Abstract
I tidligere en studie, vi hadde utviklet en ny termomagnetisk levering system basert på liposomer. Denne studien hadde som mål å evaluere effektiviteten av dette systemet for co-levering av både narkotika og gener til den samme cellen og sin anti-tumor effekt på magekreft. Doksorubicin (DOX) og SATB1 shRNA vektor ble lastet inn i ko-leveringssystem, og in vitro-DOX termo frigivelse aktivitet, målrettet gen stanse effektivitet, målrettet cellulært opptak, in vitro-cytotoksisitet, så vel som in vivo anti-tumoraktivitet ble bestemt. Resultatene viste at dette samarbeidet leveringssystem hadde ønskelig målrettet levering effekt, DOX thermo utgivelsen og SATB1 genet demping. Videre er co-levering av DOX og SATB1 shRNA utstilt økt aktivitet for å hemme magekreft cellevekst in vitro og in vivo, sammenlignet med enkelt leveranse. I konklusjonen, har romanen termomagnetisk stoff og genet co-levering system lovende program i kombinert kjemoterapi og genterapi for magekreft
Citation. Peng Z, Wang C, Fang E, Lu X, Wang G, Tong Q (2014) Co-Levering av doxorubicin og SATB1 shRNA av termo Magnetic kationiske liposomer for Gastric Cancer Therapy. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10,1371 /journal.pone.0092924
Redaktør: Elena A. Rozhkova, Argonne National Laboratory, USA
mottatt: 04.12.2013; Godkjent: 26 februar 2014; Publisert: 27 mars 2014
Copyright: © 2014 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 81172186). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft død på verdensbasis [1]. I 2008 var det ca 989 000 nye tilfeller av magekreft og 738,000 dødsfall i verden som først og fremst skjedd i Øst, Sør, og Sentral-Asia; Sentral- og Øst-Europa; og Sør-Amerika [2], [3]. I Kina er magekreft den tredje vanligste kreftformen med anslagsvis 380.000 nye tilfeller og en høyeste dødeligheten omtrent 26,3 per befolkning på 100 000 hvert år [4], [5]. Kirurgisk reseksjon er det vanlig kurative alternativ, men det er ikke egnet for de fleste pasienter som har sent stadium av magekreft. Andre behandlinger som strålebehandling og kjemoterapi viser noen effekt, men er ofte utilfredsstillende [4], [6]. I tillegg systemisk administrering av kjemoterapi fører til uønskede bivirkninger [7], [8].
På grunn av utviklingen av resistens mot kjemoterapi, tradisjonelle kjemoterapi også har vist begrenset anti-tumor effekt [9]. Derfor har flere stoffer co-levering system fått mer oppmerksomhet den siste tiden, fordi det kan levere ulike typer agenter for de samme kreftceller som deretter utviser synergi anti-tumor effekter. For eksempel kan to ulike kjemiske midler kombineres eller et kjemisk middel kan kombineres med liten interfererende RNA (siRNA) mot et onkogen. Dessuten kan målrettet levering og kontrollert legemiddeldosering ytterligere styrke anti-tumor effekt og redusere skadevirkninger.
Spesial AT-rike bindende protein (SATB1) er en global kromatin arrangør som regulerer genuttrykk og er involvert i modulering av ondartede biologiske atferd av kreft [10]. Avvikende ekspresjon av SATB1 har vist seg å fremmes brystkreft, lungekreft og lymfom [11] – [13]. Våre tidligere undersøkelser har vist at SATB1 spiller en viktig rolle i magekreft, og kan være en uavhengig prognose markør for magekreft [14], [15]. Undertrykke uttrykk for SATB1 ved å levere siRNA eller plasmid koding spesifikk konflikt kort harpin RNA (shRNA) mot SATB1 kunne hemme spredning og invasjon, og fremme apoptose av tumorceller [16], [17]. Disse resultater antyder at SATB1 er et potensielt terapeutisk mål for magekreft.
spekulere at kombinasjonen av genterapi og kjemoterapi kan i betydelig grad forbedre terapeutisk virkning mot magekreft. I vår forrige undersøkelse, har vi utviklet en målrettet thermo co-levering system basert på termo magnetiske kationiske liposomer (TSMCL). Ved calcein utgivelsen analysen, hadde vi optimalisert thermo liposomal formulering, og deretter målt den magnetiske egenskaper og genet levering effektiviteten av TSMCL. I denne studien lastet vi doksorubicin og SATB1-shRNA vektor i dette systemet for kombinasjonen av genterapi og kjemoterapi, og undersøkt deres synergistisk antitumoreffekt mot magekreft in vitro og in vivo.
