Abstract
Bakgrunn
CD166, også kjent som aktivert leukocytt celleadhesjonsmolekyl (Alcam), blir uttrykt av forskjellige celler i en rekke vev, inkludert kreft. Imidlertid er rollen til CD166 i maligne tumorer kontroversielt, spesielt i kreft i bukspyttkjertelen. Denne studien hadde som mål å avklare hvilken rolle og betydning av CD166 uttrykk i bukspyttkjertelkreft.
Metoder
Vi utførte immunhistokjemi og flowcytometri for å analysere uttrykk for CD166 i kirurgiske bukspyttkjertelen vev og bukspyttkjertelen kreft cellelinjer . Forskjellene mellom isolert CD166 + og CD166- kreft i bukspyttkjertelen celler ble analysert ved invasjon og migrasjon analyser, og i mus xenograft modeller. Vi utførte også kvantitativ RT-PCR og microarray analyser for å evaluere uttrykket nivåer av CD166 og beslektede gener i dyrkede celler.
Resultater
Immunohistochemistry avslørte høyt uttrykk av CD166 i kreft i bukspyttkjertelen vev (12,2% ; 12/98) sammenlignet med det i normale kontroller bukspyttkjertel (0%, 0/17) (p = 0,0435). Flowcytometri indikerte at CD166 ble uttrykt i 33,8 til 70,2% av cellene i kirurgiske bukspyttkjertelen vev og 0 til 99,5% av bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Invasion og migrasjon analyser viste at CD166- kreft i bukspyttkjertelen celler viste sterkere invasive og trekk aktiviteter enn de av CD166 + kreftceller (p 0,05). På den annen side, CD166 + Panc-1 celler viste en betydelig sterkere kolonidannelse aktivitet enn den til CD166- Panc-1 celler (p 0,05).
In vivo
analyse viste at CD166 + celler fremkalt betydelig større tumorvekst enn den for CD166- celler (p 0,05) i både subkutant og ortotopiske musetumormodeller. mRNA-ekspresjon av epitel-mesenkymale overgang aktivator Zeb1 ble overuttrykt i CD166- celler (p 0,001). Microarray analyse viste at TSPAN8 og BST2 var over-uttrykt i CD166 + celler, mens BMP7 og Col6A1 var over-uttrykt i CD166- celler.
Konklusjoner
CD166 + kreft i bukspyttkjertelen celler er sterkt tumorigent, mens CD166- kreft i bukspyttkjertelen celler utviser relativt sterkere invasive og trekk aktiviteter. Disse funnene tyder på at CD166 uttrykk er knyttet til ulike funksjoner i kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation. Fujiwara K, Ohuchida K, Sada M, Horioka K, Ulrich CD III, Shindo K, et al. (2014) CD166 /Alcam Expression er karakteristisk for tumorigenitet og Invasive og Trekk Aktiviteter for kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE ni (9): e107247. doi: 10,1371 /journal.pone.0107247
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 11 april 2014; Godkjent: 08.08.2014; Publisert: 15.09.2014
Copyright: © 2014 Fujiwara et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Microarray data er tilgjengelige fra Gene Expression Omnibus (GEO) i NCBI (tiltredelse antall GSE55294)
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Grants-in-Aid fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan (Grant nummer~~POS=HEADCOMP: 23390327, 24390318, 24390319, 25670584, 25670585, 25670586, 241237) og Fukuoka Foundation for Sound Health (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/) ( https://www.sukoken.or.jp/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest dødelige menneskelige kreftformer, med en 5-års overlevelse på mindre enn 5% [1]. Denne dårlige resultatet skyldes hovedsakelig at tidlig diagnose er uvanlig og konvensjonelle behandlingsformer som for eksempel kirurgisk reseksjon, kjemoterapi og strålebehandling har begrenset effekt [1], [2]. Derfor er nye strategier sterkt behov for kreftbehandling. Nylig, har begrepet kreft stamceller (cscs) mottok betydelig oppmerksomhet. Cscs utgjør en meget liten populasjon av kreftceller som har evnen til å initiere og opprettholde tumordannelse [3]. Følgelig, målrettet behandling av denne lille cellepopulasjon i kreft kan være mer effektiv enn dagens behandling, inklusive de for kreft i bukspyttkjertelen.
