Abstract
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er en viktig hendelse i tumorinvasjon og metastasering. Men de fleste av siste EMT studier er utført i vanlig to-dimensjonale (2D) enlagskultur. Derfor er det fortsatt uklart hva invasive fenotyper er kjøpt opp av EMT-indusert kreftceller. For å løse dette punktet, forsøkte vi å karakter EMT celler i flere fysiologiske, tredimensjonal (3D) kollagen gel kultur. EMT ble indusert ved behandling av tre humane carcinom cellelinjer (A549, Panc-1 og MKN-1) med TGF-ß. TGF-ß behandling stimulerte disse cellene til å over-uttrykke invasjon markører laminin γ2 og MT1-MMP i 2D kultur, i tillegg til induksjon av velkjente morfologiske forandring og EMT markør uttrykk. EMT induksjon forbedret cellemotilitet og klebrighet til fibronektin og kollagen i 2D kultur. Selv EMT celler viste sammenlignbar cellevekst å kontrollere celler i 2D kultur, ble deres vekstrater ekstremt undertrykt i myke agar og kollagen gel kulturer. Mest karakteristisk, EMT-indusert kreftceller ofte og kraftig utvidet invasive utstikkere i kollagen gel. Disse fremspring ble hovedsakelig støttet av mikrotubuli snarere enn aktin cytoskjelettet. Snail-introdusert, stabile EMT celler viste lignende utstikk i 3D forhold uten TGF-ß. Dessuten ble disse fremspring undertrykt av kolkisin eller inhibitorer av varmesjokkprotein 90 (HSP-90) og proteinfosfatase 2A. Imidlertid gjorde MMP-hemmere ikke undertrykke utstikket formasjonen. Disse dataene tyder på at EMT forbedrer tumorcelleinfiltrasjon inn i mellomliggende stroma ved å forlenge mikrotubul-baserte fremspring og undertrykking av celleveksten. Den forhøyede celle adhesjon til fibronectin og kollagen og høy cellemotilitet også synes viktig for tumorinvasjon
Citation. Oyanagi J, Ogawa T, Sato H, Higashi S, Miyazaki K (2012) Epitelial-Mesenchymale Transition Stimulerer humane kreftceller å forlenge microtubuli-baserte invasiv fremstående delene og undertrykker cellevekst i Collagen Gel. PLoS ONE 7 (12): e53209. doi: 10,1371 /journal.pone.0053209
Redaktør: Olivier de Wever, Ghent University, Belgia
mottatt: 23 august 2012; Godkjent: 27 november 2012; Publisert: Per 31. desember 2012 |
Copyright: © 2012 Oyanagi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-i-Aid (23112517 og 23300351) for Scientific Research fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) De organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
som normale epitelceller, ductal carcinoma celler
in situ
opprettholde celle polaritet, som er støttet av celle-celle-kontakt og celleadhesjon til basalmembran. I løpet av kreft progresjon, noen karsinomceller miste cellen polaritet og invaderer gjennom basalmembran og deretter inn i bindevev. Dette fenomenet er referert til som epitelial-mesenkymale overgang (EMT) og antas å være en viktig hendelse av kreft progresjon [1] – [3]. EMT er kritisk ikke bare for mange utviklingstrinn som gastrulation og neural crest dannelse, men også for patologiske hendelser som sårheling og vev fibrose [1], [3], [4]. EMT er generelt preget av tapet av epitel markør E-cadherin, oppregulering av mesenchymale markører som N-cadherin og vimentin, og oppkjøpet av fibroblast-lignende spindel celle form i monolagkulturer [4].
EMT av kreftcellene induseres typisk ved TGF-ß [5], men andre vekstfaktorer og microenvironmental faktorer, slik som HGF, EGF og FGF, er også i stand til å indusere eller fremme lignende fenotypiske forandringer avhengig av celletyper [1] , [3], [6]. TGF-ß utøver flere biologiske aktiviteter på utvikling og vekst, differensiering, ekstracellulære matrise produksjon og apoptose av normale celler og kreftceller [7]. TGF-ß er en negativ vekst regulator av normale epitelceller. Mens TGF-ß undertrykker tumor cellevekst i tidlige stadier av kreftutvikling, det fremmer tumorprogresjon i senere stadier [7]. Det har lenge vært kjent at TGF-ß i en kombinasjon med andre faktorer som TGF-α og EGF, fremmer forankrings-uavhengig vekst av normale fibroblaster [8]. EMT-induserende aktivitet av TGF-ß er hovedsakelig mediert av Smad vei, en stor sti av komplekse TGF-ß-signaler, som fremmer uttrykk av EMT-relaterte transkripsjonsfaktorer inkludert Snail, Slug, Twist, og ZEB 1/2 [ ,,,0],6]. Disse transkripsjonsfaktorer binder til E-box bindende elementer av promotersekvenser og undertrykke ekspresjon av E-cadherin ved en transkripsjonsnivå [9], [10].
