Abstract
Bakgrunn
Forekomsten av papillær skjoldbruskkjertelen carcinoma (PTC) har steget jevnt de siste tiårene samt gjentakelse priser. Det har blitt foreslått at målrettet ablativ fysioterapi kan være et terapeutisk modalitet i skjoldbruskkjertelen. Målrettet bio-affinitet funksjon multi-vegger karbon nanorør (BioNanofluid) handle lokalt, for å effektivt konvertere eksternt lys energi til å varme dermed spesielt å drepe kreftceller. Dette kan representere en lovende ny kreft terapeutisk modalitet, fremme utover konvensjonell laser ablasjon og andre nanopartikkel tilnærminger.
Metoder
Thyroid hormon reseptor (TSHR) ble valgt som et mål for PTC celler, på grunn til sitt store uttrykk. Enten TSHR antistoffer eller Thyrogen eller renset TSH (Tyreotropin) ble kjemisk konjugert til vår funksjon Bionanofluid. En diode laser-system (532 nm) ble anvendt til å belyse en PTC-cellelinje for å sette eksponeringstider. Celledød ble vurdert ved hjelp av trypanblått farging.
Resultater
TSHR målrettede BioNanofluids var i stand til å selektivt ablating BCPAP, en TSHR-positive PTC cellelinje, mens ikke TSHR-null NSC-34 celler . Vi fastslått at en 2: 1 BCPAP celle: α-TSHR-BioNanofluid konjugat-forhold og en 30 andre laser eksponering drept ca 60% av BCPAP cellene, mens 65% og 70% av cellene ble ablated hjelp Thyrotropin- og Thyrogen- BioNanofluid konjugater, respektivt. Videre ble minimal ikke-målrettede drap observert ved bruk av selektive kontroller.
Konklusjon
En BioNanofluid plattformen, og gir en potensiell terapeutisk vei for papillær skjoldbruskkjertelkreft har blitt undersøkt, med vår
in vitro
resultater antyder utviklingen av en kraftig og rask fremgangsmåte for selektiv kreftcelledreping. Derfor understreker BioNanofluid behandling behovet for ny teknologi for å behandle pasienter med lokalt residiv og metastaserende sykdom som for tiden gjennomgår enten re-operative hals undersøkelser, gjentatt administrasjon av radioaktivt jod og som en siste utvei ekstern strålebehandling eller kjemoterapi, med færre bivirkninger og økt livskvalitet
Citation. Dotan jeg, Roche PJR, Paliouras M, Mitmaker EJ, Trifiro MA (2016) Engineering Multi-vegger karbon nanorør Terapeutisk Bionanofluids å selektivt målet papillær skjoldbrusk kreft celler. PLoS ONE 11 (2): e0149723. doi: 10,1371 /journal.pone.0149723
Redaktør: Valentin Cena, Universidad de Castilla-La Mancha, Spania
mottatt: 18 juni 2015; Godkjent: 04.02.2016; Publisert: 22 februar 2016
Copyright: © 2016 Dotan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. ID mottatt lønn støtte fra Israel Cancer Research Fund (ICRF)
Konkurrerende interesser:. Forfatterne (ID, PJRR, MP, EJM, og MAT) ønsker å videreformidle til redaktøren og anmeldere at de er også oppfinnere på følgende patentsøknad: BIONANOFLUID FOR BRUK som en kontrast, bildediagnostikk, desinfisering og /eller terapeutisk AGENT-US patent kontor PCT- CA2014 /051094 på arbeidet som presenteres her og i andre utbygginger ved de terapeutiske utviklingen. Denne patentsøknad ikke er i konflikt med tidsskriftets åpen datapolitikk angående data som finnes i dette manuskriptet eller patentsøknaden. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling, eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
I løpet av det siste tiåret har det vært en betydelig økning i forekomsten av skjoldbruskkjertelkreft [1]. Dette mønsteret er delvis forklares med en økning i deteksjon av små knuter som finnes forresten på halsen bildebehandling, men en mer illevarslende trend er økt forekomst av større skjoldbruskkjertelen ( 4 cm) svulster sammen med okkulte lymfeknutemetastaser [2]. Papillær skjoldbruskkjertelen carcinoma (PTC) i seg selv utgjør ~ 80% av skjoldbruskkjertelen carcinoma [3, 4]. Til tross for en meget høy 10-års overlevelse på mer enn 90% [3], forekommer lokalt tilbakefall hos opptil 20% av tilfellene, noe som fører til diagnostikk og behandling utfordringer [4]. I tillegg aggressive varianter av PTC, for eksempel høy-celle, søyle-celle, isolerte, trabekulært og diffuse skleroserende varianter, men sjelden, øker i forekomst. Disse typene krever ofte aggressive behandlinger forbundet med en rekke bivirkninger [5, 6].