CD166, også kjent som aktivert leukocytt celleadhesjonsmolekyl (Alcam), er medlem av immunoglobulin super [4]. Det er detekterbar i en rekke forskjellige celletyper, inkludert epitelceller, lymfoide celler, myeloide celler, fibroblaster, neuronale celler, hepatocytter, og benmargceller [5]. CD166 har blitt rapportert å være en markør for cscs i tykktarmskreft og prostatakreft, noe som indikerer sterk tumorgenisitet [6], [7]. Dessuten har det overuttrykk blitt rapportert som en uavhengig prognostisk markør for enkelte kreftformer [8]. På den annen side, har inhibering av CD166 er vist å forbedre invasive og trekkende aktiviteter i ovarie carcinoma og glioblastom-celler [9], [10]. I kreft i bukspyttkjertelen, har det vært data rapportert om forholdet mellom CD166 uttrykk og prognose data, men det er fortsatt kontroversiell [11] – [13]
I denne studien, vurderte vi betydningen av CD166 uttrykk. i bukspyttkjertelkreft. Vi fant ut at CD166 + kreft i bukspyttkjertelen celler utstilt sterkere tumorigenicity enn for CD166- celler, mens CD166- bukspyttkjertelen kreftceller utstilt relativt sterkere invasiv og trekk aktiviteter. Disse funnene tyder på at CD166 uttrykk er knyttet til ulike funksjoner i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen i Kyushu-universitetet (godkjenningsnummer: 24-222) og gjennomført i henhold til de etiske retningslinjene for human Genome /Gene Forskning vedtatt av den japanske regjeringen og Helsinki-deklarasjonen. Alle pasienter som tilbys signert informert samtykke godkjenne bruk av sine vev for uspesifiserte forskningsformål. Museforsøk ble godkjent av etikkomiteen av Kyushu University (godkjenningsnummer: A-24-262-0). Dyrene ble holdt under patogenfrie forhold.
Pasienter og bukspyttkjertelen vev
kreft i bukspyttkjertelen vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk pankreas reseksjon ved vår institusjon. For immunhistokjemi, ble prøver samlet inn fra 98 bukspyttkjertelkreft pasienter inkludert 62 menn og 36 kvinner med en median alder på 65,2 år (range: 36-81 år). De clinicopathological kjennetegn ved pasientene er beskrevet i Tabell 1. Total overlevelse var basert på datoen for operasjonen til dødsdato eller siste oppfølging. Prognoser ble bestemt i september 2013. Median total overlevelse var 16 måneder (variasjon: 1-135 måneder). Seksti-seks pasienter overlevde ikke for oppfølging. Tilstøtende vev til prøvene ble evaluert histologisk henhold til kriteriene for Verdens helseorganisasjon. Svulsten scenen ble vurdert i henhold til klassifiseringen av Union for International Cancer Control. Som kontroll vev, fikk vi 17 normale bukspyttkjertel vevsprøver fra intakte pancreases som ble resected for gallegang kreft, nevroendokrine svulster, eller godartet solid-pseudopapillary tumor. For flowcytometrisk analyse, ble kreft i bukspyttkjertelen vev hentet fra fem pasienter, inkludert tre menn og to kvinner med en median alder på 62,0 år (= 37-80 år), som hadde blitt resected ved vår institusjon mellom juli 2013 og november 2013.
