Abstract
DNA-bindende protein AT-Rich Interactive Domain 3B (ARID3B) er forhøyet i eggstokkreft og øker tumorvekst i en xenograft modell av eggstokkreft. Men relativt lite er kjent om ARID3B funksjon. I denne studien utfører vi den første genom bred skjerm for ARID3B direkte målgener og ARID3B regulert trasé. Vi identifiserte og bekreftet mange ARID3B målgener av kromatin immunoprecipitation (chip), etterfulgt av microarray og kvantitativ RT-PCR. Ved hjelp av motiv-finne-algoritmer, karakterisert vi et bindingssete for ARID3B, som er lik den tidligere kjente område for ARID3B paralogue ARID3A. Funksjonaliteten til dette spådde nettstedet ble demonstrert av Chip analyse. Vi neste demonstrert at ARID3B induserer uttrykk for sine mål i eggstokkreft cellelinjer. Vi har bekreftet at ARID3B binder seg til en epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) enhancer og øker mRNA-ekspresjon. ARID3B også binder seg til arrangøren av Wnt5A og dens reseptor FZD5. FZD5 er sterkt uttrykt i eggstokkreft cellelinjer, og er oppregulert ved eksogene ARID3B. Både ARID3B og FZD5 uttrykk økning adhesjon til ekstracellulære matriks (ECM) komponenter inkludert kollagen IV, fibronectin og vitronectin. ARID3B-økt vedheft til kollagen II og IV krever FZD5. Denne studien viser direkte at ARID3B binder målgener i en sekvensspesifikk måte, noe som resulterer i økt genekspresjon. Videre våre data tyder på at ARID3B regulering av direkte målgener i Wnt veien fremmer adhesjon av eggstokkreft celler
Citation. Bobbs A, Gellerman K, Hallas WM, Joseph S, Yang C, Kurkewich J, et al. (2015) ARID3B Direkte Regulerer Eggstokkreft Fremme Genes. PLoS ONE 10 (6): e0131961. doi: 10,1371 /journal.pone.0131961
Redaktør: Jinsong Zhang, Saint Louis University School of Medicine, USA
mottatt: 6 februar 2015; Godkjent: 08.06.2015; Publisert: 29 juni 2015
Copyright: © 2015 Bobbs et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health /National Cancer Institute R00CA133190, https://www.cancer.gov/(KDCD), Ovarian Cancer Research Fund, Liz Tilberis Scholar Award, https://www.ocrf.org/(KDCD), Eck institutt for Global Health, University of Notre Dame, Pilot Grant for Genomics Core, https://globalhealth.nd.edu/(KDCD ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i USA, er eggstokkreft den 5
th vanligste kreftformen hos kvinner, og den mest dødelige gynekologisk kreft. I 2014 er det forventet at det har vært 21,980 nye tilfeller av eggstokkreft, og 14,270 dødsfall [1]. Vi har vist at DNA-bindende protein er overuttrykt i ARID3B serøs ovarialkreft; ARID3B uttrykk i kjernen korrelerer med sykdoms tilbakefall [2, 3]. Målet med denne studien var å mechanistically identifisere direkte målgener av ARID3B som kan bidra til kreft progresjon eggstokkene.
ARID3B tilhører en familie av AT-Rich Interactive Domain (tørre) proteiner som er involvert i kromatin remodeling og regulering av genekspresjon. Disse proteinene er kjennetegnet ved de tørre DNA-bindende domene, et høyt konservert sekvens av ~ 100 aminosyrer [4]. ARID3B har en tørr domene som deler 89,9% aminosyre identitet med sin paralogue ARID3A (et B-celle aktivator opprinnelig kalt «Bright») som har forpliktende enighet eiendommen «AATTAA» [5-7]. Mobilitet skift analyser har vist at ARID3B kan binde Matrix Vedlegg Regioner som også er bundet av ARID3A fra avIgH [8]. Nylig ble det rapportert at ARID3B binder seg til Oct4 promoter og regulerer uttrykk, men en objektiv tilnærming til å identifisere direkte ARID3B målgener har ikke blitt rapportert [9].
tørre proteiner er involvert i utvikling og vevs- spesifikk genekspresjon, og avvikende ekspresjon har vært assosiert med tumorgenese [10].