Materialer og Metoder
Material
Kolesterol, 1,2-Dipalmitoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DPPC), og 3β- [N- (N «, N»-dimethylaminoethane) -karbamoyl] kolesterol (DC-Chol) ble kjøpt fra Avanti Polar Lipids (USA). Dimetyldioktadecylammoniumklorid bromid (DOAB) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (USA). Magnetic Fluid Fe
3O
4 ble syntetisert av Galaxy Nanotech (Kina). FAM merket siRNA og plasmid pGFP-SATB1 shRNA ble levert av GenePharma (Shanghai, Kina). Doksorubicin ble kjøpt fra Hisun Pharmaceutical (Zhejiang Kina). Føtalt bovint serum (FBS), kulturmedier, penicillin /streptomycin (PEST) og trypsin ble levert fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SATB1 kanin monoklonalt antistoff var fra Epitomics (Abcam, UK). Alle andre kjemikalier var av kommersiell analytisk kvalitet og brukes uten ytterligere rensing.
Utarbeidelse av co-levering system
Dette co-levering systemet var basert på termo kationiske liposomer, som ble utarbeidet med en thermo kationisk formulering av DPPC, DC-kolesterol, DOAB og kolesterol i et molforhold av 80:5:5:10 optimalisert i våre foreløpige eksperimenter. Liposomer (TsCl) ble fremstilt ved den tynne filmen hydrering metode, etterfulgt av ekstrudering [18]. Den ammoniumsulfat gradient metoden ble brukt til å laste DOX inn TsCl (TsCl-DOX). For å fremstille magnetiske liposomer (TSMCL), magnetisk fluid Fe
3o
4 ble brukt som kjerne og ko-innkapslede med ammoniumsulfat buffer inn i liposomene. Etter dannelsen av tynn film i den rundbunnet kolbe, ble en milliliter av suspensjonen av jern og ammoniumsulfat tilsatt til hydrat film, og deretter ekstrudert gjennom polykarbonatfiltere og lastet med DOX (TSMCL-DOX) ved hjelp av ammoniumsulfat gradient metode . Til slutt ble produktene fra gelfiltreringen ble sentrifugert ved 1000 g i 15 min for å fjerne ikke-innkapslet Fe
3o
4.
pGFP-SATB1-shRNA (shSATB1) vektor ble inkubert med forskjellige liposomer i serumfritt medium ved romtemperatur i 30 min, for å fremstille TsCl-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1, respektivt.
Bestemmelse av zeta-potensialet, partikkelstørrelse, og polydispersitet
den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen og polydispersiteten av partikkelstørrelsesfordeling av liposomene ble bestemt ved 25 ° C ved dynamisk lysspredning ved anvendelse av en ZetaPALS partikkelstørrelses instrument (Brookhaven Instruments Corporation, USA). Zeta-potensialet av de liposomale dispersjonene ble målt ved å bruke samme instrument ved 25 ° C ved den elektroforetiske mobilitet.
Bestemmelse av doksorubicin belastet effektivitet
DOX-konsentrasjonen i liposomene ble målt ved hjelp av et fluorimeter ( Perkin Elmer, USA) med 485 nm eksitasjon og 590 nm emisjonsfiltre med en fortynningsserie av fritt DOX som standard. DOX lastet effektivitet ble beregnet på grunnlag av DOX konsentrasjon.
Differential Scanning Calorimetry (DSC)
DSC ble utført for å evaluere thermosensitivity av liposomer ved å bestemme faseovergangstemperaturen (Tm). Tm ble evaluert med en nano DSC (TA Instruments, USA) ved en oppvarmingshastighet på 20 ° C /t med 20 mg /ml fosfolipid.