Immunohistokjemiske prosedyrer og evaluering
CD166 ble oppdaget ved hjelp av en mus monoklonalt antistoff (klone MOG /07, 1: 450, Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK) ved inkubasjon over natten ved 4 ° C. Den EnVision system (Dako, Glostrup, Danmark) ble anvendt for å visualisere den immunfarging. Celler ble vurdert positivt immunostained når membranen eller cytoplasma ble farget. Vev uten flekker eller svake og moderate fargeintensitet i 70% og mindre enn 30% av cellene, henholdsvis, ble ansett som CD166
lav. CD166
høy ble tildelt vev med svake og moderate fargingsintensitet i ≥70% og ≥30% av cellene, henholdsvis. Snittene ble vurdert uavhengig av to etterforskere uten noen kunnskap om de kliniske funksjonene i hvert enkelt tilfelle.
Cells og kulturforhold
Menneskelige bukspyttkjertelen celler ble skilt fra kirurgiske bukspyttkjertelen vev ved hjelp av en svulst Dissosiasjon Kit (human ) og gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Umiddelbart etter dissosiasjon, ble cellene analysert ved hjelp av strømningscytometri. I tillegg analyserte vi de følgende ni bukspyttkjertelkreft cellelinjer: BxPC3, CFPac-en, SW1990, AsPC1, og CAPAN-2 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia); Panc-1 (Riken, Tsukuba, Japan); MiaPaCa2, SUIT-2, og KP-2 (Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japan). Vi har også analysert to normale pankreasgang epiteliale cellelinjer: en human primær normal pankreas epitelcellelinje, CS-PE (DS Pharma Biomedical Co., Osaka, Japan), og en immortalisert bukspyttkjertel ductal epitelcellelinje, HPDE6-E6E7 klon 6 ( en gave fra Dr. Ming-Sound Tsao, University of Toronto, Toronto, Canada). I tillegg ble det humane pankreatiske stel celler (pscs) isoleres fra frisk pankreas prøver i overensstemmelse med den utveksten metoden [14]. Den metastatisk SUIT-2 cellelinje ble tidligere etablert i vårt laboratorium [15]. Den samme metoden ble brukt til å etablere metastatisk Panc-en cellelinje. Celler ble opprettholdt som tidligere beskrevet [16].
Strømningscytometrisk analyse og celleseparasjon av immunreaktiviteten
Celler fra subsammenflytende monolagskulturer ble suspendert i fosfat-bufret saltvann (PBS) og inkubert med monoklonalt anti human Alcam-fysoerytrin (PE) (R D Systems, Minneapolis, MN), anti-human CD24-fluorescein (FITC) (eBioscience Inc, San Diego, CA), anti-human CD44-FITC (MBL, Nagoya, Japan), og monoklonale anti-human CD133-FITC (Ancell Corp, Bayport, MN) antistoffer. Mus immunoglobulin G1 K isotype kontroll PE (eBioscience Inc) ble brukt som en negativ kontroll. Mus lgG1 isotype kontroll K PE og anti-CD11b-FITC (Miltenyi Biotec) ble benyttet for å ekskludere museceller fra analyser. Merkede celler ble analysert ved hjelp av et strømningscytometer (EC800, Sony Biotechnology, Tokyo, Japan). For celleseparasjon, inkuberes vi magnetiske mikrokuler konjugert med anti-PE-reagens (Miltenyi Biotec) med merkede celler i 15 minutter ved 4 ° C. Merkede celler ble isolert ved å føre suspensjonen gjennom en autoMACS PRO separator (Miltenyi Biotec). Umerkede celler ble negativt valgt og samlet inn av uttømming metoden gjennom autoMACS PRO separator.
Matrigel invasjonen og migrasjonsanalyser
invasivitet av kreft i bukspyttkjertelen celler ble vurdert av antall celler som invaderte gjennom Matrigel (20 ug /brønn, BD Biosciences, Bedford, MA) -belagt Transwell kamre med 8-mikrometer porer (BD Biosciences) som beskrevet tidligere [16], [17]. Kreftceller (5 × 10
4 celler /0,25 ml) ble sådd i forkamrene og ruges i 24 timer (Panc-1 celler) 48 h (SW1990 celler) eller 72 h (Suit-2 celler). Kreftceller som migrerte til den nedre overflate av membranene ble fiksert med 70% etanol, farget med hematoksylin og eosin (H ble 20 celler tellet og avbildes under et lysmikroskop. Forsøket ble utført to ganger.