Bærebjelken i primær PTC behandling er total tyreoidektomi [3, 7, 8], vanligvis etterfulgt av radiojod ablasjon (RAI) i mellom og høyrisikopasienter [3, 7-10], og livslang levotyroksin terapi. Selv profylaktisk sentral halsen lymfeknute disseksjon (PCND) fortsatt kontroversielt, er terapeutisk lymfeknute disseksjoner rutinemessig utført [2, 11]. For tilbakevendende /avansert PTC, er kirurgisk ekstirpasjon det beste alternativet. Imidlertid er komplett biokjemisk remisjon med negative tyreoglobulinnivåer bare oppnådd hos 27% av pasientene (ofte etter flere intervensjoner) [12], med en 20-års overlevelse så lav som 36% [13]. Den betydelige antall pasienter som ikke er kirurgisk kandidater kan være gjenstand for adjuvant behandling, for eksempel ekstern stråle strålebehandling (EBRT), som disponerer for irreversible morbidities [7, 14-18]. Derfor er det nødvendig å finne en mer presis og målrettet behandlingstilbud som vil oppnå tilsvarende resultater for primær sykdom og forbedre kliniske fordeler for tilbakevendende sykdom, samtidig minimere sykelighet.
Dessverre er det iboende begrensninger med vår nåværende armamentarium av strategier for å utrydde tumor gjentakelse, og det er et behov for å oppdage nye teknikker når det gjelder å tilbakevendende sykdom. Nanomedisin refererer til bruk av nanoteknologi i helsevesenet domene, og det bruker vanligvis materialer utviklet i nanoskala dimensjoner og har allerede vist seg å være svært effektiv som en plattform for levering av enten fysisk energi eller narkotika, og også i bildebehandlingsprogrammer [19] . Derfor begrepet nanopartikkel-baserte kreftbehandling er å omgå problemer med konvensjonell medikamentell farmakokinetikk og motstand mens begrense skade, systemisk eller til vanlig omkringliggende vev. Den strekker seg også til å omfatte pasienter som er inoperable basert på konvensjonelle metoder. Basert på dagens kjemoterapeutika, økt seleksjonspress gjennom anvendelse av kjemoterapeutika fører til økning i tumorresistens [20-22]. I tillegg vil konvensjonelle fysikalske behandlinger anvendes for å ablate vev, som for eksempel bestråling eller høy intensitet laserbehandlinger, også skade friskt vev. Nanopartikler blir brukt som fysiske midler som er i stand til å forsterke eller å konvertere energitilførsel, for å indusere cellulær skade på en selektiv målestokk. Dette er deres unike fotoniske egenskaper og plasmonic atferd, særlig karbon nanorør, hvor slike partikler absorberer lys svært effektivt og gjennom plasmonic resonans konvertere sin energi absorpsjon av overdreven varmeutvikling på den overflaten [23, 24].
Bio-affinitet nanopartikler, som her er beskrevet som BioNanofluid, bør være i stand til å: 1) effektivt konvertere lyset til varmeenergi, 2) kan lett modifiseres med ligander og /eller biomolekyler for å gi spesifisitet, 3) forhindre ikke-spesifikk celledød, og 4) har en størrelsesfordeling under en mikron for å muliggjøre vevsperfusjon. Den nanomaterial som best passer denne beskrivelsen er multiwall karbon nanorør (MWCNTs), som er sylindriske strukturer av konsentriske [25, 26] graphene ark. Lagdelingen av graphene rørlengde og store sideforhold gir et betydelig areal for flere biomolekylære vedlegg, lage multi-dentate partikler, hvor antistoffer eller andre ligander kan gjenkjenne flere reseptorer på celleoverflaten. Multiwall karbon nanorør tilbyr gode lokale temperatur gevinster i kraft av sin høye evne til å absorbere lys og konvertere den til varme, mens resterende uskadet [27-29]. Heat generert over nanometer skala ved nanomaterialer festet til cellene, vil føre tilstrekkelig lokal hypertermi uten bulk oppvarming av ikke-kreftvev [30]. Videre, gitt at menneskekroppen er transparent for nær infrarødt (NIR), slike partikler med en arm målretting, kan levere en enorm mengde varme lokalt når de utsettes for NIR-lys. NIR allerede besitter god menneskelig dybde penetrasjon, men kan forlenges ytterligere ved fiber /endoskopiske fremskritt gjort i medisinsk bildebehandling feltet som kan bringe NIR lyskilde nesten hvor som helst i kroppen [31].