In vitro termo DOX utgivelsen analyse
20 mL DOX inneholdende liposomer ble inkubert i 1 ml PBS og PBS med 50% føtalt bovint serum (FBS) som etterligner in vivo miljøet separat i Eppendorf-rør. Prøvene ble oppvarmet i vannbad ved 37 ° C og 42 ° C i 1 time, respektivt. Deretter fluorescensintensiteten av DOX ble målt i et fluorimeter (Perkin Eimer, USA) ved anvendelse av 485 nm eksitasjon og 590 nm emisjonsfiltre. For 100% frigjøring, ble prøvene inkubert i 1 ml PBS med 1% Triton X-100 i 1 min. De DOX utslipp prosenter ble beregnet som følger: hvor F
s var fluorescens av prøver etter oppvarming, F
0 var den første fluorescens av prøvene før oppvarming, og F
100 ble fluorescens av prøver behandlet med Triton X-100.
Cell kultur
Menneskelig gastrisk adenokarsinom MKN-28 cellelinje ble kjøpt fra keygen Biotech (Nanjing, Kina) og dyrket i høy glukose DMEM supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C.
in vitro celle transfeksjon
MKN-28 celler ble sådd i 12-brønns plater ved en tetthet på 4 x 10
5-celler /brønn og dyrket over natten til omtrent 80% konfluens. Neste dag ble cellene vasket to ganger med forvarmet PBS, deretter TsCl-shSATB1 og TSMCL-shSATB1 ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 6 timer. Celler inkubert med TSMCL-shSATB1 ble plassert på 12-brønnen magnetisk plate i løpet av de første 30 min å tilby et magnetfelt. Deretter ble inkubasjonsmediet erstattet med DMEM supplert med 10% FBS og cellene ble inkubert i 24 timer. GFP Ekspresjonsnivået ble evaluert under fluorescens mikroskop (Nikon 80i) og strømningscytometer (BD FACS Canto II).
Sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR)
Totalt RNA ble ekstrahert fra MKN-28 celler ved hjelp TRIzol regent (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens instruksjoner, ble og cDNA syntetisert ved hjelp PrimeScript RT Master MIX (Takara, Dalian). PCR ble utført ved hjelp av SYBR Premiks Ex Taq II (Takara, Dalian) på en StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Sekvensene til primerne var som følger: SATB1 forstand 5′-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 «, og 5′-antisense GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3′ GADPH forstand 5»-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 «, og 5′-antisense GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3». SATB1 mRNA nivået var normalisert til at av GAPDH.
Western blot analyse
MKN-28 celler ble høstet og lysert i RIPA buffer. Supernatantene ble samlet etter sentrifugering ved 10.000 g i 10 min. Proteinkonsentrasjonen til supernatanten ble bestemt ved bruk av en BCA Protein Assay Kit. Deretter 40 ug av prøver ble kjørt på en 15% SDS-PAGE og proteiner ble overført til PVDF-membraner. Deretter ble membranene inkubert i 5% ikke-fettmelk i 1 time for å blokkere ikke-spesifikk binding, og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med SATB1 eller β-aktin-antistoff (1:500 fortynning). Membranene ble deretter probet med HRP-konjugert geite-anti kanin sekundært antistoff i 30 min. Til slutt ble membranene visualisert med en forbedret chemiluminescence system (ECL, Pierce) og utsatt for røntgenfilm.
In vitro evaluering av cellulært opptak
For å evaluere den intracellulære plasseringen av levert DOX og pGFP-SATB1 shRNA og forbedret penetrasjon av liposomer inn i magekreftcellene ved magnetisk rettet, er en FAM merket siRNA (grønn fluorescens) ble anvendt for å etterligne pGFP-SATB1 shRNA, og DOX i seg selv besitter en instinkt rød fluorescens for å overvåke det cellulære opptak . MKN-28 celler ble sådd i 12-brønns plate ved 4 x 10
5-celler /brønn og dyrket over natten. Deretter ble cellene inkubert med fri siRNA, TsCl-siRNA, TSMCL-siRNA, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-DOX-siRNA eller TSMCL-DOX-siRNA i 6 timer. For magnetiske liposomer, ble platene plassert i en 12-brønns magnetplaten i løpet av den første timen av inkubasjon. Cellene ble visualisert under fluorescensmikroskop for å lokalisere de fluorescerende merkinger i DOX og siRNA. Kjernene ble farvet med DAPI (blå fluorescens).