Heft analysen
vedheft analysen ble utført som beskrevet i en tidligere studie [12] med mindre modifikasjoner. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
6 celler /brønn i 24-brønners plater (Becton Dickinson Labware). Etter 60 minutter ble cellene vasket med PBS for å fjerne ikke-adherente celler. Klebe Cellene ble farget med krystallfiolett og tellet under et lysmikroskop. Alle betingelser ble testet i fire eksemplarer, og forsøket ble utført to ganger.
In vivo eksperimenter
Fem uker gamle hunn nakne mus ble implantert subkutant eller orthotopically med kreftceller suspendert i 100 ul PBS som tidligere beskrevet [19]. Tredimensjonale diametre ble målt for å beregne tumorvolumet. Musene ble avlivet på den angitte dag og de subkutane eller ortotopiske tumorer ble skåret ut og veiet. For flowcytometrisk analyse, ble kreftceller dissosiert bruker Tumor Dissosiasjon Kit (human) og gentleMACS Dissociator.
stanse av CD166 uttrykk av små interfererende RNA
Kreftceller på ca 90% samløpet ble transfektert med CD166-7 (SI02780169) små interfererende RNA (siRNA) (Qiagen, Tokyo, Japan) ved electroporation hjelp av Nucleofector System (Lonza, Bazel, Sveits) i henhold til produsentens instruksjoner. For å verifisere knockdown spesifisitet, brukte vi en kontroll siRNA (Qiagen). Cellene ble brukt i påfølgende forsøk på 24-144 timer etter transfeksjon.
Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved hjelp av en høy Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og DNase (Roche Diagnostics) behandling i henhold til produsentens instruksjoner. QRT-PCR ble utført ved hjelp av en QuantiTect SYBR Grønn Reverse Transcription-PCR kit (Qiagen) og CFX96 Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories). Primere ble kjøpt fra Takara Bio Inc (Tokyo, Japan). Primersekvensene er vist i tabell 2. Hver reaksjonsblanding ble først inkubert ved 50 ° C i 30 minutter for revers transkripsjon for å syntetisere første-tråd som er komplementær DNA ved priming av total RNA med en gen-spesifikk primer. PCR ble initiert ved inkubering ved 95 ° C i 15 min for å aktivere polymerase, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 20 s, og 72 ° C i 30 sek. Gener uttrykk nivåer ble beregnet ved hjelp av en standardkurve konstruert med total RNA fra Panc-1, SUIT-2, eller spesifikke PSC avtaler. Uttrykket nivåer av gener ble normalisert til de av β-aktin som en intern kontroll, og uttrykt som forholdet mellom mål-genekspresjon p-aktin uttrykk. Alle prøver ble kjørt i triplikat, og hver prøve ble analysert på minst to ganger. Ingen påvisbare PCR produktene ble forsterket uten revers transkripsjon. Nøyaktigheten og integriteten av PCR produktene ble bekreftet ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, California).
Mikromatrise analyserer
Vi har gjennomført microarray analyser av CD166 + og CD166- celler avledet fra både Panc-1 og SW1990 cellelinjer. Kvaliteten av RNA-prøvene ble evaluert ved bruk av Agilent 2100 Bioanalyzer. A Human HT-12v4 Expression BeadChip (Illumina, San Diego, CA) ble brukt for analysene. Data ble analysert ved anvendelse av BeadStudio programvareversjon 3.2.3 (Illumina).
