteiner ble påvist ved hjelp av spesifikke primære antistoffer rettet mot UGT1A (H-300, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), SIRT1 (H-300, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), Ac-FOXO1 (D-19 , 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), FOXO1 (C29H4, 1: 1000, Cell Signaling, USA), TRAIL (C92B9, 1: 1000, Cell Signal Technology, USA), Bim (C34C5, 1: 1000, Cell signal Technology, USA), Fasl (1: 200, BD Pharmingen, USA) eller BCL-6 (N-3, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA). Protein ekspresjonsnivåer ble normalisert til GAPDH (1: 5000, Shengxing, Kina). Etter vasking med TBST, ble membranen inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff (1: 10000, KeyGen, Kina) i 1 time. Signalet ble oppdaget av forbedret cheniluminescence (ECL, Millipore).
Glukuronidering analyse av β-runde i S9-fraksjoner
Den enzymkinetikk analysen for β-runde (0,0625 til 3 mm) glukuronidering var utført i HT29 S9 (0,005 mg). HT29-celler ble høstet, resuspendert med fosfatbufret saltoppløsning, sonikert og deretter sentrifugert ved 9000 g i 20 min. Supernatanten ble samlet opp som fraksjoner S9. For propofol inhibering studium, propofol (0-400 pM) ble ko-inkubert med β-lap (0,5 pM) ved 37 ° C i 10 min. Enzymkinetisk analyse ble utført som beskrevet ovenfor med fremgangsmåten basert på vår tidligere rapport [22].
intracellulær akkumulering og Glukuronidering av β-lap i levedyktige celler
Celler med 80% konfluens var utsatt for 5 uM β-runde for 10, 20, 30, 60, 90, 120 min. Både celler og kulturmedium var samlet på angitt tid. Celler ble høstet og vasket tre ganger med iskald fysiologisk saltvann. 300 ul av ultrarent vann ble tilsatt til hver brønn og frysing /tining tre ganger. Hver prøve ble tilsatt tre ganger med iskald acetonitril, vortex-blandet i 5 minutter og sentrifugert ved 18 000 rpm i 10 min. Supernatanten ble innhentet og analysert ved LC-MS metode basert på vår forrige rapport [22].
ROS-analysen og GSSG-GSH Ratio Assay
Celler ble inkubert med 10 mm /L DCFH- DA i laste medium ved 37 ° C i 30 min. Etter DCFH-DA ble fjernet, ble cellene samlet og 500 ul lyseringsbuffer (0,1 N NaOH i 50% MeOH) ble tilsatt. Rotere ved 6000 opm i 1 min. Overfør 200 ul av cellelysatet for å måle fluorescensintensiteten ved hjelp av fluorescens plateleser. Eksitasjon filteret ble satt til 488 nm og emisjonsfilteret var 525 nm. Total glutation og GSSG ble målt i henhold til GSH og GSSG Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Kina). De absorbans endringer på 412 nm ble påvist med spektrofotometer. Mengden av GSSG og GSH ble innhentet separat i henhold til standardkurve og deres forhold ble deretter beregnet.
Cvtotoksisitetsmålinq
Celler med 80% samløpet ble utsatt til 0 um, 1,25 um, 2,5 um , 5 pM, 10 pM eller 20 pM av β-runde. Etter å ha dyrket i 24 timer, ble 20 ul av MTT tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer ved 37 ° C. MTT-løsning ble fjernet og 150 ul DMSO ble deretter tilsatt for å oppløse MTT krystaller. Absorbans ved 570 nm ble oppnådd med spektrofotometer etter agitere plater for 10 min på en shaker.
apoptose analysen
Celler med 80% samløpet ble utsatt for fem mikrometer av β-runde i 24 timer og vasket med iskald PBS. Apoptose ble kvantifisert ved hjelp av APO-BrdU Kit (BD Biosciences, USA). Cellene ble farget i henhold til produsentens anvisninger. Merkede celler ble analysert ved flowcytometri FACS Calibur (BD Biosciences, USA).