MTT-analysen
MKN-28-celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
4 celler /brønn i 96-brønners plater og dyrket over natten. Cellene ble deretter inkubert med forskjellige liposomer ved 37 ° C i 2 timer i CO
2 inkubator. For magnetiske liposomer, ble platene plassert under en 96-brønns magnetplaten i løpet av de første 1 time inkubering. Neste ble cellene vasket to ganger med PBS og inkubert i 46 timer i friskt medium. Deretter ble cellenes levedyktighet målt ved MTT-analyse. Mediet i hver brønn ble erstattet med 20 ul MTT-løsning (Sigma-Aldrich, USA) og inkubert i 4 timer ved 37 ° C, og deretter ble supernatantene kassert og formazankrystaller ble oppløst i 200 ul DMSO. Platene ble målt ved 490 nm i en mikroplateavleser, og cellenes levedyktighet ble beregnet i henhold til følgende formel:
Strømningscytometri
Apoptose ble detektert ved bruk av en Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (eBioscience, USA). MKN-28 celler ble sådd i 12-brønners plater, og behandlet som beskrevet ovenfor. Etter 24 timer ble cellene oppsamlet, vasket to ganger med PBS og suspendert i 500 ul bindingsbuffer. Neste ble cellene farget med dobbel Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI). Celler i tidlig fase av apoptose farget med Annexin V-FITC men ikke farget med PI ble kvantifisert ved flyt cytometery.
Xenotransplantat musemodell
Fem til seks uker gamle mannlige Balb /c nakne mus var gitt av Center for Animal Experiments av Tongji Medical College. Hver mus ble inokulert subkutant i høyre flanke med 5 × 10
6 MKN-28 celler. Flere uker etter tumor-inokulering, ble 36 tumorbærende musene tilfeldig delt inn i seks grupper (n = 6). Musene ble injisert via halevenen med gratis DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 eller fysiologisk saltvann som kontroll. Dosen av DOX ble 2,5 mg /kg og for pGFP-SATB1 shRNA var 10 ug per mus. Behandlingen ble gitt en gang hver 3 dager og tumorstørrelse ble målt ved hjelp av en calipering og deretter tumorvolum kan beregnes ved hjelp av følgende formel: volum = (D
Min)
2 x D
max /2, der D
Max var den lengste svulst diameter og D
Min var den korteste. For TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1, ble den magnetiske målrettingen oppnås ved hjelp av en fortsettelse ytre magnetfelt på 5000 Gauss i 30 min fokusere på svulsten etter legemiddeladministrering. Alle forsøkene ble godkjent av etikkomiteen av Tongji Medical College og alle dyrene ble behandlet humant ifølge Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer.
Statistisk analyse
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Den statistiske signifikans mellom forskjellige grupper ble evaluert med t-test og en faktor-analyse av varians (ANOVA) test. For overlevelsestiden til dyrene ble Kaplan-Meier-kurver for hver gruppe etablert og log rank test ble utført for å sammenligne overlevelsesrate. p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Karakterisering av liposomer
Som vist i tabell 1, diameteren TsCl var 83,6 ± 5,7 nm, mens det av TsCl. -DOX ble øket til 118,5 ± 7,9 nm på grunn av innkapslingen av DOX. I mellomtiden ble diameteren TsCl-shSATB1 og TsCl-DOX-shSATB1 øket betydelig til 161,1 ± 11,8 nm og 238,1 ± 20,6 nm, respektivt, på grunn av adhesjon og fusjon av plasmid DNA til liposomer. For magnetiske liposomer, partikkelstørrelser på TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1 var 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm og 319,4 ± 20,1 nm, respektivt, betydelig større enn det av TsCl, TsCl-DOX, TsCl-shSATB1 og TsCl-DOX-shSATB1 på grunn av innfanging av de magnetiske nanopartikler. Videre er størrelsen på TSMCL-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1 var signifikant større enn for TSMCL og TSMCL-DOX, henholdsvis (p 0,05). Alle liposomer hadde smal størrelsesfordeling fordi deres polydispergerbarheter var ikke mer enn 0,3.