Statistisk analyse
Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Sammenligninger mellom to grupper ble gjort ved bruk av Student t-test. Statistisk signifikans ble definert som p 0,05. Den χ2 test ble brukt for å analysere sammenhengen mellom CD166 uttrykk og clinicopathological egenskaper observert i immunhistokjemisk undersøkelse. Overlevelse ble beregnet ved Kaplan-Meier analyse, og overlevelseskurver ble sammenlignet med log-rank test. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av JMP 9.0.2 programvare (SAS Institute, Cary, NC).
Resultater
Tilfeller av bukspyttkjertelkreft er ofte CD166
Høy
immunhistokjemisk farging for CD166 ble utført ved hjelp av kirurgisk resected bukspyttkjertelen vev (Figur 1a). I samsvar med en tidligere studie fant vi sterke CD166 flekker i øyceller og moderat farging i nerver som positive kontroller [11] – [13]. I noen tilfeller, ble CD166 uttrykt moderat i akinærceller. I 17 normale bukspyttkjertelen vevsprøver, gjorde pancreatic ductal epitelceller ikke uttrykke CD166 eller viste svak CD166 uttrykk. Alle normale pankreas vev ble identifisert som CD166
lav. I kreft i bukspyttkjertelen vev, noen kreftceller farget moderat for CD166, og vi identifisert 12,2% (12/98) av kreft i bukspyttkjertelen vev som CD166
høy. Prosentandelen av CD166
høye kreft i bukspyttkjertelen vev var signifikant høyere enn hos normale pankreatiske vev (p = 0,0435). I kreft i bukspyttkjertelen vev, fant vi at CD166 uttrykket var forbundet med perinevral invasjon (p = 0,037, Tabell S1), men ikke prognose ved hjelp av Kaplan-Meier overlevelsesanalyse (p = 0,1473, figur 1B).
(A ) Immunhistokjemisk farging for CD166 ble utført ved hjelp resected bukspyttkjertelen vev. (A) I normale bukspyttkjertelen, ble CD166 uttrykt sterkt i membranen av øyceller (svarte piler) og svakt i normale bukspyttkjertelen duktale celler (svart pilspiss). (B) I noen kreft i bukspyttkjertelen vev, kreftcellene var positive for CD166. Original forstørrelse: 200 ×. Innfellinger: 600 ×. (B) Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse viste at intensiteten av CD166-ekspresjon i kreft i bukspyttkjertelen ikke var korrelert med prognose (p = 0,1473). (C) Strømningscytometrisk analyse av CD166-ekspresjon i celler separeres basert på EpCAM uttrykk. Den positive uttrykk rate (%) er angitt for hver markør.
Vi vurderte også CD166expression i bukspyttkjertelen vev ved flowcytometri. I kreft i bukspyttkjertelen vev, den CD166 + hastigheten varierte 15,2 til 45,3% (gjennomsnitt = 29,1%). Fordi CD166 er uttrykt i ulike celletyper [5], anvendte vi epitelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM), som er uttrykt utelukkende i epitel og epitel-avledet neoplasmer, for å utelukke ikke-epitelvev fra analysen. Blant EpCAM + celler (10 til 56,5% av cellene, bety = 20,6%), den positive frekvensen av CD166 varierte fra 33,8% til 70,2% (gjennomsnitt = 47,9%) (figur 1C). Det var ingen signifikant forskjell mellom CD166 og EpCAM positivitet priser (p = 0,3488).
CD166 uttrykk i menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer
Deretter analyserte vi CD166 + rate i bukspyttkjertel kreft cellelinjer ved flowcytometri, og fant at CD166 ble uttrykt i et bredt spekter av celler (0 til 99,5%) (figur 2A). Spesielt ble ingen sammenheng funnet mellom CD166 + rente og ondartede potensialer som invasjon, migrasjon og spredning, som var i tråd med funn i en tidligere rapport (Tabell S2 og figur S1) [20]. For ytterligere å vurdere betydningen av CD166 uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen, analyserte vi SW1990 og Panc-1 celler hvorav 77,7 til 99,3% (gjennomsnitt = 86,4%) og 38,5 til 54,0% (gjennomsnitt = 46,9%) uttrykte CD166, henholdsvis. Etter separering av CD166 + og CD166- subpopulasjoner, sjekket vi CD166 uttrykk ukentlig i foreldre, CD166 +, og CD166- celler over en 6-ukers periode (Tall 2B, C). Den CD166 + rente ikke signifikant endring i CD166 + celler, mens det i begge foreldrenes og CD166- celler økes gradvis. Av notatet, hadde vi ikke observere tydelige morfologiske forskjellene mellom CD166 + og CD166- Panc-1 celler (figur 2D).