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. T-test eller Mann-Whitney U-tester ble utført ved anvendelse av Prism software. Statistiske har betydning i t-test er plottet som følgende: * P 0,05, ** P 0,01 og *** P 0,001
Resultater
UGT1A Bestemmer β-runde Glukuronidering i HT29. celle~~POS=TRUNC S9 Fraksjoner
Ifølge vår tidligere studie [22], kinon reduksjon og påfølgende monoglucuronidation å produsere et par regioisomerer (M1 og M2) er den dominerende metabolismen av β-runde. Videre UGT1A9 og UGT2B7 er de dominerende isoenzymer ansvarlige for β-runde glukuronidering [22]. Vi dermed først evaluert UGTs uttrykk nivåer i både HT29 og HCT116 cellelinjer. Real-Time PCR-analyser viste at flere UGT1A gener (UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7 og UGT1A9) er positivt uttrykt i HT29 celler, men ikke i HCT116 cellene, i samsvar med tidligere rapporter [7]. Imidlertid UGT2B7, som er dominant ansvarlig for dannelsen av β-lap glukuronidering metabolitt M1 [22], var ikke påvises i begge HT29 og HCT116-celler. Et høyt nivå av ekspresjon UGT1A i HT29-celler og fravær av UGT1A i HCT116-celler ble støttet av western blot-analyse. UGT1A siRNA kraftig reduserte mRNA-nivåene av multiple UGT1A og den totale UGT1A proteinekspresjon i HT29-celler.
I samsvar med den UGTs ekspresjonsprofilen, M2 ble detektert i HT29-celle S9-fraksjoner mens M1 var umulig å oppdage, noe som kan forklares med fravær av UGT2B7 i kolon kreftceller. Enzymkinetisk undersøkelse viser at β-lap glukuronidering oppviste en typisk Michaelis-Menten-kinetikk i S9-fraksjoner fremstilt fra HT29-celler (Fig. 1A). UGT1A lyddemping førte til p-runde glukuronidering hemming manifestert med en betydelig reduksjon av maksimal hastighet (V
max) og intrinsic clearance (CL
int, V
max /K
m) verdier, men liten innflytelse i den tilsynelatende K
m verdier for produksjon av M2 (fig. 1B, tabell 1). Som et spesifikt substrat UGT1A9 [23], propofol viste doseavhengig inhibering av produksjon av M2 i HT29-celler (fig. 1C).
HT29-celler ble inkubert med S9 β-lap i henhold til detaljene i fremgangsmåter . (A) En typisk Michaelis-Menten-kinetikken for β-lap glukuronidering i HT29-celler S9-fraksjoner; (B) UGT1A siRNA behandlet HT29 celler S9-fraksjoner avtar betydelig β-runde glukuronidering; (C) Hemmende potens av propofol på β-runde glukuronidering i HT29 celle S9-fraksjoner. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± 3 SEM av tre uavhengige forsøk (*** P 0,001, UGT1A siRNA behandling vs. negative kontrollceller)
UGT1A Kompromisser β-runde Opphopning i Colon. kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP
En cellulær farmakokinetisk studie ble utført for å teste om UGT1A kan påvirke β-runde opphopning i levende celler. Den dynamiske intracellulære nivået av β-runde og metabolitten M2 i HT29 og HCT116-celler ble undersøkt på ulike tidspunkt av β-runde eksponering. Av interesse, β-runde fått et meget høyt nivå på 20 min og deretter reduseres langsomt i HCT116-celler. I motsetning til dette, eliminering av β-lap i HT29-celler var mye raskere (fig. 2A). Både arealet under kurven fra 0 til 120 min (AUC
0-120 min) og maksimal plasmakonsentrasjon (C
max) av β-lap i HT29 var betydelig lavere enn i HCT116-celler (tabell 2). Forbehandling med propofol eller UGT1A siRNA i HT29 celler førte til et betydelig høyere nivå av β-runde, dokumentert av både AUC
0-120 min og C
max verdier (Fig. 2B, Tabell 2, Tabell 3). Konsekvent, M2 var påvises i HT29 helt siden β-runde behandling, noe som indikerer en rask glukuronidering av β-runde. Intracellulær M2 nivå nådde en topp på 20 min og deretter droppet (fig. 2C), mens M2 nivå i kulturmedium økes kontinuerlig over hele varigheten (fig. 2D). Forbehandling med enten propofol eller UGT1A siRNA transfeksjon redusert M2 dannelse i HT29-celler, så vel som i kulturmediet (Fig. 2C og 2D, tabell 2, tabell 3).