Zeta potensial TsCl, TsCl-DOX, TsCl-shSATB1 og TsCl-DOX-shSATB1 var 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 mV og 26,7 ± 4,5 mV, respektivt. Etter inkubasjon med pGFP-SATB1- shRNA, de overflateladninger redusert signifikant (p 0,05), på grunn av den elektrostatiske interaksjon mellom de kationiske lipider og plasmid-DNA. Imidlertid innfanging av magnetiske nanopartikler ikke resulterte i en signifikant reduksjon av Zeta potensial i magnetiske liposomer.
For DOX lastet effektivitet, DOX innkapslende hastigheten var 89 ± 3% og 78 ± 8% (n = 3) for henholdsvis TsCl-DOX og TSMCL-DOX, og var 85 ± 7% og 73 ± 9% (n = 3) for henholdsvis TsCl-DOX-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1,. Disse dataene indikerer at interaksjonen mellom liposomer og plasmid resulterte ikke i DOX lekkasje.
Den thermosensitivity av liposomer
Differential Scanning Calorimetry ble utført for å bestemme faseovergangstemperaturen for TsCl. Som vist på fig. 1, TsCl bestående av DPPC, DC-kolesterol, DOAB og kolesterol i et molforhold av 80:5:5:10 hadde en Tm på 40,8 ° C med en forholdsvis bredere overgang topp som kan være sammensmeltingen overgang toppen av DPPC og DOAB .
in vitro thermo DOX utgivelse fra liposomer
Som vist i fig. 2, DOX frigivelseshastigheten fra TsCl-DOX og TSMCL-DOX var bare 12% og 16% etter inkubering med PBS ved 37 ° C, og økes til 20% og 19% etter inkubering med 50% FBS, respektivt. For TsCl-DOX-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1, DOX frigivelseshastigheten var 12% og 15% etter inkubering med PBS ved 37 ° C, og var både 16% etter inkubering med 50% FBS, noe som indikerer at inkorporering av plasmidet hadde ingen signifikant effekt på stabiliteten av liposomer (p 0,05).
Frigjøringen av DOX fra forskjellige liposomer ved 37 ° C (A) og 42 ° C (B) etter inkubasjon med PBS eller 50% FBS. Verdiene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3).
DOX frigivelseshastighet fra TsCl-DOX og TSMCL-DOX ble øket til 37% etter inkubering med PBS ved 42 ° C, og økt til 45% og 49% etter inkubering med 50% FBS, henholdsvis. For TsCl-DOX-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1, DOX frigivelseshastigheten var 35% og 43% etter inkubering med PBS og FBS ved henholdsvis 42 ° C, som begge er vesentlig høyere enn ved 37 ° C (p 0,05). Disse resultatene indikerer at TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-DOX-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1 har ønskelig thermosensitivity, og kan brukes for hypertermi utløst kontroll utgivelsen av DOX.
stanse av SATB1 uttrykk i MKN-28 celler transfektert med liposomer
Neste vi evaluert effektiviteten av liposomer for å levere shSATB1 vektor i MNK-28 celler. Typiske fluorescens bilder av celler transfektert med TsCl-shSATB1 og TSMCL-shSATB1 er vist i fig. 3A. Strømningscytometri-analyse viste at transfeksjonseffektiviteten av TsCl-shSATB1 var kun 15,4 ± 0,15%. Imidlertid, etter påføring av magnetfelt veiledning, transfeksjonseffektiviteten av TSMCL-shSATB1 var 34,3 ± 0,93%, betydelig høyere enn for TsCl-shSATB1 (Fig. 3B).
(A) Fluoriserende avbildning av MKN -28 celler transfektert med TsCl-shSATB1 og TSMCL-shSATB1. (B) Kvantitativ analyse av transfeksjonseffektiviteten av TsCl-shSATB1 og TSMCL-shSATB1 ved FACS. (C) Western blot-analyse av SATB1 proteinnivå i MKN-28-celler transfektert med TsCl-shSATB1 og TSMCL-shSATB1. (D) Real-time PCR-analyse av SATB1 mRNA nivå i MKN-28 celler transfektert med TsCl-shSATB1 og TSMCL-shSATB1. Verdiene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med mock kontroll; # P. 0,05 sammenlignet med TsCl-shSATB1
For å avgjøre om det leverte shSATB1 vektor kunne mekle stanse av SATB1 uttrykk i MKN-28 celler, vi utførte Real-time kvantitativ PCR og Western blot analyse. Resultatene viste at både SATB1 mRNA og proteinnivåene reduseres i celler transfektert med TsCl-shSATB1 og TSMCL-shSATB1, sammenlignet med kontrollceller. Videre TSMCL-shSATB1 ved hjelp av magnetiske felt var mer potent enn TsCl-shSATB1 å inhibere SATB1 ekspresjon i MKN-28-celler (Fig. 3C, D).