Formålet med denne studien er å designe og utarbeide konjugerte BioNanofluids å ablate PTC
in vitro
, ved å skape en målrettet tilnærming med den hensikt å forårsake fysisk skade på kreftceller på cellenivå. I tillegg effekten av en roman målrettet foto-termisk behandling for PTC bruke disse konjugert funksjon multi-vegger karbon nanorør (BioNanofluid) i et skjoldbruskkjertelkreft cellelinje modellen vil bli vurdert.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
papillær thyroideakarsinom cellelinje (BCPAP) [32-34] ble kjøpt fra DMSZ (Braunschweig, Tyskland). Hybrid mus neuroblastom-motor nevron NSC-34 [35] cellelinjen ble donert av Dr. Neil R. Cashman.
Cell kultur
BCPAP celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10 % FBS. NSC-34-celler ble dyrket i DMEM media supplert med 10% FBS og 20% L-glutamin. Alle cellelinjer ble inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 fuktet luft i plastkulturflasker (VWR, Canada). Når sammenflytende, ble cellene samlet opp ved hjelp av Versene-oppløsning (0,48 mM EDTA i PBS), spunnet ned og fortynnet i medium til en konsentrasjon på 2,5 til 3,5 x 10
5 celler /ml.
Antistoffer og kjemisk reagenser
Anti-TSHR antistoffer ble kjøpt fra Novus Biologicals, Canada, og acris antistoffer Inc, USA. Tyreotropin (renset humant TSH phTSH) ble kjøpt fra BioWorld, USA. Thyrogen (rekombinant TSH eller rhTSH) ble kjøpt fra Genzyme Canada Inc, Canada. Thiolyated PEG 5000 (polyetylenglykol, MW 5000 kD) ble kjøpt fra Laysan Bio, USA. NHS (
N
hydroksysuccinimid) og EDC (etyl-dimetylaminopropyl-carbodiimide) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, USA.
Western blotting
BCPAP og NSC-34 celler ble samlet inn ved hjelp 0,05% trypsin og lysert ved hjelp av en X Reporter Lysis buffer. For Western blot-analyse, 20 ug av total-erte cellelysat ble fylt på en 10% SDS-PAGE-gel. Primære antistoffer ble fortynnet 1: 1000 og brukes under produsentens foreslåtte protokoller. Proteinet uttrykket ble visualisert ved hjelp av ECL kit og eksponert film.
Konjugert BioNanofluid forberedelse
COOH-funksjon Au-dekorert MWCNTs ble hentet fra McGill University, Canada, og fortynnet med d
2 H
2o til en arbeidskonsentrasjon på 18-20 mg /l før konjugering, for å sikre mono-dispersitet. COOH funksjonalisering ble oppnådd ved hjelp av plasma-behandling, en generell metode for tilsetning av funksjonelle grupper ved defekter i graphene strukturer [36, 37]. Au dekorasjon ble utført ved hjelp av pulset laserfjerning ved anvendelse av en Nd: YAG laser fokusert på MWCNT mål ved en innflytelse på størrelsesorden på 1 J /cm
2. Prosessen kan rutinemessig dekorere CdSe, Au, Ag, Si, og Sn på MWCNTs. Materialet laget hadde Au-belagt øyene (variabel størrelse 1 nm-5 nm som observert og målt fra SEM i figur 1A) for PEG vedlegget og utsatte COOH grupper der Au var fraværende. Konsistens av batch-løsninger ble undersøkt ved UV-vis spektroskopi ved bruk av 260 nm toppen for å bestemme overensstemmelse konsentrasjon.
A. Scanning elektronmikroskopi (SEM) bilder av COOH-funksjon Au-merket Tiol-Carbon avledet bionanofluids, ved to forskjellige forstørrelser. Au partikler har definert sfæriske strukturer, markert med pilspiss. B. EDC-NHS kobling kjemi for å feste bio-affinitet molekyler, enten antistoff eller protein /mitogen til tiol-PEG-CNT. PEGylering av den Tiol-CNT er beskrevet i avsnittet Materialer og metoder.