EMT i kreftceller øker ekspresjonen av invasion- eller metastase -relaterte gener som matriksmetalloproteinaser (MMP). Vår nylig studie viste at tumorinvasjon markør laminin γ2, så vel som MMP-9, blir indusert av EMT induksjon av magekreftceller [11]. Andre nylige studier har antydet at EMT-induserte kreftcellene har resistens mot anti-kreft legemidler og radioaktivitet [12] og har kreft stamcelle-lignende egenskaper [13]. Til tross for et antall av tidligere studier på EMT av kreftceller, er det imidlertid ikke klart hvordan EMT bidrar til tumorinvasjon og metastase og hva invasiv fenotyper blir overtatt av EMT-induserte kreftceller. Dette er i det minste delvis på grunn av det faktum at de fleste EMT studier er blitt utført i den konvensjonelle to-dimensjonale (2D) kultursystemet. Det er blitt klart at celler dyrket i flat 2D kulturen vesentlig forskjellige fra de som var dyrket i tre-dimensjonal (3D) kultur i cellemorfologi, proliferasjon, differensiering, celle-celle-interaksjon, celle-matriks interaksjoner og genekspresjon [14], [15 ]. For å forstå den patologisk konsekvens av EMT av kreftceller, synes det viktig å karakterisere EMT-induserte celler i en mer fysiologisk 3D kultursystemet.
I denne studien vi karakterisert EMT-induserte kreftceller i både 2D monolagskultur og 3D kollagen gel kultur, ved hjelp av tre cellelinjer. Vi fant ut at EMT-induserte celler viste fremtredende forlengelse av mikrotubulidynamikk baserte invasive fremspring og veksthemming i 3D kollagen gel kultur.
Resultater
EMT Induksjon av tre humane kreftcellelinjer
for å undersøke fenotypiske endringer indusert av EMT av kreftceller, vi brukte modeller av tre humane kreftcellelinjer. Vi har tidligere rapportert at TGF-ß og TNF-a synergistisk indusere EMT i serum-fri kultur av MKN-1 humane magecancerceller [11]. Det har blitt rapportert at lunge adenokarsinom-cellelinje A549 [17] og bukspyttkjertelkreft cellelinje Panc-1 [16] gjennomgå EMT ved behandling med TGF-ß. I denne studien vi først testet tre cytokiner (TGF-ß, TNF-a og EGF) for EMT induksjon av A549 og Panc-1 celler, analysere ekspresjon av noen tumorinvasjon markører, så vel som EMT markører. I begge cellelinjer, ble bare TGF-ß som kreves for å indusere EMT som bedømmes av mesenchymale morfologisk endring (fig. S1), så vel som reduksjon av E-cadherin ekspresjon og induksjon av vimentin (Fig. 1A og B). TGF-ß også simulert ekspresjonen av to tumorinvasjon markører, MT1-MMP og laminin γ2 kjede, i begge cellelinjer. Men en kombinasjon av TNF-α med TGF-ß ytterligere øket nivåene av laminin γ2 kjeden og MMP-9 i A549-celler (Fig. 1A). Den laminin γ2 kjede og MT1-MMP ble også indusert av TNF-α og /eller EGF i Panc-1-celler (Fig. 1B). I tillegg har vi funnet at selv om både TNF-α og TGF-ß ble nødvendig for EMT induksjon av MKN-1-celler i serumfritt kultur, bare TGF-ß var nødvendig i nærvær av serum (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at TGF-ß er den vanligste og potent induser av EMT for de tre cancercellelinjer, men TNF-α er også nødvendig for effektiv ekspresjon av enkelte invasjons markører, avhengig av celletyper.