Magnetisk målrettet in vitro- cellulære opptak
for å sammenligne gjennomføringer i cellene mellom ikke-magnetiske og magnetiske liposomer med anvendelsen av magnetiske målrettet veiledning, samt den intracellulære plasseringen av levert DOX og shSATB1, en FAM-merket siRNA ble anvendt som indikator. Fraværet av grønn fluorescens i celler behandlet med gratis siRNA indikerte at det ikke kunne trenge inn i cellene (data ikke vist). Vi har observert at flere celler behandlet med TSMCL-siRNA oppviste grønn fluorescens enn celler behandlet med TsCl-siRNA (Fig. 4A). Videre har flere celler behandlet med TSMCL-DOX viste rød fluorescens enn celler behandlet med TsCl-DOX (Fig. 4B). I celler behandlet med TSMCL-DOX-siRNA ble høy fluorescens intensitet observert, og cellene dukket opp rosa på grunn av sammenslåing av blå, rød og grønn farge (fig. 4C). Disse observasjoner tyder på at TSMCL er mer potente i å levere siRNA og DOX inn i cellene enn TsCl, etter påføring av magnetfeltet.
(A) Imaging av celler etter behandling med TsCl-siRNA og TSMCL-siRNA. (B) Imaging av celler etter behandling med TsCl-DOX og TSMCL-DOX. (C) Imaging av celler etter behandling med TsCl-DOX-siRNA og TSMCL-DOX-siRNA. (D) Typisk detaljert avbildning av plasseringen av DOX og siRNA i celler etter behandling med TSMCL-DOX-siRNA.
Videre undersøkte vi den intracellulære plasseringen av levert DOX og siRNA. Rød fluorescens ble observert i både kjernen og i cytoplasma, noe som indikerer at leverte DOX ble lokalisert i både kjernen og cytoplasmaet. I kontrast til grønn fluorescens primært dukket opp i cytoplasma, noe som tyder på at sirnas ble levert inn i cytoplasma (fig. 4D). Sammenslåingen av rødt og grønt dukket gul i cytoplasma, og sammenslåing av blå og rød dukket lavendel i kjernen. Tatt sammen indikerer disse data at både TsCl og TSMCL kan trenge inn i magekreftceller og levere sitt innhold inn i cytoplasma (DOX og siRNA) og kjernene (DOX).
In vitro anti-tumor virkningene av liposomer
Vi har evaluert in vitro antitumoreffekter av dette samarbeidet levering systemet ved cytotoksisitet og apoptoseinduksjon aktivitet. Cytotoksisiteten av liposomene ble bedømt ved MTT-analyse. For å bestemme effekten av DOX og plasmid-konsentrasjoner på cytotoksisiteten av liposomer, undersøkte vi liposomer lastet med forskjellige konsentrasjoner av DOX og forskjellige mengder av SATB1 shRNA. Med økningen av DOX konsentrering, ble cytotoksisiteten av liposomene økes (fig. 5A). Men den tillegg av SATB1 shRNA konsentrasjonen ikke føre til økt cytotoksisitet, og det ble bare litt øke av cytotoksisitet når SATB1 shRNA konsentrasjonen var omtrent 4 mikrogram (Fig. 5B). Dermed har vi brukt 25 mikrometer DOX og 4 mikrogram SATB1 shRNA å sammenligne cytotoksisitet blant Free DOX, Gratis shRNA, TsCl, TSMCL, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 og TSMCL- DOX-shSATB1.