HT29-celler ble forbehandlet med propofol (100 pM ) i 1 time eller UGT1A siRNA i 24 timer. Celler ble utsatt for p-lap (5 uM) for angitte tid. (A) Intracellulær β-runde nivå i HCT116 er mye høyere enn i HT29-celler; (B) Propofol eller siRNA forbehandling fører til intracellulær akkumulering av β-runde i HT29 celler; (C) Propofol eller siRNA forbehandling minsker intracellulært M2 nivå i HT29-celler; (D) Propofol eller siRNA forbehandling avtar M2 nivå i HT29-cellekulturmedium. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM 3 av minst tre uavhengige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, propofol eller UGT1A siRNA forbehandling lignet med kontrollceller).
UGT1A Eliminerer β-lap-indusert ROS Formation
Basert på vår tidligere arbeid, gjennomgår β-runde NQO1 mediert to-elektron reduksjon, danner en svært ustabil katekol mellom som kan oppleve glukuronidering med tilstedeværelse av UGTs eller vende tilbake til p-runde i fravær av UGTs [22]. I den sistnevnte prosess, ble overflod av ros produsert som deretter initierer celle apoptose [24]. For ytterligere å bekrefte forholdet mellom β-runde er glukuronidering og de påfølgende konsekvensene, undersøkte vi ROS dannelse av DCF farging analyse i HT29 og HCT116-celler behandlet med β-runde. β-lap induserte signifikant ROS-dannelse i HCT116-celler, som kan være stor grad bekjempes ved ROS eliminator N-acetyl-L-cystein (NAC), eller katalase, men ikke av UGT1A9 inhibitor propofol (fig. 3A). Imidlertid β-lap indusert ROS-dannelse i HT29-celler ble bare observert når de ble behandlet med propofol, som også ble redusert med NAC eller katalase (Fig. 3B). I tillegg UGT1A siRNA transfeksjon også betydelig forbedret ROS-nivåer i HT29-celler (Fig. 3C).
Celler ble forbehandlet med UGT1A siRNA eller kryptert siRNA (negativ kontroll) i 24 timer, eller forbehandlet med propofol (100 pM ) /NAC (5 uM) /katalase (4000 U) i 1 time. Deretter ble cellene eksponert for p-lap (5 uM) i 2 timer og ROS-assay eller GSSG /GSH-forholdet Analysen ble utført. (A) ROS-dannelse og GSSG /GSH-forholdet i HCT116-celler forbehandlet med propofol /NAC /katalase; (B) ROS dannelse og GSSG /GSH forholdet i HT29 celler forbehandlet med propofol /NAC /katalase; (C) ROS-dannelse og GSSG /GSH-forhold på HT29-celler forbehandlet med siRNA /NAC /katalase. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± 3 SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, β-lap behandlings vs kontrollcellene; # P 0,05, ## P $ P 0,05, $$ P 0,01, $ $ $ P. 0,001, katalase forbehandling kontra tilsvarende β-runde bare)
Redusert glutation (L-γ-glutamyl-L-cysteinyl-glycin, GSH) er den biologisk aktive formen som oksyderes til glutation disulfid (GSSG) i løpet av oksidativt stress, og forholdet mellom GSSG-til-GSH gir således en enkel og praktisk uttrykk for cellulær oksidativt stress [25,26]. Vi så evaluert cellulære redoks balanse ved å teste GSSG /GSH i HT29 og HCT116 cellene og fant den samme endringen tendensen som DCF flekker analyser (Fig. 3A, Fig. 3B og Fig. 3C).
UGT1A Påvirker β- lap indusert Cytotoksisitet i tykktarm kreft celler
Overdreven ROS induserer oksidativ modifisering av cellulære makromolekyler, hemmer proteinfunksjonen og fremmer celledød [27]. Siden UGT1A var i stand til å hemme ROS formasjon, vi deretter undersøkt om UGT1A aktivitet påvirker β-runde indusert cytotoksisitet. Resultatene viste at β-lap oppviste tydelig cytotoksisitet i HCT116-celler som ble reversert ved NAC og katalase, men ikke av propofol (Fig. 4A). I motsetning til dette, β-lap cytotoksisitet til HT29-celler ble uke, men kan bli styrket ved forbehandling med propofol (figur 4B.); NAC og katalase var i stand til å reversere denne effekten. Konsekvent, UGT1A siRNA trans forbedret også den cytotoksiske effekt av β-lap i HT29-celler, som var betydelig reversert av NAC og katalase (fig. 4C).