A549 (A) og Panc-1 (B) celler ble inkubert i serumfritt medium med 10 ng /ml EGF, 10 ng /ml TNF-α, 10 ng /ml TGF-ß, eller TNF-α + TGF-ß . Etter 48-h inkubasjon ble betinget media (CMS) og cellelysatene forberedt og utsatt for immunoblotting for EMT markører (E-cadherin og vimentin i cellelysatene), invasjonen markør laminin y2 (CMS), MT1-MMP (cellelysater ), og aktin som den interne lastekontroll (cellelysatene). Den laveste panelene viser gelatin zymografi av MMP-9 og MMP-2 i CMS. Verdier i parentes indikerer omtrentlig molekylstørrelsen i kDa. Andre eksperimentelle forhold er beskrevet i materialer og metoder.
Effekt av EMT Induksjon på celle adhesjon og migrasjon i enlagskultur
Som vist ovenfor, TGF-ß effektivt indusert EMT i tre forskjellige carcinoma-cellelinjer. Deretter undersøkte vi hva fenotyper ble kjøpt av EMT induksjon av kreftceller for deres invasiv vekst. Først ble celleadhesjon aktivitet av A549-celler undersøkt etter EMT induksjon, ved hjelp av tre celle adhesjons-substrater, laminin-332, fibronektin og type I kollagen. Cellene ble forbehandlet med TGF-ß i 24 timer og deretter sådd på følgende substrater. Som vist i fig. 2A og 2B, ubehandlede kontrollceller mest effektivt holdt laminin-332. TGF-ß behandling bare litt redusert celle vedheft til laminin-332. I motsetning til dette, den betydelig økte celleadhesjon effektiviteten til den stromale substrater fibronektin og type I kollagen. Den elektriske time-lapse celleadhesjon analysen viste klart EMT-induserte forandringer i celleadhesjonen aktivitet av A549-celler til fibronektin og type I kollagen (Fig. 2C). Disse endringene ble også observert i Panc-1 og MKN-1 celler (data ikke vist).
(A og B) En nittiseks-brønns plate ble belagt med 2 mg /ml laminin-332 (Lm332 ), 5 pg /ml fibronektin (FN), og 2 ug /ml kollagen i (Kol i) ved 4 ° C over natten, og deretter blokkert med 1,2% BSA i 1 time ved 37 ° C. A549 celler ble inkubert med 10 ng /ml TGF-ß i serumfritt medium i 24 timer. De TGF-ß-behandlede celler (TGF-ß) og ubehandlede celler (kontroll) ble suspendert og inokulert på platen. Etter inkubering i 30 minutter, ble fase-kontrast bilder tatt (A) og celleadhesjon aktivitet ble målt (B). En skala bar indikerer 50 mikrometer. De relative antall festede celler ble bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Hver søyle viser gjennomsnitt ± SD av heftende celler i tre eksemplarer brønner. (C) Elektrisk time-lapse celle adhesjon analysen med E-plater. Platen ble forhåndsbelagt med fibronektin (○, •) og kollagen (□, ▪) som vist ovenfor, og adhesjonen av TGF-ß-behandlede celler (TGF-ß: •, ▪) og ubehandlede celler (kontroll: ○, □) til platen ble målt hvert 5 min. Celleindeks angir en vilkårlig enhet reflekterende festing og utspredning av cellene på microelectrode matrise i bunnen av brønnene. Andre eksperimentelle betingelser er beskrevet i Materialer og Metoder.
For det andre, cellemigrasjon aktivitet ble undersøkt ved anvendelse av to forskjellige analyser. I
in vitro
sårheling assay, TGF-ß i betydelig grad fremmet cellemigrering av A549 og Panc-1-celler i fravær av TNF-α under serum supplert betingelser (Fig. 3A og B). TNF-α ikke har ytterligere virkning på cellemigrering aktivitet (data ikke vist). Når cellemigrering ble analysert ved hjelp av time-lapse videomikroskopi, ble celle motilitet forsterket av TGF-ß behandling tydeligere vist med de to cellelinjer (Fig. 3C). Vi bekreftet også at TGF-ß-behandlingen økte motiliteten av MKN-1-celler i den til sårheling analyse (data ikke vist).