(A) Levedyktigheten av cellene etter behandling med liposomer lastet med forskjellige konsentrasjoner av DOX. (B) Levedyktigheten av cellene etter behandling med liposomer lastet med forskjellige konsentrasjoner av shSATB1. (C) Et levedyktigheten av celler etter behandling med liposomer som angitt. Verdiene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3). (D) Den apoptose av celler etter behandling med liposomer som indikert.
Som vist i fig. 5C, gratis shRNA, TsCl og TSMCL hadde liten cytotoksisitet. Cellenes levedyktighet var 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% og 51,3 ± 4,5% for fritt DOX, TsCl-DOX og TSMCL-DOX, henholdsvis, noe som tyder på at cytotoksisiteten av TSMCL-DOX var høyere enn TsCl-DOX, men lavere enn fritt DOX . Celleviabilitet var 79,2 ± 6,9% og 71,6 ± 4,7% for TsCl-shSATB1 og TSMCL-shSATB1, henholdsvis, og viser ingen statistisk signifikans (p 0,05). For narkotika og genet co-levering, celleviabilitet var bare 35,0 ± 3,2% og 22,3 ± 3,4% for TsCl-DOX-shRNA og TSMCL-DOX-shRNA henholdsvis betydelig lavere enn for Free DOX, TsCl-DOX, TSMCL- DOX og SATB1shRNA belastede liposomer (p 0,05). I tillegg er cellelevedyktighet TSMCL-DOX-shRNA var signifikant lavere enn for TsCl-DOX-shRNA (p 0,05). Disse resultatene tyder på at en synergistisk cytotoksisitet effekt oppnås ved samtidig levere DOX og SATB1 shRNA. Dessuten, med anvendelse av magnetisk rettet, oppnås en ytterligere forbedret cytotoksisitet.
For å bestemme den ytterligere anti-tumor mekanisme i tillegg til cytotoksisiteten av co-avgivelsessystem, undersøkte vi apoptose frekvensen av MKN-28 celler behandlet med fritt DOX, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1 ved flow-cytometri. Som vist i fig. 5D, apoptose hastigheten var 22,3% i celler behandlet med fritt DOX, var 8,9% i celler behandlet med TsCl-DOX, men øket til 13,4% i celler behandlet med TSMCL-DOX og magnetiske felt. Tilsvarende apoptose Hastigheten var 9,4% i celler behandlet med TsCl-shSATB1, men øket til 17,4% i celler behandlet med TSMCL-shSATB1 og magnetiske felt. I kontrast apoptosis hastigheten var 27,7% i celler behandlet med TsCl-DOX-shSATB1, høyere enn i celler behandlet med TsCl lastet med DOX eller shSATB1 alene. Den apoptose rente var 32,4% i celler behandlet med TSMCL-DOX-shSATB1, den høyeste blant alle grupper. Disse resultater viser at co-levering DOX og SATB1 shRNA fører til kombinerte effekten av apoptose-induksjon. I et ord, oppviser denne ko-avgivelsessystem sterke anti-tumoreffekter i vitro.
in vivo anti-tumor aktivitet av liposomene
For å bestemme in vivo anti-tumoraktivitet av co-levering system, vi etablert MKN-28 murine xenograft modeller og injisert Gratis DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 eller TSMCL-DOX-shSATB1 inn musene gjennom halevenen. Behandlingen ble gitt én gang hver 3. dag, og tumorene ble dissekert (Fig. 6A). På dag 15, tumorvolumet var 0,44 ± 0,05 cm
3 i mus behandlet med TSMCL-DOX-shSATB1, betydelig lavere enn i saltgruppen (2,14 ± 0,23 cm
3), Free DOX gruppe (1.08 ± 0.13 cm
3), TSMCL-DOX gruppen (0,68 ± 0,10 cm
3), TSCML-shSATB1 gruppen (1,43 ± 0,21 cm
3), og TsCl-DOX-shSATB1 gruppe (0,77 ± 0,12 cm
3) (fig. 6B).
(A) typisk avbildning av xenopodet tumor. (B) Tumor størrelse etter behandling med gratis DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1, eller TSMCL- DOX-shSATB1, behandling med fysiologisk saltvann ble brukt som kontroll. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 6). (C) Overlevelseskurver av tumorbærende mus behandlet med gratis DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1, eller TSMCL- DOX-shSATB1, behandling med fysiologisk saltvann ble brukt som kontroll.