BioNanofluid ble modifisert ved bruk av tiolert PEG (MW 5000) i løpet av 1 time med en -SH-gruppe som danner Au-S-binding, danner grunnlag for ikke-spesifikk absorpsjon forebygging. Materialet laget hadde både PEG børster rundt de tynne gullbelagt øyer og synlige COOH grupper hvor gullet var fraværende. En stamløsning av 150 pM thiolyated PEG ble fremstilt i destillert vann ved pH 4,5. MWCNT [500 ul stamløsning (1 pg)] ble inkubert med 200 pl av tiolert PEG5000 150 pM stamoppløsning i et endelig volum på 700 ul ved romtemperatur i en time ved pH 5. Blandingen ble deretter sentrifugert i 10 minutter ved 13000 RPM, supernatanten ble kastet, og pelleten ble resuspendert i 350 ul PBS (pH 7,4). Tiol-PEG-CNT ble deretter konjugert til målsøkende molekyl. Konjugeringsblandingen inkluderte 350 pl PEG-BioNanofluid, 90 pl (36,8 mM) NHS, 90 pl (22,1 mM) EDC og 4 pg av ett av de følgende ligander: a-TSHR, Tyreotropin eller Thyrogen, med en slutt-pH på 5,5 (se figur 1B). Konjugeringen ble tillatt å fortsette i 1 time ved romtemperatur. Etter endt konjugering ble blandingen sentrifugert i 10 minutter ved 13 000 RPM ved romtemperatur, supernatanten ble fjernet og de konjugerte BioNanofluid pelletene ble vasket (3 ganger) med PBS og deretter resuspendert i 300 ul PBS.
Cell målretting og laserbehandling
100 til 200 pl av ferskt innsamlede celler (inneholdende 250,000-350,000 celler per ml) ble blandet med 100-200 pl konjugater, tiol-PEG-CNT /BioNanofluid eller PBS, i henhold til forsøket i en 1,5 ml Eppendorf-rør. Prøvene ble deretter inkubert ved 37 ° C på et roterende stativ i 1 time. Prøvene ble deretter vasket 3 ganger med PBS for å fjerne ubundet BioNanofluid og overflødig celleavfall. Etter vasking ble cellene delt opp i 25 pl aliquoter på 200 ul sterile eppendorfs, og behandlet med en 532 nm 2,7 W /cm
to strøm laser. Laser behandlinger ble utført ved hjelp av individuelle inkubasjoner av α-TSHR, Tyreotropin eller Thyrogen konjugert-BioNanofluid. Forsøkene ble gjentatt med et minimum av 3 replikater per konsentrasjon eller lasereksponeringstiden. Kontrolleksperimenter ble utført med bare IgG-konjugert BioNanofluid, tiol-PEG-CNT (ingen ligander) eller med PBS og cellene alene. Hensikten med kontrollene var å undersøke effekten av hver enkelt kjemiske og biologiske modifikasjoner, ikke-spesifikk absorpsjon og eksponeringstiden til laseren på celler, og også for å begrense eller eliminere sekundære effekter som kan forårsake celledød, slik at det bare skjer når laser samhandler med karbon nanorør
Umiddelbart etter lasereksponering, ble Trypan blå tilsatt i en 1:. 1 volumforhold celle brudd i hvert mikrorør, og den hvite (levende) celler ble tellet ved bruk av et hemocytometer. Tellinger ble utført in triplo, og hvert forsøk ble utført på 3 forskjellige anledninger. Prosentandelen av celledreping (levende celler gjenstår) ble beregnet i henhold til ligning:
BioNanofluid stabilitetsforsøk
4 ° C
Konjugater var forberedt på dag 1, og fortsatte. ved 4 ° C inntil dag 21. Eksperimenter ble utført for en hel uke (dag 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7), og deretter fortsatte på dagene 10, 14 og 21. BCPAP celler ble utsatt for 532 nm laser i 30 sekunder på en 2: 1 celler: BioNanofluid ratio. Konsentrasjonene av de konjugerte og ukonjugerte BioNanofluid ble målt ved hjelp av UV-VIS spektrometer, for å sikre ekvivalens av konsentrasjon ved anvendelse av en oppløsning av like absorbans.