(A og B) For å måle cellemigrering aktivitet, A549 (venstre paneler) og Panc-1 (høyre panel) celler ble underkastet
in vitro
sårheling assay i nærvær eller fravær (kontroll) av TGF-ß, som beskrevet i teksten. Fasekontrastmikrografer av kulturene ble tatt etter 16 timers inkubering. Svarte brutte linjer indikerer innledende sårkantene. Scale bar, 50 mikrometer. B) Cell migrasjon område ble beregnet ved å analysere piksel med bilde J. Hver søyle viser gjennomsnitt ± SD for områdene migrerte celler i 3 forskjellige felt (høyre panel). (C) Celler som var blitt forbehandlet uten eller med TGF-ß i 24 timer ble inkubert i 1% FBS-inneholdende medium uten eller med TGF-ß på en 24-brønners plate i 6 timer ved 37 ° C. Den cellemigrering ble overvåket med en intervallvideosystem i 12 timer. Cellemigrasjon avstand ble målt i 15 tilfeldig utvalgte celler. Hver søyle viser gjennomsnitt ± SD for cellemigrasjon hastighet av 15 celler. Andre eksperimentelle betingelser er beskrevet i Materialer og Metoder.
Effekt av EMT induksjon på forankringsavhengige og-uavhengig cellevekst
For det tredje, cellevekst aktivitet av EMT-induserte celler ble undersøkt under tre forskjellige betingelser. I 2D-monolagskultur, ble TGF-ß behandling ikke påvirke veksten av MKN-1-celler og neglisjerbart eller bare svakt undertrykkes den fra A549 og Panc-1-celler (Fig. 4A). Når kolonidannelse ble undersøkt ved sparsom 2D kulturene (500 celler /35 mm skål) av A549 og PANC-1-celler, var det ingen signifikant forskjell mellom de TGF-ß-behandlede og ikke-behandlede kulturer (data ikke vist). I suspensjonskultur på ikke-klebende plater, de tre cellelinjene langsomt vokste til å danne celleaggregater eller kuler på platene. Under slike forhold, TGF-ß behandling undertrykte veksten av MKN-1-celler, men hadde ingen virkning på den av A549 og Panc-1-celler (Fig. 4B). I motsetning til dette ble det kolonidannelse av de tre cellelinjene i bløt agar kultur sterkt undertrykkes av TGF-ß behandling. Både det totale antallet kolonier og den totale kolonien området ble svært redusert i TGF-ß-behandlede cellelinjer enn den ikke-behandlede seg (fig. 4C, 4D, og S2). Imidlertid TGF-ß-behandlede Panc-1 celler som dannes forholdsvis store kolonier sammenlignet med de ikke-behandlede celler (fig. S2). Mangelen på E-cadherin-mediert celle-celle adhesjon i TGF-ß-behandlede celler kan undertrykke potensialene av cellular overlevelse og spredning i ankeruavhengig tilstand.
(A) MKN-1 (1,0 × 10
4 celler), A549 (0,5 × 10
4 celler) og Panc-1 (1,0 × 10
4 celler) ble inkubert i hver brønn inneholder 1% FBS holdig medium uten (kontroll) eller med TGF-ß på 24-brønners kulturplater i 7 dager i monolagskultur. Etter inkubering ble antallet celler målt ved hjelp av en celleteller. Hver søyle angir gjennomsnitt ± SD av cellenumrene i triplikate brønner. (B) Cellene ble dyrket i en tetthet på 1 x 10
4 celler per brønn i 24-brønners kulturplater suspensjon inneholdende 1% FBS-inneholdende medium uten (kontroll) eller med TGF-ß i 7 dager. Det relative antall av celler ble målt ved anvendelse av Dojindo celletelling kit 8. Hver søyle angir gjennomsnitt ± SD av absorbansverdier ved 485 nm i triplikate brønner. (C og D) Cellene ble inokulert ved en tetthet på 7000 celler pr 35 mm skål i 10% FBS-inneholdende myk agar medium uten (kontroll) eller med TGF-ß og inkubert i 10 (MKN-1) eller 14 (A549 og Panc-1) dager. Etter inkubering ble cellene farget med
p
-iodonitrotetrazolium fiolett, og det totale antallet kolonier (C) og total koloni område (D) ble bestemt ved bilde J og vist som det relative antall til kontroll ( 100%). Hver søyle viser gjennomsnitt ± SD i tre eksemplarer brønner. Andre eksperimentelle forhold er beskrevet i materialer og metoder.