Celler ble forbehandlet med propofol (100 pM) i 1 time eller UGT1A siRNA i 24 timer. Deretter ble cellene eksponert for graderte konsentrasjoner av β-lap (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 uM) i 24 timer og MTT-analysen ble utført. (A) β-lap indusert cytotoksisitet i HCT116-celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (B) β-runde indusert cytotoksisitet i HT29 celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (C) β-lap indusert cytotoksisitet i HT29-celler med siRNA /NAC /katalase forbehandling. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± 6 SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, propofol /siRNA forbehandling vs. β-lap bare; # P 0,05, # # P 0,01, ### P 0,001, NAC og propofol /siRNA forbehandling vs. propofol /siRNA bare; $ $ P 0,01, $ $ $ P 0,001, katalase og propofol /siRNA forbehandling vs. propofol /bare siRNA ).
UGT1A aktivitet Årsaker Resistance av β-runde indusert apoptose i tykktarmskreft Cells
Cell apoptotisk død ble evaluert av TUNEL farging analyse for å undersøke nærmere rollen som UGTs i β- lap anti-kreft-effekt. Tykktarmskreftceller ble forbehandlet med propofol eller UGT1A siRNA å inhibere aktiviteten UGT1A9 og deretter eksponert for 5 uM av β-lap i 24 timer. Data indikerte at β-lap induserte en betydelig apoptose i HCT116-celler, noe som kan bli reversert ved NAC eller katalase, men ikke av propofol forbehandling (Fig. 5A). Men i HT29-celler, β-lap indusert apoptotisk død ble knapt observert etter 24 timers eksponering. HT29-celler forbehandlet med propofol eller UGT1A siRNA og deretter til p-runde viste en signifikant celledød ved apoptose (Fig. 5B Fig. 5C). Kombinasjon forbehandling av NAC eller katalase med propofol eller UGT1A siRNA i stor grad kansellert apoptotisk effekt av β-runde sammen med propofol forbehandling eller UGT1A siRNA transfeksjon av HT29 celler (Fig. 5B, Fig. 5C), noe som tyder på en dominerende rolle UGTs i β- lap indusert apoptotisk død.
Celler ble forbehandlet med propofol (100 pM) i 1 time eller UGT1A siRNA i 24 timer. Da celler ble eksponert for p-lap (5 uM) i 24 timer og oppsamlet. Celle apoptose ble bestemt ved TUNEL assay. (A) Celle apoptose i HCT116-celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (B) Celle apoptose i HT29-celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (C) Celle apoptose i HT29-celler med siRNA /NAC /katalase forbehandling. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± 3 SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, β-lap behandlings vs kontrollcellene; # P 0,05, NAC forbehandling vs. tilsvarende bare β-fang; $ P. 0,05, katalase forbehandling kontra tilsvarende β-runde bare)
UGT1A undertrykker β-lap-aktivert FOXO1 apoptotiske sti i tykktarm kreft celler
Våre tidligere studier vist at SIRT1-FOXO1 apoptotiske sti er involvert i β-runde indusert apoptotisk celledød. β-runde fører NAD
+ utarming, reduserer aktiviteten av NAD
+ – deacetylase stille parring typen informasjon regulering 2 homolog 1 (SIRT1), som fører til redusert deacetylering av gaffelhodeboks O 1 (FOXO1) og økt akkumulering av acetylert-FOXO1 (Ac-FOXO1) og dermed forbedret transkripsjonen aktivitet mot flere nedstrøms apoptotiske mål. For å validere om denne veien er også involvert i UGT1A-trykt apoptotisk effekt av β-runde, undersøkte vi aktivering av SIRT1-FOXO1 veien etter β-runde eksponering med eller uten propofol eller UGT1A siRNA forbehandling. Ifølge real-time PCR og Western blot analyser resultatene ble uttrykket av SIRT1 sterkt hemmet mens FOXO1, Ac-FOXO1 så vel som dens nedstrøms apoptotiske target proteiner (BIM, Fasl, trail, og BCL-6) ble alle oppregulert etter β-runde eksponering i HCT116-celler (fig 6A.); denne effekt kan i stor grad revesed av NAC eller katalase forbehandling, men ikke av propofol (Fig. 6A). I motsetning til dette, i HT29-celler, β-runde alene kan ikke redusere SIRT1 uttrykk og fremkalle FOXO1 grunn av den hurtige eliminering av β-runde. Imidlertid ble tilsvarende resultater som de som ble observert i HCT116 cellene finnes i HT29 celler forbehandlet med propofol eller UGT1A siRNA, som også ble motvirket av NAC eller katalase (Fig. 6B, Fig. 6C).