Arid3b
er en viktig genet; null embryoer dø midten av svangerskapet, viser alvorlige feil i utviklingen av hjerte, nevrale vev, kraniofaciale strukturer, lem knopper, og dannelsen av den apikale endodermal ryggen [11-13]. ARID3B er overuttrykt i neuroblastom, spesielt stadium IV svulster, og samarbeider med MYCN å øke onkogene potensial og spredning [14, 15]. I serøs eggstokk-kreft, er ARID3B forhøyet [2]. Nuclear uttrykk for ARID3B korrelerer med tilbakefall av sykdommen [3]. Videre er overekspresjon av ARID3B i eggstokkreft celler akselererer tumorvekst i en xenograft modell av kreft i eggstokkene [3]. Målgenene som er regulert av ARID3B og de molekylære mekanismer som ARID3B påvirker tumorigenesis i eggstokkreft er ikke kjent.
I denne studien identifiserte vi direkte genet målene for ARID3B i eggstokkreft celler gjennom Chromatin Immunpresipitasjon (chip) etterfulgt av microarray (Chip-Chip) teknologi. Bindende regioner av ARID3B ble preget av beregnings bioinformatiske analyse og ga en svært konservert bindingssetet. Blant de målgener av ARID3B er medlemmer av EGFR, HAKK, TNF, og Wnt signalveier. Vi var spesielt interessert i ARID3B effekt på Wnt signalveien fordi ARID3B har bindende regioner i fire Wnt pathway gener: WNT5A, FZD5, APC, og MYC. WNT5A og FZD5 er overexpressed i eggstokkreft og korrelerer med dårlig prognose, og Wnt aktivitet er kjent for å regulere cellevekst og død [16-19]. Oppregulering av FZD5 og liganden WNT7A økningen tumorvekst og celleadhesjon [20]. Vi fant ut at ARID3B øker uttrykk for FZD5, APC, og MYC. Overekspresjon av FZD5 eller ARID3B i eggstokkreft celler øker vedheft til flere ECM proteiner, inkludert fibronectin og vitronectin, mens knockdown av FZD5 eller redigering av ARID3B fører til tap av vedheft til visse ECM komponenter. I tillegg knockdown av FZD5 i cellene der ARID3B er overuttrykt fører til redusert vedheft og redusert ARID3B indusert adhesjon til kollagen II, kollagen IV, og tenascin. Disse resultatene tyder på at direkte regulering av Wnt signal av ARID3B kan bidra til kreft progresjon eggstokkene.
Materialer og metoder
Cell Kultur
Cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2. OVCA429 celler (gitt av Dr. Bast, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX og er beskrevet i [21]) ble dyrket i Minimal Essential Medium (MEM). Vi fikk Skov3IP celler fra Dr. Mills, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX. Avledning av Skov3IP celler er beskrevet i Yu et al [22]. Skov3IP celler ble dyrket i McCoys 5A medier. Mediet ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Atlas, Ft. Collins, CO), 0,1 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. OVCA429 og Skov3IP celler som uttrykker ARID3B, FZD5 (pLenti-C-mGFP, Origene, Rockville, MD), eller kontrollere Red fluorescerende protein (RFP) ble opprettet som tidligere beskrevet og nivåer av ARID3B overekspresjon var lik de som ble oppnådd i våre tidligere studier ( fig 1) [23]. Redigering av ARID3B genet i OVCA429 celler ble utført ved hjelp av tilført sgRNA /Cas9 alt-i-ett uttrykk vektor målretting ARID3B (p-CRISPR-CG01, Geneocopeia, Rockville, MD). Som en kontroll for CRISPR redigert-cellelinjer ble OVCA429 celler transduced med en Cas9 nuklease uttrykk klone (CP-LvC9NU-01, Geneocopeia, Rockville, MD) og en egge sgRNA kontroll vektor (p-CRISPR-LvSG02, Geneocopeia, Rockville, MD). For FZD5 transduksjon, SKOV3-celler (ATCC, Manassas, VA, USA, # HTB-77) [24] ble benyttet i stedet for Skov3IP celler siden våre SKOV3IP celler uttrykker GFP og