Opptreden av EMT-induserte kreftceller i 3D Collagen Gel Kultur
Gene uttrykk
in vivo
er forskjellig fra at i monolagskultur systemet (15). Som en kultur system som etterligner
in vivo
forhold, brukte vi 3D kollagen gel kultur ytterligere å karakterisere EMT-indusert kreftceller. Kreftceller ble dyrket i kollagen gel-lag inneholdende TGF-ß og /eller andre faktorer i 7 dager. I 3D-kollagen gel, MKN-1 celler viste fremtredende membran forlengelser eller fremspring når de ble behandlet med TGF-ß (Fig. 5A og B). En lignende morfologiske forandring ble observert i A549 og Panc-1-cellelinjer (Fig. S3). Tilsetningen av TNF-α til TGF-ß-inneholdende kultur ytterligere fremmet denne morfologiske forandring bare i tilfelle av MKN-1-celler (Fig. 5B). EGF alene, noe som induserte EMT i MKN-1-celler, også indusert fremspringet dannelse i denne cellelinjen, men denne effekten ble ikke observert i A549 og Panc-1 celler. Disse resultater antyder at den morfologiske forandring er spesifikk for EMT induksjon i stedet for TGF-ß stimulering.
(A) MKN-1-celler ble inkubert i 3D kollagen med eller uten indikerte cytokiner på 3-brønners kammerobjektglass for 7 dager. Kulturmediet ble skiftet hver tredje dag. Scale bar, 50 mikrometer. (B) Etter 5 dagers inkubasjon, ble det totale antallet celleklumper og de med fremspring tellet i et midtfelt under et mikroskop, og prosentandelen av fremspring-positive celleklumper ble beregnet. Hver søyle viser gjennomsnitt ± SD av de relative antallet fremspring-positive celleklumper i tre eksemplarer brønner. (C) Etter 7 dagers inkubering, ble cellene i kollagen-gel farget med Dojindo celletelling settet 8 i 4 timer, og absorbansen ved 485 nm av hvert kulturmedium ble målt. Hver søyle angir gjennomsnitt ± SD av absorbansverdiene for i triplikate brønner. Andre eksperimentelle forhold er beskrevet i materialer og metoder.
Vi neste undersøkt om EMT induksjon trykkes cellevekst innen kollagen gel. Som befinner seg i myk agar kultur, TGF-ß sterkt undertrykkes veksten av alle cellelinjene som ble undersøkt i kollagen-gel (fig. 5C). EGF ikke eller bare svakt undertrykkes veksten av de tre cellelinjene i 3D kollagen gel. TNF-α ikke har noen betydelig tilleggseffekt i disse kulturene. Disse dataene indikerer at EMT induksjon fremmer fremtredende forlengelse av utstikkere men undertrykker cellevekst i 3D kollagen gel kulturer av de tre kreftcellelinjer.
microtubule basert Oppbygging av EMT-indusert fremstående delene i 3D Collagen Gel
For å karakterisere EMT-indusert fremspring, analyserte vi cytoskeletal endringer etter EMT induksjon av TGF-ß. Trådformede aktin (F-aktin) og mikrotubulidynamikk cytoskeletons av EMT-induserte celler ble farget av fluorescens med rhodamine phalloidine og en tubulin-spesifikt antistoff hhv. MKN-1 celler ble stimulert med TGF-ß i 2D og 3D kulturer og deretter farget for cytoskeletons (Fig.6A og B). I 2D kultur av EMT-induserte celler, robuste spennings fibre av F-aktin, så vel som mikrotubuler, støttes den unike celleformen (Fig. 6A). I 3D-kollagen gel, ble F-aktin filamenter sterkt detektert ved overflaten av sfæroide struktur i ustimulerte celler (fig. 6B). I TGF-ß-behandlede celler, ble perifere aktin filamenter funnet rundt cellen kroppen og fremspring, men stress-fibre ble sjelden funnet i fremspring. I motsetning til dette, var det mange bunter av mikrotubuli fremtredende oppdaget i midten av fremspringene i EMT-induserte celler. I kontrollceller, ble mikrotubuli jevnt fordelt i cytoplasma. Disse mønstre av cytoskeletons ble ofte funnet i MKN-1 og PANC-1-celler (data ikke vist).