Celler ble forbehandlet med propofol (100 pM) i 1 time eller UGT1A siRNA i 24 timer. Deretter ble cellene eksponert for p-lap (5 uM) i 24 timer og oppsamlet. Celle mRNA-nivåer ble vurdert ved hjelp av PCR og proteinnivåer ved Western blot analyser. (A) Relative mRNA og proteinnivåene i HCT116-celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (B) i forhold mRNA og proteinnivåer i HT29 celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (C) Relative mRNA og proteinnivåene i HT29-celler med siRNA /NAC /katalase forbehandling. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± 3 SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, propofol forbehandling kontra kontrollceller, eller UGT1A siRNA forbehandling vs. egge siRNA forbehandling; # P 0,05, ### P 0,001, NAC forbehandling kontra tilsvarende β-lap bare; $ P 0,05, $ $ P. 0,01, katalase forbehandling kontra tilsvarende β-runde bare)
diskusjon
β-lapachone (β-lap) er en lovende antikreftmiddel ved en virkningsmekanisme svært avhengig av enzymet NQO1, et flavoprotein fant overuttrykt i forskjellige kreftceller [10,28,29] . Tidligere studier i vårt laboratorium viste at UGT1A9 og UGT2B7 er de viktigste to UGT isoformer som katalyserer metabolismen av β-runde i human lever og tarm S9 inkubasjoner [22]. Selv om flere rapporter har gitt bevis for en glucosylsulfate konjugat metabolitt av β-runde, er glukuronidering sin dominerende metabolismen mønster. Siden UGTs medierte glukuronideringsprosessen står for multippel legemiddelresistens i kreftbehandling [30-32], vurderte vi den potensielle rolle UGTs mediert cellulær metabolisme av β-runde i å bestemme sin anti-kreft effekt i humane tykktarmskreftceller. Et par av cellelinjer ble valgt i vår studie, en med høye nivåer av UGT1A (HT29) og en annen uten UGT1A uttrykk (HCT116), som også var involvert utforskn på UGTs [23,33,34]. Glukuronidering metabolitten M2, men ikke M1, av β-runde ble påvist i HT29 celler og S9-fraksjoner, tilsvarende den som ble observert fra menneskets tarm S9 studie [22]. Dette kan rasjonelt forklares ved den lave ekspresjon av UGT2B7 i fordøyelsessystem [7]. UGT1A9 typisk inhibitor propofol eller UGT1A siRNA viste sterk inhibitorisk effekt på dannelsen M2, som indikerer UGT1A9 er den viktigste isoformen av β-runde glukuronisering i HT29-celler. Sammenlignet med HT29-celler, mangel på UGT1A9 i HCT116-celler fører til en betydelig høyere AUC-verdi på β-runde og umulig å oppdage M2. Enten propofol eller UGT1A siRNA forbehandling bemerkelsesverdig intensivert intracellulær akkumulering av β-runde, som støttes av betydelig høyere C
max og AUC-verdiene. Det er verdt å nevne at intracellulære M2-nivåer falt i løpet av tidsforløpet mens det i kulturmedium økes kontinuerlig, noe som indikerer en eliminering av β-runde metabolitt fra cellene til det ekstracellulære mediet.