FZD5 ekspresjonsvektoren uttrykker GFP (pLenti-C-mGFP) . FZD5 knock-down ble oppnådd ved hjelp av en transdusert shRNA vektor (pGFP-C-shLenti, Origene, Rockville, MD). OVCAR3-celler (ATCC, # HTB-161) [25] ble dyrket i RPMI-media med 20% FBS og 10 mg /ml insulin. CAOV3 (ATCC # HTB-75) [26] og 293ft (Life Technologies, Carlsbad, CA, # R700-07) [27]-celler ble dyrket i Dubecco modifiserte Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS. IOSE398 celler (fra Dr. Stack, Harper Cancer Research Institute, Notre Dame, IN beskrevet i [28]) ble dyrket i en 1: 1 blanding av Media 199 og MCDB105, med 5% FBS og 50 mikrogram /ml gentamicin. Alle cellekultur reagenser unntatt for FBS var fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Cellelinjene ble godkjent den 1. oktober 2013 på ATCC av STR profilering.
ARID3B uttrykk ble undersøkt i foreldre, RFP-uttrykke, og 6xHis-ARID3B OVCA429 (A) og Skov3IP (B) cellelinjer, ved hjelp både QRT-PCR. (C) En western blot av foreldrenes og ARID3B-uttrykker cellelinjer bekrefter dette resultatet.
Xenotransplantat musemodeller av eggstokkreft
Alle studier ble godkjent av University of Notre Dame IACUC komité (protokoll 14-060), og ble gjennomført i samsvar med retningslinjene fra US Public Health service politikk for human omsorg og bruk av forsøksdyr. Seks uker gamle kvinnelige naken nu /nu mus (Charles River, Wilmington, MA) ble opprettholdt på Freimann Life Science senter (University of Notre Dame). I pilotstudien (4 mus per gruppe), 1×10
6 SKOV3IP-RFP eller SKOV3IP-ARID3B celler i 200 ul av fosfatbufret saltvann (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, og 11,9 mM fosfatbuffer, pH 7.4 ) ble injisert intraperitonealt (IP) inn i nakne mus. Mus ble overvåket ukentlig for tumorvekst (med en ventral og dorsal bilde hver uke). Veksten av tumorer og avbildning er rapportert i Roy, L., et al [3]. Siden IP-tumor vekstresultater i bred spredning tumor spredning, er det vanskelig å nøyaktig kvantifisere tumorvolumet for flere svulster
in vivo
. Mus ble avlivet da av
in vivo
avbildning oppdaget flere store svulster eller hvis mus viste noen tegn på sykdom, inkludert en oppblåst mage.
microarray analyse og bioinformatikk
Tre RNA prøver hver fra SKOV3IP-RFP og SKOV3IP-ARID3B ascitesvæske /peritoneal vasker ble utarbeidet [3]. Den microarray ble utført ved Notre Dame Genomics Kjerne Facility på Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 Genechip (Affymetrix, Santa Clara, CA). Sonde satt uttrykk nivåer var normalisert og oppsummert ved hjelp av GC robust multi-matrise gjennomsnitt (GCRMA) algoritme [29]. Kontroll probe sett og probe sett som var «ikke oppdages» ble filtrert ut for videre analyse. «Ikke påviselig» ble definert som probe sett som enten blir kalt «fraværende» av Affymetrix Call algoritme (manuell tittelen «Genechip Expression analyse av data analyse Fundamentals», Affymetrix, www.affymetrix.com) i alle de seks arrays, eller å ha alle dens uttrykk rapportert av GCRMA mindre enn 2,5. Analyse av betydning Mikromatriser (SAM, [30]) ble benyttet for å detektere de differensielt uttrykte gener mellom ARID3B og RFP kontroller. Ett tusen tolv probe sett ble funnet å være signifikant med en falsk funnrate (FDR) mindre enn 10%. Av disse sonde sett, ble 199 ned regulert av ARID3B. En annen, mer stringent analyse normalisert de rå mikroarray data ved RMA, og krevde en FDR på mindre enn 5%. Pathway analyse ble utført av kryssreferanser regulerte gener med tilhørende Gene Ontologi (GO) termer oppført i Ensembl database.