(A) CD166 positivitet priser i to normale pankreasgang epiteliale cellelinjer, bukspyttkjertelkreft cellelinjer, og bukspyttkjertelen stel celler (PSC avtaler). (B, C) SW1990 (B) og Panc-1 (C-celler) (foreldre celler) ble separert på grunnlag av CD166 uttrykket (CD166 + og CD166-) ved en autoMACS PRO separator. Endringer i CD166 uttrykk i foreldre og CD166 +/- subpopulasjoner ble overvåket ofte av flowcytometri over 6 uker. (D) Morfologi av Panc-1 celler separeres basert på CD166 uttrykk. Original forstørrelse. 40 ×
CD166- celler viser høye invasive og trekk aktiviteter, mens CD166 + celler viser en sterkere kolonidannelse aktivitet
For å utforske effekten av CD166 i kreft i bukspyttkjertelen, ulike kreftassosiert fremgangsmåter ble testet i bukspyttkjertelen cellelinjer som ble separert på grunnlag av CD166 uttrykk. Vi sammenlignet invasive og trekk evner CD166 + og CD166- celler avledet fra både SW1990 og Panc-1 cellelinjer. CD166- SW1990 og CD166- Panc-1 celler viste signifikant større celle invasjon enn for sine CD166 + celle kolleger (p 0,05, figur 3A). I tillegg CD166- celler oppviste en tydelig forhøyet vandrende potensiale sammenlignet med den til CD166 + celler fra både SW1990 og Panc-1-cellelinjer (p 0,05; figur 3B). Ved hjelp av en proliferasjonsanalyse, har vi funnet at CD166 + celler viste større proliferativ aktivitet enn den til CD166- celler fra SW1990 cellelinje (p 0,0001), men ikke CD166- celler fra Panc-1-cellelinje (figur 3C). I kolonidannelse analysen, CD166 + Panc-1 celler viste en betydelig sterkere kolonidannelse aktivitet enn den til CD166- Panc-1 celler (p 0,05, figur 3D). I sfære dannelse og heft analysene, ble det ikke funnet forskjeller mellom kapasiteten til CD166 + og CD166- Panc-1 celler (Figur 3E og 3F).
(A) Invasion analyser av CD166 + og CD166- celler avledet fra SW1990 og Panc-1-cellelinjer ble utført ved dyrking av cellene på Matrigel-belagte Transwell innsatser. Etter de angitte tidspunkter ble cellene på den nedre membran av innsatsene farget med H E (representative bilder er vist) og kvantifisert. (B) Migrasjons analyser av CD166 + og CD166- celler fra SW1990 og Panc-1 cellelinjer ble utført ved dyrking av cellene på innleggene. Etter de angitte tidspunkter ble cellene på den nedre membran av innsatsene farget med H E (representative bilder er vist) og kvantifisert. Original forstørrelse: 200 ×. (C) Spredning av CD166 + og CD166- celler avledet fra SW1990 og Panc-1 cellelinjer ble målt på angitte tider etter første seeding. (D) Kvantifisering og representative bilder av kolonidannelse kapasiteter på CD166 + og CD166- Panc-1 celler. (E) Kvantifisering og representative bilder av kulen formasjons kapasiteter på CD166 + og CD166- Panc-1 celler. (F) Kvantifisering og representative bilder av selvklebende kapasitet CD166 + og CD166- Panc-1 celler. Original forstørrelse: 40 ×. Data representerer middelverdi ± SD; *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
0,0001; NS, ikke signifikant.