MKN-1-celler ble inkubert uten (kontroll) eller med 10 ng /ml TGF-ß i serum- inneholdende medium i 2D kultur (A) eller 3D-kollagen-gel kultur (B) i 3 dager. Disse cellene ble fluorescens-farget for α-tubulin (grønn) ved hjelp av et spesifikt antistoff, F-aktin med rhodamin phalloidin (rød), og DAPI (blå). Fluorescens bilder ble oppnådd med et konfokalt mikroskop fluorescens. Andre eksperimentelle forhold er beskrevet i materialer og metoder.
For å undersøke om microtubule er et prinsipp cytoskjelettet støtte EMT-indusert fremspring, vi undersøkte effekten av visse cytoskeletal hemmere på EMT-indusert celle forlengelse i kollagen gel. Cytochalasin B og kolkisin er kjent for å inhibere både polymerisasjonen og stabilisering av F-aktin og mikrotubuli, respektivt. Når cellene ble behandlet med disse inhibitorene samtidig som den TGF-ß behandling ble celle forlengelse delvis inhibert av 1 uM cytokalasin B, men fullstendig ved 10 nM kolkisin (Fig. 7A). Når disse inhibitorer ble tilsatt 24 timer etter at TGF-ß stimulering, ble fremspringene signifikant tilbaketrukket av kolkisin etter 3-timers behandling, men ikke ved Cytochalasin B (fig. 7B). På samme måte to andre mikrotubulidynamikk hemmere vinblastin og taxol (paclitaxel) doseavhengig blokkert cellen utvidelse når de legges sammen med TGF-ß til 3D kultur (Fig. S4). Vi analyserte også effekten av visse signal hemmere på EMT-indusert celle forlengelse i kollagen gel. Den proteinfosfatase 2A (PP2A) inhibitor cantharidin og varmesjokkprotein-90 (HSP-90) inhibitor radicicol, både som hemmer stabilisering av mikrotubuli, svakt hemmet celle forlengelse (Fig. 7C). Når både cantharidin og radicicol ble tilsatt i kombinasjon, ble celle forlengelse additivt trykkes. Disse dataene antyder at takkene av EMT-induserte kreftceller i 3D kollagen gel er i hovedsak støttet av mikrotubuli, og både PP2A og HSP-90 aktiviteter er nødvendig for utstikket formasjonen. Selv om aktin cytoskjelettet kreves for forlengelse av fremspring, synes det unødvendig for å opprettholde den utstikkende strukturer.
MKN-1-celler ble inkubert med 10 ng /ml TGF-ß i serumholdig medium i 3D kollagen gel kultur som beskrevet i figurene 5 og 6. For å kollagen kulturen ble tilsatt forskjellige inhibitorer, og fremspringet formasjonen ble kvantifisert 24 timer senere (A, C og D) eller 3 timer senere (B). (A) De indikerte konsentrasjoner av cytokalasin B og kolkisin ble tilsatt til kulturmediet samtidig som den TGF-ß tilsetning. (B) Cytochalasin B (5 uM) og colchicin (1 uM) ble tilsatt i dyrkningsmediet etter inkubering med TGF-ß i 24 timer. (C) MKN-1-cellene ble behandlet uten (kontroll) eller med cantharidin (1 uM) og /eller radicicol (1 uM) som beskrevet i (A). (D) MKN-1-celler ble forbehandlet med 10 ug /ml av hver nøytral antistoff ved 37 ° C i 30 minutter, og de forbehandlede celler ble innleiret i collagen-gel inneholdende 10 ug /ml av den indikerte anti-integrin-antistoff og 10 ng /ml TGF-ß. Alle disse inhibitorene var ikke cytotoksisk i det minste under de ovenfor angitte eksperimentelle betingelser, som analysert ved trypan blå farging. Men ble tydelig cytotoksiske effekter når cellene ble inkubert med 5 mikrometer cytokalasin B eller 1fiM kolkisin i 24 timer.
De fremspring dannet i EMT-induserte kreftceller innenfor kollagen gel sterkt avvek i utseende fra den cellemorfologi i monolagskultur. Dette innebærer at interaksjonen av cellene med kollagen i 3D-miljøet er involvert i fremspring formasjonen. Denne mulighet ble undersøkt ved hjelp av anti-integrin, nøytrale antistoffer. Som forventet, anti-integrin-α2 og anti-integrin-antistoffer SS1 effektivt blokkert forlengelsen av fremspring (fig. 7D). En kombinasjon av de to antistoffene mer sterkt inhibert fremspringet formasjonen enn hvert antistoff. Disse resultatene viser at dannelsen av mikrotubulidynamikk baserte utstikkere krever både EMT-induserende cytokin og kollagen /integrin signaler.