Chromatin immunoprecipitation fulgt av microarray (Chip-Chip)
ChIP- chip prosedyre ble utført i henhold til protokollen til Tamimi et. Al. [31]. I korthet, Ni
2 + -NTA magnetiske kuler som ble anvendt for å isolere skjæres kromatin komplekser inneholdende den (His) -6-ARID3B fusjonsprotein fra lysater. En positiv kontroll (100% inngang, ingen Ni
2 + -NTA) og negativ kontroll (H2O pluss Ni
2 + -NTA lagt til prøve) ble også inkludert. Microarray hybridisering ble utført ved hjelp av en NimbleGen Menneskelig 2.1M Deluxe Arrangøren Array følge produsentens instruksjoner som beskrevet nedenfor. Eksempel integritet for eksperimentelle chip og kontrollinngangs prøvene ble bekreftet med en Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). En mikrogram av eksperimentelle og kontrollprøver ble merket med Cy3 og Cy5-merket tilfeldige nonamers, henholdsvis (Roche NimbleGen, Inc., Madison, WI). En 34 ug prøve av hver cy-fargestoff-merket produkt ble slått sammen og hybridisert til en microarray ved 42 ° C i 16-20 timer. Mikromatriser ble vasket, tørket, og deretter skannet i en NimbleGen MS200 scanner på 2 mikrometer oppløsning. Microarray bildene ble visualisert og analysert med NimbleScan programvare v2.5 (Roche NimbleGen, Inc.).
Beregning av ARID3B bindingssetet ble oppnådd ved bruk av både MEME (University of Queensland, Brisbane, Australia [32, 33] og ALLEGRO (Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel) [34, 35]. Sekvens data av ARID3B bindende regioner som bestemmes av våre ChIP-chip eksperimenter ble hentet ved hjelp av en spesialbygd PerlScript. De øverste 50 ARID3B forpliktende språk sekvenser ble skannet for vanlige motivene ved hjelp MEME. i en parallell analyse, ble alle betydelig ARID3B forpliktende språk sekvenser sammenlignet mot en bakgrunn genom hjelp ALLEGRO.
chromatin Immunpresipitasjon (chip)
skåret kromatin ble fremstilt av 90% konfluente eggstokkkreftceller ved hjelp av Pierce Agarose ChIP Kit (Rockford, IL) og en publisert protokoll fra Cold Spring Harbor [36]. DNA skjær ble utført ved å bruke en EpiShear probesonikator (Active Motiv, Carlsbad, CA), med en serie av ti 20-sekunders pulser på 25% amplitude. Femti ug skåret kromatin ble brukt for hver immunoutfelling (IP). IP ble utført ved hjelp av en anti-ARID3B antistoff (Bethyl Laboratories, A302-564A, Montgomery, Texas) eller IgG (Pierce, Rockford, IL) og ProteinA-Agarose magnetiske kuler. En prøve av «Input DNA» ble samlet før IP for normalisering. Chip prøver ble revers-tverrbundet ved oppvarming ved 65 ° C i 4 timer i nærvær av 20 pg proteinase K og 250 mM NaCl, og renses opp ved hjelp av et standard fenol /kloroform-ekstraksjon etterfulgt av etanolutfelling.