CD166 + celler viser sterk tumorigenicity i mus xenograft modeller
For å evaluere effekten av CD166 på
in vivo
tumorvekst, vi subkutant transplantert CD166 + eller CD166- celler i nakne mus. Vi fant at CD166 + -celler hadde signifikant større tumorgenisitet enn den til CD166- celler avledet fra Panc-1-cellelinje (p = 0,0082; figur 4A og tabell 3). På samme måte, SW1990-avledede CD166 + -celler hadde en tendens til å generere større svulster enn de av CD166- celler, selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant (figur S2 og S3 tabell). I mus ortotopisk xenograft-modeller, tumorer avledet fra CD166 + Panc-1 celler var tyngre enn de fra CD166- Panc-1 celler (p 0,05, figur 4B). Analyse av de subkutane og ortotopiske xenograft-modeller av strømningscytometri viste at CD166 + hastigheten i tumorer fra CD166 + -celler var signifikant høyere enn i tumorer fra CD166- celler, selv om immunhistokjemi ikke viser signifikant forskjell i CD166 uttrykket (figurene 4C-F). Det var heller ingen signifikant sammenheng mellom størrelsen på svulster og CD166 + rate av celler (figur 4G).
(A) Mus ble subkutant transplantert med foreldre, CD166 +, og CD166- celler fra Panc-en celle linje (representant bilde), og svulstvolum ble regelmessig målt i 7 uker. (B) Muse orthotopic tumor xenograft modeller ble også genereres fra CD166 + og CD166- Panc-1 celler. Svulster ble skåret ut og våt veies. (C, E) Immunhistokjemisk analyse av CD166 i subkutan (C) og (E) ortotopiske tumorer avledet fra CD166 + og CD166- SW1990 og Panc-1 celler. Original forstørrelse: 100 ×. (D, F) CD166-ekspresjon ble analysert i subkutan (D) og (F) ortotopiske tumorer avledet fra CD166 + og CD166- celler ved flow cytometri. (G) Analyse av forholdet mellom tumorvekten og den positivitet frekvensen av CD166-celler i ortotopiske tumorer avledet fra CD166 + og CD166- Panc-1 celler. Alle grafene viser gjennomsnitt ± SD; *,
p
0,05, **,
p
. 0,01
CD166- celler over-uttrykke epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) aktivator Zeb1
Hong et al. rapporterte at knockdown av CD166 ved RNA-interferens ikke har noen virkning på veksten eller invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler [12]. Vi har også hemmet CD166 uttrykk av RNA interferens i bukspyttkjertelkreft cellelinje SUIT-2. Som et resultat, har knockdown av CD166 ikke påvirke invasjon, migrering, proliferasjon eller kolonidannelse aktiviteter (figurene 5A, 5B og S3A-C). For å belyse viktige faktorer understreker funksjonelle forskjeller mellom CD166 + og CD166- celler, vi neste fokusert på uttrykk for markører for EMT og bukspyttkjertelen cscs. Vi evaluerte uttrykket av EMT markører i SW1990 og Panc-1 celler ved hjelp QRT-PCR. På den primære stadium av EMT, cellene mister uttrykk for epiteliale markører, uttrykke mesenchymale markører, og få bevegelige og invasive egenskaper [21]. Nivået av Zeb1 mRNA, en EMT aktivator, var større i CD166- celler enn det i CD166 + celler, selv om det ikke var noen forskjell i mRNA-nivåer av epitel markør E-cadherin (figur 5E). Graden av N-cadherin mRNA, en mesenchymale markør, var høyere i CD166 + celler enn det som i CD166- celler. Videre er nivået av metalloproteinase 2 (MMP2) mRNA, som er relatert til celle invasivitet, ble øket i CD166- celler sammenlignet med det i CD166 + celler [22]. Deretter analyserte vi forholdet mellom CD166 uttrykk og CSC markører CD24, CD44, og CD133; men vi fant ikke noen vesentlige endringer i deres uttrykk mellom CD166 + og CD166- celler avledet fra Panc-1 celler (figur 5D) [23], [24].