Forskjeller fra andre invasive fremspring.
Det er vel kjent at ondartede kreftceller invadere til 3D ekstracellulære matrise ved å utvide noen typer utvekst eller projeksjon. Invadopodium er en aktin-baserte, typisk fremspring som produseres av invasive kreftceller [18]. MT1-MMP antas å være en markør for invadopodia og dens aktivitet er nødvendig for invadopodium formasjonen. For å teste om utspringene observert i EMT-indusert kreft celler inne i kollagen gel er identiske med invadopodia, undersøkte vi effekten av et bredt spekter MMP inhibitor (TAPI) på utstikket forlengelse. Når TAPI ble tilsatt samtidig med TGF-ß i kollagen kulturen, ble lite eller meget svak virkning på fremspringet forlengelse oppnådd i de tre cellelinjene som ble testet (fig. S5, A-C). I det vesentlige de samme resultatene ble oppnådd når TIMP-2, en naturlig MMP-inhibitor, ble anvendt i stedet for TAPI (data ikke vist).
Fordi Src-kinase-aktivitet er også forbundet med invadopodium formasjonen, vi neste undersøkte effekten av tre typer Src kinase hemmere, PP1 analog, SU6656 og lavendustin C, på utstikket formasjonen i 3D kollagen gel. Noen typer inhibitorene ikke undertrykke fremspringet dannelsen av MKN-1-celler (Fig. S5, D). Disse resultatene tyder på at EMT-indusert utstikket er en annen cellestruktur fra invadopodium.
microtubule baserte fremstående delene i Snail-indusert EMT Cells innenfor Collagen Gel
Som vist ovenfor, TGF-ß stimulerte kreftceller som vanligvis strekker seg mikrotubul-baserte invasive fremspring i 3D-kollagen-gel kultur. Til mer generalisere dette fenomenet, etablerte vi stabilt EMT-indusert celler ved å innføre en snegle cDNA ekspresjonsvektor inn Panc-1 celler (Snail-Panc-l). Som TGF-ß-stimulerte celler, snegle-PANC-l-celler viste spredte cellemorfologi sammenlignet med tom vektor-transfekterte kontrollceller, (Mock-PANC-1) (Fig. 8A). I samsvar med den morfologiske forandring, ble E-cadherin ekspresjon trykkes og vimentin ekspresjon ble forbedret i snegle-Panc-L-celler sammenlignet med kontrollceller (Fig. 8A). Når disse transfekterte celler ble sådd inn i 3D kollagen gel, snegle-Panc-l, men ikke Mock-Panc-1 celler utvidet mikrotubul-baserte, robuste fremspring i fravær av TGF-ß (Fig. 8B). Utvidelsen av fremspring i Snail-Panc-l-celler ble sterkt hemmet av kolkisin men neppe ved cytokalasin B (Fig. 8C og D). Disse dataene støtter også at microtubule baserte utvekst formasjon reflekterer EMT i 3D kollagen gel.
Panc-1 celler ble transfektert med en tom vektor (Mock-Panc-1) eller en snegle uttrykk vektor (Snail-Panc -1), og deres stabile transfektanter ble etablert. Disse cellene ble dyrket uten TGF-ß i 2D eller 3D-monolagskultur kollagen gel kultur. (A) Morfologi av Mock-Panc-1 (øvre panel) og snegle-Panc-1 (nedre panel) celler ble inkubert i 2 dager i 2D monolagskultur, og ekspresjon av E-cadherin, vimentin og snegl i disse celler (høyre panel ). Se figur 1 for eksperimentelle betingelser. Scale bar, 50 mikrometer. (B) Morfologi av Mock-Panc-1 (øvre panel) og Snail-Panc-1 (nedre panel) celler inkubert i 3D kollagen gel kultur i 3 dager, og deres fremspring dannelse (høyre figur). Se figur 5 for eksperimentelle forhold. Scale bar, 50 mikrometer. (C og D) Effekter av 1 pM cholchicine (C) og 5 uM cytokalasin B (D) på fremspringet dannelse i 3D kollagen gel kultur. Disse inhibitorer ble tilsatt til kulturmediet etter 24-timers inkubering med TGF-ß. Andre eksperimentelle forhold er de samme som beskrevet i figur 5 og 7B.