-20 /-80 ° C.
konjugater som er opprettet på dag 1, ble alikvotert og holdt ved -20 ° C eller -80 ° C. Eksperimenter ble gjennomført på dagene 1, 5 og 7 og deretter hver uke i opp til 6 uker. BCPAP celler ble eksponert for 532 nm laser i 30 sekunder ved et 2: 1 celle: konjugat-forhold. Tilsvarende ble konsentrasjonene av de konjugerte og ukonjugerte BioNanofluid målt ved hjelp av UV-VIS spektrometer.
Resultater
BioNanofluid egenskaper
Den optiske fysikk av karbon nanorør har blitt studert og beskrevet andre steder [38]. Kort sagt, de har den største absorbans co-effektive av nanopartikkel arter og en bredbånds absorbans som passer til design regler. Lagene med den graphene rørlengden er i mikrometerområde, overdragelse et meget stort sideforhold for flere biomolekylære vedlegg, skape multi-dentate partikler, der flere celleoverflatereseptorer kan gjenkjennes av antistoffer eller andre ligander. Multiwall karbon nanorør (MWCNTs) tilbyr en utmerket metode for sterkt lokalisert varmeutvikling i kraft av sin høye kapasitet til å absorbere lys og konvertere den til varme, mens resterende uskadet [27-29]. Dette er en egenskap ved graphene-baserte materialer, som de oppviser bredbånds absorbansen av lys, være i stand til å absorbere et meget stort spekter av lyse farger og være i stand til å omdanne denne energi med høy virkningsgrad. Dette er demonstrert av den svarte fargen som den karbon nanorør utstillingen. Med absorbansen av lys, fremmer energien av fotonet et elektron til et høyere energinivå fra grunntilstanden, kan tapet av en energi finne sted enten i svake fotoluminescerende utslipp og små intersystem prosesser, men den grunnleggende overføring av energi til den omgivende karbonmaterialer er i form av varmeenergi. Dermed varmen generert over nanometer skala ved bio-funksjon MWCNTs festet til selektive /målrettede celler, vil føre til rask og tilstrekkelig lokal hypertermi uten «bulk oppvarming» av nærliggende potensielt sensitive vev. Tidligere har gull nanopartikler med sine Plasmonic absorpsjonsegenskaper blitt benyttet for å omdanne lys for å oppvarme og indusere celledød i tumorer [25]. Den store lette flussmidler eller ultrakorte lys pulsmoduleringer som kreves for å oppnå høye temperaturer, [39] trenge lengre tids påvirkning av 5 til 15 minutter [40] og forårsake skade skade på omkringliggende ikke-kreftceller.
basismaterialet av den BioNanofluid er COOH funksjonaliserte fler vegger karbon nanorør (lengde i området fra 0,25 um til 10 um med en diameter på 25-50 nm) med gull (Au) er tynt belagt som en ytterligere modifikasjon, ble generert via amid tiol sammenhengene for kjemiske og biologiske ligander. Bilder av COOH-funksjon Au-dekorerte MWCNTs ble utført ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (Fig 1A).
TSHR målretting av BioNanofluid for PTC cellelinjer
Thyroid hormon reseptor (TSHR) ble valgt for sin robuste ekspresjon i både normal og i differensierte thyroid kreft celler [41-44] som gjenspeiles av studier som viser ingen nedregulering av TSH-R i differensierte thyroid kreft celler [45], mens andre viste TSHR å være over-uttrykt i thyroid karsinomer og godartede adenomer i forhold til normal skjoldbruskkjertelen vev [43]. Vedlegget av TSH til sin reseptor stimulerer cellevekst og spredning, og dermed hjelpe til PTC progresjon [46]. Dette gir en forklaring på hvorfor levotyroksin er foreskrevet i doser som hemmer TSH, det vil si for å forhindre vekst av mikrometastaser og /eller rester av tyroideavev følgende konvensjonell behandling for kreft i skjoldbruskkjertelen. Videre er robust ekspresjon av TSHR, som er allestedsnærværende i thyrocyte, tjener fortsatt som en viktig og vedvarende regulator og fysiologisk markør i primær og metastatisk sykdom med evnen til å målrette BioNanofluid konjugater for en terapeutisk potensiale.