Som beskrevet i detalj i vår tidligere arbeidet innebærer β-runde metabolisme to skritt [22]. Det første trinnet er to-elektron reduksjon for å produsere en katekol middels, fremmet av de to-elektron kinon reduksjon enzym NQO1. Denne prosessen kan reverseres automatisk i en ikke-enzymatisk modus, som produserer store mengder av ROS [22,24]. I UGTs-positive celler, er katekol mellomproduktet underkastes umiddelbar glukuronidering, og dermed bryte redox-syklusen ved å avlede til fremstilling av stabile β-lap glukuronider [22]. Derfor UGT1A ikke bare bestemmer intracellulær akkumulering av β-runde, men enda viktigere kan forstyrre NQO1-utløste redoks-syklus som er den dominerende mekanisme for β-runde for å utløse sin anti-tumor effekt. Dette faktum tyder på at ekspresjon av UGT1A i kreftceller kan representere en viktig mekanisme som ligger til grunn den indre motstand av β-runde. For å teste denne hypotesen, undersøkte vi potensialet påvirkning av UGT1A i β-lap-indusert ROS produksjon, cytotoksisitet, apoptose og apoptotisk signaltransduksjon. Som antatt, β-runde utløst betydelig ROS produksjon, mobilnettet redoks homeostase lidelse, og sterk cytotoksisitet ved svært lav konsentrasjon og kort tid eksponering i HCT116 cellene. I motsetning til dette ble ROS-produksjon, og det resulterende cytotoksisitet i HT29-celler kun observert i nærvær av propofol eller UGT1A siRNA, og gir et sterkt bevis for at UGT1A er en viktig determinant i den cytotoksiske effekt av β-runde.
Neste utvidet vi studien å bestemme den potensielle påvirkning av UGT1A i forstyrre apoptotisk celledød veien aktiveres ved β-runde. Flere moduser og mekanismer for β-lap indusert celledød inkludert apoptose, nekrose programmert, og selvdestruerende har blitt rapportert [10,35,36]. Her fant vi at β-runde i hovedsak forårsaket en typisk apoptotisk død av menneskets tykktarm kreft cellelinjer. Sirtuin, en konservert familie av NAD
+ – avhengige deacetylases og mono-ADP-ribosyltransferases, har blitt funnet involvert i forskjellige cellulære prosesser som genet Slå, DNA-reparasjon, levetid og utvidelse celle apoptose [37-39]. β-lap indusert apoptotisk celledød er karakterisert med en dramatisk NAD
+ uttømming og redusert SIRT1 aktivitet, som fører til økende akkumulering av acetylert-FOXO1 og deretter den transkripsjonelle aktivering av nedstrøms apoptotisk målgener i HCT116-celler. I motsetning til dette ble aktivering av denne typiske apoptotisk reaksjonsvei i HT29-celler bare observert med propofol eller UGT1A siRNA forbehandling. Nedskrivning av β-runde evne til å aktivere SIRT1-FOXO1 apoptotiske sti i HT29 cellene på grunn av glukuronideringsprosessen hint som UGTs høyt uttrykk i kreftceller kan påvirke svarene på mange terapeutiske legemidler. Videre er både NAC og katalase behandling i stor grad forhindret aktivering av denne apoptotisk celledød signal, noe som tyder på at ROS-produksjonen fra NQO1-utløste redoks-syklusen kan være viktig tilfeldig faktor for den apoptotiske effekt av β-runde og at UGT1A kan gi iboende motstand via avlede Redox syklus.
i sammendraget, viste vi at UGT1A spiller en viktig rolle i intracellulær akkumulering og den resulterende apoptotisk effekt av β-runde i tykktarm kreft celler. Mangel på UGTs aktivitet øker muligheten for kontinuerlig redoks-syklus av β-runde hvori overdreven ROS fremstilles og til slutt fører til apoptotisk celledød. Tvert imot, høye nivåer av UGT1A aktivitet, spesielt UGT1A9 kan bryte denne syklusen og fremme β-runde metabolske eliminering. Denne studien sammen med vår tidligere arbeid hint til at anti-kreft effekt av NQO1 målsøkende midler er i stor grad knyttet til balansen mellom uttrykk og aktivitet av NQO1 og UGT1A. Spesielt tumorvev vanligvis bærer mye høyere NQO1 [40,41] men lavere UGTs [5,42] enn i normalt vev. Denne egenskapen overfører β-runde, så vel som andre NQO1 rettet mot midler slik som Tanshinone IIA [7,24] en funksjon av høy selektivitet i å drepe kreftceller, mens sparsom normale vev. Sammen med vår forrige undersøkelse på Tanshinone IIA, dagens arbeid på β-runde ytterligere høydepunkter som UGTs medisinert stoffskifte kan representere en sentral mekanisme i forårsaker indre chemoresistance av NQO1 målretting midler som vanligvis UGTs «underlag.