ChIP DNA-prøver ble analysert med kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), ved hjelp av Sso Fast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). Hver brikke DNA-prøve ble sammenlignet med det aktuelle inngangs DNA-prøven. Primere ble kjøpt fra Integrerte DNA Technologies (Coral, IA), og er utformet for å flanke slått ARID3B bindingssteder:
EGFR F: CTCAAGTGTCTCATACTACC /R: GTCATTGGGCAAACCACTG
BTC F: GTCTCAGCCTCCCAAGTAGC /R: CTAACAGGTATAATGTCACAG
WNT5A F: AGTGATTCTCCTGCCTCAGC /R: TGGAAGGGATGAATTTGGTC
MYC F: GGAGGCCAGATGCATGAG /R: TAC CTA TGG CTG TTA GAA TC
FZD5 F: GCACAATGGCTCATGCTTG /R: CGCAATCTTGGCTCACTGC
APC F: CTCCTGACCTCAAGTGATCC /R: CAGTCACTGCTTATAGAATC
RIPK1 F: GTCTTGAACTCCTGACCTCG /
R: ACAGAAACTCCATGCAAACC
NOTCH2 F: GTCAGGAGTTTGAGACC /R: ACTGCAATCTCTGCCTCC
NUSAP1 F: TTCACATGCCTCATTAAGAG /R: TCCCGAGTAGCTGGGATTCC
CASP1 F: ACTCAAGCAATTCACTCACG /R: CATTCTGAGTCCAGAGCCTG
LPAR1F: TGAAGAGTTGCGTATTAAC /R: AGTTTCATGGGTGCTATACC
CENPN F: ATCTACTGTATGTCAGACAC /R: CAGGCACCCGATACCACG
CEP55: F: GCAGGAGTTCGTGATCAGAG /R: CCAGCTAATTCTGGGATCG
Gene Expression
RNA fra OVCA429 og Skov3IP celler ble isolert ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California), i henhold til produsentens instruksjoner. Komplementær DNA (cDNA) ble fremstilt av 500 ng av RNA ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Waltham, MA) som anvist. Reaksjonene ble kjørt bruker iTaq Universal sonder Supermix (Bio-Rad) eller Sso Fast EvaGreen Supermix (Bio-Rad). Alle genuttrykk primersett ble hentet fra Integrerte DNA Technologies (Coral, IA), med unntak av ARID3B (fra Life Technologies, Carlsbad, California). kvantitativ revers transkribert polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) reaksjoner ble kjørt i triplikat, og normalisert til ekspresjon av GAPDH. Primer Analyser er som følger: APC: Hs.PT.56a.3539689, ARID3B: HS01084949_g1, BTC: Hs.PT.56a.3511718, CASP1: Hs.PT.56a.39699622, CENPK: Hs.PT.56a.40187080. g, CENPN: Hs.PT.56a.22431568.g, CEP55: Hs.PT.56a.279272.g, EGFR: Hs.PT56a.20590781, FZD5: Hs.PT.56a.3585264, GAPDH: Hs.PT. 39a.22214836, MYC: Hs.PT.49a.3659201.g, NOTCH2: Hs.PT.512811432, NUSAP: Hs. PT.51.21077614, WNT5A. Hs.PT.56a.22221435
Western Blot
Hele celleproteinlysatene ble oppnådd ved lyse OVCA429 og Skov3IP eggstokkreft kreftceller i RIPA buffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% EDTA, 0,1% SDS, og 1X Halt Protease 0,05, ** – p-verdi 0,005). N = 3. Vi validert ARID3B binding til gener med Gene ontologi (GO) begreper relatert til (A) Wnt signale, (B) celledød og apoptose, eller (C) Celledeling, eller (D) EGFR signalering. (E) Lignende chip gir høy grad av serøs eggstokkreft cellelinje OVCAR3.