for å vurdere potensialet for målretting TSHR, en TSHR-positive uttrykke PTC cellelinje (BCPAP) ble funnet og inkubert med to forskjellige α-TSHR-BioNanofluid hjelp TSHR antistoffer fra ulike leverandører (fig 2). Begge leverandør antistoffer viste lignende og vesentlige celle drepe priser av 62 ± 5,6% (Ab # 1 -Acris antistoffer) og 62 ± 5,1% (Ab # 2 -Novus biologiske), med p-verdier på 0,000148 (Ab # 1); og 5,74 x10
-5 (Ab # 2), sammenlignet med IgG-BioNanofluids. Antistoffene alene, IgG-BioNanofluid, eller ukonjugert Tiol-PEG-CNTs viste minimal celledød potensial
To TSHR spesifikke antistoffer, kjøpt fra ulike forsyninger (Ab # 1, acris Antistoffer;. Ab # 2, Novus Biologicals ) ble konjugert til vår Tiol-PEG-CNTs, sammen med IgG kanin og mus-thiol-PEG-CNT konjugater som uspesifikke kontroller for målretting celle dreping av BCPAP PTC celler. Andre kontroll forholdene omfatter PBS, CNT partikler og antistoffer alene. Resultatene er vist som% levende celler, etter laserbehandling fulgt av trypanblått farging å definere død fra levende celler. α-TSHR-Bionanofluid konjugater signifikant (Ab # 1, p = 0.000148; Ab # 2, p = 5,74 x10
-5) drepte BCPAP celler vs. IgG-bionanofluid konjugater. Alle andre kontroller viste ingen signifikante celler dreper priser vs. IgG-bionanofluids.
BioNanofluid optimaliseringene
For å nå et maksimum celledrepende renten med minimum forekomst av ikke-spesifikk celle død, fortsatte vi å optimalisere betingelsene for å ta hensyn til cellekonsentrasjon til bioNanofluid og lengden av tid for eksponering av bionanofluid-celle-komplekset til laseren
Først må vi undersøkt fire forskjellige størrelsesforhold (4:. 1, 2 : 1, 1: 1 og 1: 2) i celler for å BioNanofluid konjugater. En 2: 1 celle til BioNanofluid ratio ga 58,9% (± 2,3) celledød renten med α-TSHR-BioNanofluid, 65,1% (± 2,1) for Tyreotropin-BioNanofluid, og 72,4% (± 3,52) for Thyrogen-BioNanofluid (fig 3A ). Videre Thyrogenstimulert BioNanofluid enn både α-TSHR- og Tyreotropin-BioNanofluid i forholdet 2: 1. Økende BioNanofluid innhold til et 1: 1 eller 1: 2 (celle: BioNanofluid) forhold forårsaket 47,1% (± 7,65) og 69,0% (± 4,52) celledød, henholdsvis av ikke-målrettede celledrepende priser CNT nanopartikler alene kontroll gruppe. Denne økningen av celledød, ved høyere konsentrasjoner av ukonjugert nanopartikler er relatert til en økning av partikkelansamlinger på cellen ved ikke-spesifikke celleoverflate-assosiasjoner som er utbredt på alle MWCNT konsentrasjoner. Derfor, er en høyere konsentrasjon /forholdet for ikke-spesifikk partikkelansamlinger gruppe mange nok til å generere uønskede masseoppvarmingseffekter derved å drepe celler. Videre er den relative ytterligere celledød av ikke-spesifikk målretting av de α-TSHR-BioNanofluid konjugater på 1: 1 [56,2% (± 8,70), p = 0,1501] eller 1: 2 [61,8 (± 21,2), p = 0,681] ratio gruppe var ikke signifikant.