Dessuten, som vist i fig. 6 (C), median tid til tumorvolumet for å nå 2 cm
3 var 30 dager i TSMCL-DOX-shSATB1 gruppe, lengre enn i saltvann gruppe, Gratis DOX gruppe, TSMCL-DOX gruppe, TSCML-shSATB1 gruppe og TsCl-DOX-shSATB1 gruppe (fig. 6C). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at samtidig levere DOX og shSATB1 av TSMCL synergistisk anti-tumor effekt in vivo.
Diskusjoner
Til tross for ny utvikling i kirurgi, strålebehandling og målrette terapi, er kjemoterapi fortsatt en av de viktigste tilnærminger for magekreft terapi. Men terapeutiske effekten av kjemoterapi er ofte misfornøyd og ikke kunne forbedre prognosen for kreftpasienter [19]. En hovedårsak er tumorigenesis og progresjon av magekreft innebærer en rekke ulike mekanismer; den enhetlige antitumormekanisme av tradisjonell kjemoterapi har begrenset deres terapeutiske effekter, således en kombinasjon av kjemoterapi med genterapi kan forbedre antitumoreffekter. En annen hindring av kjemoterapi er at systemisk legemiddeladministrasjon fører til begrenset legemiddelkonsentrasjonen i tumor områder mens forårsaker mange negative effekter [8]. Nøkkelen til å løse disse problemene er avhengig av nye oppførsel av stoffet levering, derfor utvikle målrettet multi-agenter levere system som kan være direkte guidet til svulsten området med kontrollert frigjøring kan overvinne disse problemene og forbedre terapeutiske effekter [20] – [25] .
Blant ulike stoffet leveringssystemer, liposomer er mest lovende for gode biocompatibilities som forårsaker lite eller ingen antigene, allergisk, og toksiske reaksjoner, og lett gjennomgår biologisk nedbrytning. Ettersom begge legemiddel og som bærer genet, kan liposomer ikke bare beskytte verten fra uønskede virkninger av den innkapslede stoffet, men også forhindre de omsluttede innholdet fra for tidlig inaktivering av den fysiologiske medium [26]. Videre er liposom et potensielt målrettet medikamentleveringssystem, enten det er oppnådd ved forbedret permeabilitet og retensjon effekt (EPR) (Passive målrettet), eller av et magnetisk felt veiledning og immun forbindelse (Active målrettet) [27]. I tillegg er noen liposomer besitter kontrollerte utløst narkotika utslipp funksjoner, for eksempel termo følsomhet, pH følsomhet og mikrobølgeovn følsomhet.
Nylig hadde vi utviklet en ny magnetisk målrettet thermo narkotika og genet co-levering system (TSMCL). Basert på en electrothermo formulering (DPPC:Cholesterol = 80:20), hadde vi lagt forskjellige kationiske komponenter og optimalisert thermosensitivity av liposomer av calcein utgivelsen analysen. Resultatene har signalisert at vi kunne få en ønskelig thermosensitivity ved å erstatte 10 mol deler Kolesterol av 5 mol deler DC-kolesterol og 5 mol deler DOAB (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10), og calcein frigivelse fra liposomene vil være lavere ved 37 ° C, men betydelig høyere ved 42 ° C i denne formuleringen. Deretter Magnetic væske Fe
3O
4 hadde blitt brukt som kjernen og fungerte som magnetisk målretting og oppvarmingskilde TSMCL. Vibrerende Sample Magnetometer (VSM) måling hadde oppgitt at magnetisk væske Fe
3O
4 hadde vært superpara, og dermed TSMCL ville ha gode magnetiske målrettede effekter. I mellomtiden, den tidsavhengige varmekurve også hadde vist at både magnetiske fluidum Fe
3o
4 og TSMCL kan være oppvarmet fra 25 ° C til 42 ° C i løpet av 20 min. Med hjelp av magnetisk væske Fe
3O
4, både magnetisk målretting og temperatur utløst narkotika utgivelsen av TSMCL kunne realiseres. Til slutt, både TsCl og TSMCL hadde utstilt typiske liposomale morfologi og gode fordeling under TEM.