ARID3B endrer uttrykket av gener i viktige cellulære trasé
Neste vi konstatert hvis ARID3B uttrykk endrer uttrykk av mulige målgener. Eksogene uttrykk for ARID3B økt gener i Wnt og EGF signalveier ved QRT-PCR. I OVCA429 celler, APC, FZD5, MYC, og EGFR indusert av ARID3B. I Skov3IP cellene, øker ARID3B FZD5, MYC, BTC, og EGFR (fig 4A). Den konsekvente induksjon av FZD5 og MYC er spesielt interessant, med tanke på at begge er ofte uttrykt i høye nivåer i eggstokkreft celler sammenlignet med udødelig eggstokkene overflate epitelceller (IOSE398) (figur 4B og 4C). I tillegg fikk vi bekreftet at ARID3B induserer ekspresjon av mange spådd mål: ARID3B oppregulert NOTCH2, SORBS1, og CASP1 i Skov3IP cellelinjer (figur 4D). Disse genene ble vurdert av interesse på grunn av deres Gene Ontologi vilkår. ARID3B binder også flere metafase og centassosierte gener (tabell 1). Vi bekreftet bindingen av ARID3B til regulatoriske regioner i CEP55, CENPN, og CENPK med en helt (Fig 3C). I OVCA429 celler, CEP55 og CENPN betydelig oppregulert ved ARID3B (Fig 4E).
(A) QRT-PCR ble utført for målgener på OVCA429 og Skov3IP foreldre celler og OVCA429 og Skov3IP celler som uttrykker 6xHis-ARID3B. N = 5 (B og C) QRT-PCR ble utført på total RNA fremstilt fra IOSE398 og et panel av ovarian cancer cellelinjer for å måle ekspresjonen av antatte ARID3B målgener FZD5 og MYC. N = 3 (D) QRT-PCR-analyse på Skov3IP foreldre celler, Skov3IP-6xHis-ARID3B, og Skov3IP-RFP celler. N = 3 (E) QRT-PCR-analyse på OVCA429 foreldre celler, 6xHis-ARID3B, og RFP-uttrykke OVCA429 celler. N = 4. * = p 0,05, ** = p 0.005 (F) Western Blot hjelp lysates OVCA429, OVCA-6xHis-ARID3B, SKOV3 og Skov3-6xHis-ARID3B celler for FZD5. N = 2.
Siden Wnt signal er innblandet i mange typer svulster inkludert eggstokkreft vi undersøkt videre regulering av FZD5 av ARID3B. Oppregulering av FZD5 ble ytterligere bekreftet ved western blot (Fig 4F) hvori protein ekspresjon av FZD5 økt 9-fold i OVCA429 celler og 2,8-ganger i SKOV3-celler i respons til ekspresjon av 6xHis-ARID3B. Dette viser at ARID3B regulerer FZD5
in vitro
.
For å støtte rolle ARID3B i å regulere genuttrykket videre, ble OVCA429 celler transfektert med vektorer som uttrykker Cas9 nuklease og CRISPR guide RNA målretting ARID3B. Betydelig tap av ARID3B ekspresjon ble bekreftet ved western blot (Figur 5A) og rammeskiftmutasjoner ble verifisert ved sekvensering (data ikke vist). Uttrykk av ARID3B målgener ble målt ved hjelp av qPCR som før, sammenligne OVCA429 celler med CRISPR redigert ARID3B mot OVCA429 celler som inneholder en kontroll Cas9 og egge sgRNA vektor. Vi fant betydelig redusert uttrykk av EGFR i CRISPR redigert celler (figur 5B), og det samme for pro-apoptotiske mål Tradd og TNF reseptor TNFR2, som vår lab tidligere hadde bekreftet å være oppregulert ved ARID3B [23].
(A) Western blot hjelp hel-celle lysat fra OVCA429 og OVCA429 ARID3B CRISPR celler, med deteksjon for ARID3B. N = 2. (B) QRT-PCR ble utført for EGFR, Tradd, og TNFR2 på total RNA fra OVCA429 celler transduced med Cas9 nuklease og en kontroll egge CRISPR guide RNA, og OVCA429 celler med ARID3B redigert av målrettede CRISPR vektorer. (C) QRT-PCR ble utført for ARID3B på OVCA429-GFP og OVCA429 cellene sortert for medium ARID3B-GFP eller høy ARID3B-GFP uttrykk. (D) QRT-PCR ble utført for EGFR, Tradd, TNFR2, TNF, og TRAIL på OVCA429-GFP, OVCA429 medium ARID3B-GFP, og OVCA429 høye ARID3B-GFP celler. N = 3. * = p 0,05.