Inkludert i disse eksperimentelle forholdene er, α-THSR-, Thyrogen-, og renset tyreotropin-thiol-PEG-CNT konjugater. Styrebetingelser inkludert PBS og CNT alene. A. Bestemmelse av optimal celle å bøye BioNanofluid ratio for å oppnå spesifikk maksimal målrettet BCPAP celle drap. Laser eksponeringstid var 30 sekunder for alle forhold. Forholdstall er representert som volum: volumforhold, og dermed for et 1: 1 forhold, 100 ul av celler (av 250,000-350,000 celler per ml) ble blandet med 100 pl av Konjugert-BioNanofluid av 2 pg /ml konsentrasjon. B. Optimal eksponeringstid besluttsomhet eksperiment. BCPAP celler ble eksponert for laser behandling for 20, 30 og 40 sekunder, ved et 2: 1 celle: conjugated- eller ukonjugert-Tiol-PEG CNT-forhold
Eksponeringstid eksperimenter ble utført med det hele tatt. konjugater å bestemme den høyeste frekvensen av celledreping uten tap av spesifisitet, dvs. høy forekomst av ikke-målrettede celledød (fig 3B). Førti andre eksponering ga 67,8% (± 4,4) celledreping (α-TSHR), 67,8% (± 5,6) (Tyreotropin), og 80,1% (± 5,1) (Thyrogen). Tretti andre eksponering ga 59,4% (± 1,3) drepte (α-TSHR), 64,9% (± 5,8) (Tyreotropin) og 75,2% (± 3,5) (Thyrogen). Twenty andre eksponering ga 48,5% (± 4,75) (α-TSHR), 52,9% (± 6,8) (Tyreotropin) og 65,8% (± 7,5) (Thyrogen). Selv de høyeste celle drapsrater ble oppnådd med lengre eksponeringstider (40 sek 30 sek 20 sek), ikke-målrettede drap i BioNanofluid kontrollgruppe med 40 andre eksponeringstiden var 32,7% (± 11.6), igjen gjenspeiler problemet med å håndtere ikke-spesifikk celledrepende gjennom re-undersøkelse av PEG-modifisering. Derfor er en 30 sekunders eksponeringstid samsvarer med den høyeste frekvensen av bestemt celle drap. Men når laser eksponering ble økt med ti sekunders intervall, forårsaket det ca 2,5 ganger så mye (12% celledød på 30 sekunder vs. 33% celledød 40 sekunder av laser eksponering) av ikke-spesifikk celledød i FN -konjugert CNT kontrollgruppe. Dette gjenspeiler vendepunktet mellom nano-skala temperatur levering og den tid det tar for å BioNanofluid tilstrekkelig bulk varme en cellesuspensjon. Tidligere studier har undersøkt effekten av lasereffekten og eksponeringstiden som trengs for å overføre nok energi som fører til celle-ødeleggelse. For eksempel, en studie ble behandlet Daudi-celler med eksponeringstider på 7 minutter og ga mer enn 90% celledød [47]. Andre studier behandlet brystkreft, tykktarmskreft, leverkreft og Daudi-cellelinjer i 3 minutter eller mer [48-50]. Selv om noen av de nevnte studiene brukte enkle vegger karbon nanorør (SWCNT) med definerte Photothermal egenskaper, fant vi at selv med en liten økning på 10 sekunder, bruk av MWCNT demonstrerte flere sivile tap. Våre funn tyder på at teknikken og partikkel fremstilling av MWCNT anvendt for dette forsøk vise større effektivitet i foto-termisk varmeoverføring i en celle-spesifikk måte.
TSHR målrettede BioNanofluid selektivitet og spesifisitet
for å vurdere både selektivitet og spesifisitet av TSHR målrettede BioNanofluid, valgte vi å utføre celle ablasjon eksperimenter samtidig på både en TSHR positiv og TSHR negativ cellelinje. Som BCPAP er en positiv TSHR uttrykke cellelinje, fant vi at musen motor neuron cellelinje NSC-34 er null for TSHR uttrykk (Fig 4A). Derfor har vi testet med α-TSHR-, Thyrotropin- og Thyrogen-BioNanofluids mot både BCPAP og NSC-34 celler (figur 4B). Ved hjelp av en 2: 1 celle: BioNanofluid ratio og 30 sekunder, fant vi at vår selektive målretting av TSHR kan spesifikt og vesentlig skille mellom TSHR uttrykke og ikke-uttrykker cellelinjer
A.. TSHR ekspresjon av BCPAP og NSC-34-celler ble bestemt ved Western blot-analyse, ved hjelp av TSHR spesifikke antistoff. BCPAP var positive for TSHR uttrykk, mens NSC-34 celler var null. B-ACTIN ble anvendt som en kontroll lasting. B. BCPAP og NSC-34 celle ble inkubert α-THSR-, Thyrogen-, og rensede thyrotropin-Tiol-PEG-konjugater CNT. Styrebetingelser inkludert IgG-tiol-PEG-CNTs, PBS og CNT alene. Alle betingelser ble utført i to: en celle: bionanofluid-forhold og 30 andre lasereksponering. De BCPAP cellene viste ~ 60% til ca 73% celledrepende med alle TSHR målrettet bionanofluid konjugater, mens minimal celledød ble observert med kontroll andre forhold. NSC-34 cellelinjen viste ubetydelig celledød i alle forhold.