(A) QRT-PCR analyse av mRNA nivåer av CD166 i SUIT-2 celler etter RNA interferens ble utført ved de angitte dager etter transfeksjon. Kontroll (siControl) eller CD166 forstummet celler (siCD166) ble analysert ved (B) kolonidannelse analyser på de angitte dager etter transfeksjon. (C) QRT-PCR-analyse av EMT markører E-cadherin, N-cadherin, Zeb-1, og MMP2 i CD166 + og CD166- Panc-1 og SW1990 celler. (D) Forholdet mellom ekspresjon av CD166 og CSC markørene CD24, CD44, CD133 og i Panc-1-cellene ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Data representerer middelverdi ± SD; *,
p
0,05; NS, ikke signifikant.
Microarray analyse viser over-uttrykk for TSPAN8 og BST2 i CD166 + celler, mens BMP7 og Col6A1 er over-uttrykt i CD166- celler
For å identifisere andre tasten molekyler som er involvert i CD166 uttrykk, utførte vi microarray analyser av CD166 + og CD166- celler fra både Panc-1 og SW1990 cellelinjer. Sammenligninger av microarray data identifisert 26 gener som ble opp-regulert av mer enn to ganger i CD166 + celler (tabell S4) og 11 gener som ble opp-regulert av mer enn to ganger i CD166- celler (tabell S5). Av disse genene, valgte vi TSPAN8, BST2, BMP7, og Col6A1 for videre analyse, fordi disse genene har blitt rapportert å være involvert i tumorigenicity eller kreft celle invasjon og migrasjon. QRT-PCR analyse ble deretter utført for å validere microarray data (figur 6A) [25] – [29]. For å evaluere effekten av CD166 knockdown på ekspresjonen av disse fire genene, ble deres mRNA-nivåer vurdert i Suit-2-celler etter RNA-interferens. Som et resultat, var det ingen signifikante endringer i uttrykket nivåer av disse genene (figur S4).
(A) QRT-PCR ble brukt til å analysere mRNA nivåer av TSPAN8, BST2, BMP7, og Col6A1, som ble funnet å være oppregulert med mer enn to ganger i CD166 + og CD166- celler i sammenligninger av microarray data. (B) Den positivitet sats på CD166 med metastatisk Panc-1 og metastatisk SUIT-2 cellelinjer ble målt ved flowcytometri. (C) QRT-PCR-analyse ble også anvendt for å undersøke CD166 mRNA-nivåer i de metastatiske cellelinjer. Data representerer middelverdi ± SD; *,
p
0,05, **,
p
0,01, ***,
p
. 0,001
For å undersøke om CD166 spiller en rolle i metastase, vi brukte to tidligere etablerte metastatisk kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer som ble generert av levermetastaser hos nakne mus xenograft modeller [15]. Disse cellelinjer, metastatisk Panc-1 og metastatisk Suit-2, viste en sterkere levermetastatisk potensiale sammenlignet med den til foreldrecellelinjer. I metastatisk Panc-en cellelinje, ble CD166 uttrykk hastigheten betydelig økt sammenlignet med den foreldre celler (99,2% vs. 46,9%, figur 6B). I SUIT-2 cellelinje, de fleste cellene uttrykte CD166 i begge foreldrenes SUIT-2 celler (99,3%) og metastatisk SUIT-2 celler (99,4%). QRT-PCR-analyse viste at nivåene av CD166 mRNA i både metastatisk Panc-1 og metastatiske Suit-2-cellene var betydelig større enn hos foreldrecellelinjer (p 0,0001 og p = 0,0015 for Panc-1 og dress-2,