Vi har også sammenlignet vekstpotensialer i Anchorage-avhengige og uavhengige forhold mellom Mock-Panc-1 og Snail-Panc-l celler. Det var ingen signifikant forskjell i vekst mellom de to typer av celler i monolagskultur (Fig. 9A). I myk agar kultur, både total koloni antall og total koloni området var klart lavere i snegle-Panc-l-celler enn Mock-PANC-1 celler (fig. 9B og C), men store kolonier var mer tallrike i snegle-Panc-l celler enn kontrollcellene (fig. 9D). Den celleproliferasjon i kollagen gel var litt, men betydelig lavere i Snail-Panc-l celler enn kontrollcellene (
p
0,05) (figur 9E.)
(A) med ett lag. kultur. Mock-Panc-1 (åpen søyle) og snegle-Panc-1 (lukket kolonne) ble sådd ut i en tetthet på 1,0 x 10
4 celler pr brønn av 24-brønners plater i 10% FBS-inneholdende medium og inkubert i 7 dager. Etter inkubering ble antallet celler målt ved hjelp av en celleteller. (B-D) soft agar kultur. Mock-Panc-1 og Snail-Panc-1 celler ble dyrket i myk agar medium i 14 dager. Etter inkubering ble det totale antallet kolonier (B) og total koloni område (C) analysert ved Bilde J. De myke agar-kulturene ble fotografert og hvert typisk bilde er vist i (D). Scale bar, 500 mikrometer. Andre eksperimentelle betingelser var de samme som beskrevet i figur 4. (E) Kollagen kultur. Mock-PANC-1 og snegle-PANC-1-celler ble dyrket i 3D kollagen gel i 7 dager som beskrevet i figur 5. Etter inkubering ble det relative antall celler målt ved anvendelse av Dojindo celletelling kit 8.
Diskusjoner
i denne studien brukte vi EMT modeller av tre menneskekreft cellelinjer (A549, Panc-1 og MKN-1) for å karakterisere EMT-indusert celler i både 2D og 3D-kultur-systemer . I overensstemmelse med andre studier [16], [17], A549 og Panc-1 celler viste typiske EMT fenotyper etter behandling med TGF-ß alene 2D monolagkulturer. MKN-1-celler som kreves TGF-ß pluss TNF-α i serumfritt medium for EMT induksjon som rapportert tidligere [11], men bare TGF-ß ble pålagt i serumholdig medium. Ekspresjon av de to invasjon markører laminin γ2 og MT1-MMP var forbundet med EMT induksjonen av disse cellelinjene. Imidlertid ekspresjon av MMP-9 og laminin γ2 var mye større med TGF-ß pluss TNF-α enn TGF-ß alene [11]. Disse resultatene tyder på at oppkjøpet av invasive fenotyper av kreftceller krever TNF-α og /eller andre faktorer enn TGF-ß, selv om TGF-ß alene er nok for den morfologiske EMT induksjon.
Denne studien avdekket at EMT-induserte A549-celler mer effektivt festes til stromal celle adhesjon substrater fibronektin og type i kollagen enn ikke-induserte kontrollceller, selv om celleadhesjon til basalmembranen substratet laminin-332, ikke ble endret av EMT induksjon. Dette er i overensstemmelse med det faktum at ekspresjon av stromale ekstracellulære matriseproteiner så som fibronektin og type I kollagen er forbedret ved EMT induksjons [16]. Vi har også bekreftet den økte fibronektin produksjon i EMT-induserte celler i kultur 2D (data ikke vist). Det er sterkt ventet at EMT-indusert endring av celleadhesjon aktivitet er avhengig av den av integrin uttrykk. Videre viste vi at celle migrasjon potensialene av de tre cellelinjene i 2D kultur ble betydelig økt ved EMT induksjon, i overensstemmelse med resultatene for Panc-1 celler ble rapportert av Horiguchi et al. [17]. Disse fenotypiske endringer, som er i samsvar med det generelle begrepet EMT, ser ut til å være nødvendig for kreftcelle invasjon gjennom interstitiell stromal vev.
Denne studien avdekket store forskjeller i fenotyper av EMT-induserte kreftceller mellom 2D og 3D kulturer. For det første, den cellevekst som reaksjon på TGF-ß ble helt forskjellig mellom de to dyrkingssystemer.