BioNanofluid stabilitet
Forsøk ble utført for å evaluere aktiviteten av TSHR målrettede BioNanofluids, ved å vurdere deres stabilitet under lengre lagringsforhold. En batch av α-TSHR-BioNanofluid er laget og lagret ved enten 4 ° C i 21 dager, eller -20 ° C og -80 ° C i 6 uker. Porsjonen av α-TSHR-BioNanofluid lagret ved 4 ° C ble undersøkt for deres aktivitet til ablate BCPAP celler hver dag i løpet av en 1-ukers periode, og deretter gjentatt på dagene 10, 14 og 21 (figur 5A). α-TSHR-BioNanofluid begynte å miste effekten etter dag 5, med sin evne til å ablate BCPAP celler slippe fra 60% til 40%, mens Thyrogen-BioNanofluid konjugater tapt effekt på dag 6. Både α-TSHR- og Thyrogen-BioNanofluid syntes å platå til å være 40% effektiv inntil avslutningen av forsøket, noe som tyder på fortsatt, men hindret celle selektivitet. Det kan være en hypotese at ytelsen vil avta med denaturering av proteinligandene i løpet av en kort tidsperiode når den lagres ved ustabile forhold på 4 ° C. Imidlertid, selv om noe kan være direkte utledes som til Thyrogens eller α-TSHR struktur, konsentrasjonene av BioNanofluid lagret ved 4 ° C var stabil målt ved UV /VIS-spektrometer før blanding med celler. Som ligand-BioNanofluid UV /VIS absorbans forblir konstant uten hensyn til potensiell denaturering, er det foreslått at det å gi den kombinerte strukturen absorbans ved 260 nm (absorpsjon ved denne bølgelengde er felles for proteiner og CNTs) at lite eller intet tap av ligand eller CNTs grunn ansvar amid vedlegg eller CNT degradering er årsaker til nedgangen i aktivitet (se S1 tabell).
A. α-TSHR- og Thyrogen-thiol-PEG-CNT konjugater var forberedt på dag 1 og holdt ved 4 ° C i opptil 21 dager. Konjugater aktivitet ble bestemt ved celledrepende analyse av BCPAP-celler (som beskrevet ovenfor). B. På lignende måte, α-TSHR- og Thyrogenstimulert Tiol-PEG-CNT konjugater ble fremstilt på dag 1, og ble holdt ved -20 ° C eller -80 ° C i opptil 6 uker. Konjugater aktivitet ble bestemt ved celledrepende assay ved dag 5, dag 7, og hver uke i opp til 6 uker.
Et lignende eksperiment ble utført over 6 uker, med BioNanofluid lagret ved -20 ° C eller -80 ° C (figur 5B). BCPAP celle ablasjon eksperimenter ble utført på dag 1, 5, 7 og ukentlig, for opptil 6 uker. Resultatene viser stabiliteten til det BioNanofluid aktivitet ved begge -20 ° C og -80 ° C lagringsbetingelser, som observert ved celle ablasjon prosenter for α-TSHR-BioNanofluid og fortsatt opprettholde 60% effekt, og den Thyrogenstimulert BioNanofluid innehar 65% effekt, over 6 uker løpet av eksperimentet. De konjugerte og un-konjugerte MWCNT konsentrasjoner ble målt parallelt for hvert forsøk, og alle viste stabile konsentrasjoner.
Diskusjoner
Det er iboende begrensninger i behandling av tilbakevendende skjoldbruskkjertelkreft. Selv om de fleste tilfellene blir behandlet med thyroidectomy, etterfulgt av TSH-undertrykkende behandling med levotyroksin og radioaktivt jod i utvalgte tilfeller; tilbakevendende skjoldbruskkjertelkreft presenterer en terapeutisk utfordring. Paradigmet av skjoldbrusk kreft behandling og tilbakefall gir en passende ramme for å studere anvendelsen av molekylært målrettede fysiske midler. Nano-mediert bilder termisk behandling er å få fart i form av målrettede fysiske agenter som behandler en rekke kreftformer. Den kritiske utfordringen for skjoldbruskkjertelkreft er å levere en agent som ikke bare er rettet mot kreftceller, men også mål normale rest skjoldbrusk celler. I denne studien ønsket vi å vurdere effekten av en innovativ målrettet fysioterapi bruker nylig utviklet bio-affinitet funksjon karbon nanorør, eller BioNanofluid konjugater, for å demonstrere
in vitro
, effekten av målretting TSHR og ablating
