Abstract
Den nye molekylære enheten quinoxalinhydrazide derivat NVX-412 ble identifisert som en lovende medikament kandidat for behandling av ulike krefttyper på grunn av sin sterke cytotoksiske aktivitet og relativ spesifisitet. Her gir vi første dataene om virkningsmekanismer av NVX-412. Vi viser at NVX-412 utøver sin anti-neoplastisk aktivitet i en p53-uavhengig måte og induserer S-fase arrest og DNA-skade som vurderes av γH2AX farging. Vi foreslår en bi-modal (doseavhengig) Virkningsmekanismen til NVX-412, som først og fremst cytostatisk ved lavere og hovedsakelig cytotoksisk ved høyere konsentrasjoner. Basert på den brede og konsistent anti-neoplastisk aktivitet observert, har NVX-412 lovende som et effektivt medikamentkandidat for behandling av forskjellige krefttyper, spesielt for hematologiske maligniteter med høyt udekket medisinsk behov
relasjon:. Hebar A , Rütgen BC, Selzer E (2012) NVX-412, en New Oncology Drug Kandidat, induserer S-fase Arrest og DNA Damage i kreftceller i en p53-uavhengig måte. PLoS ONE 7 (9): e45015. doi: 10,1371 /journal.pone.0045015
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 24 februar 2012; Akseptert: 14. august 2012; Publisert: 13.09.2012
Copyright: © Hebar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser. ES er aksjonær og konsulent for Novelix Pharmaceuticals, Inc. Novelix Pharmaceuticals, Inc. er patentinnehaver av NXV-412 og gitt NVX-412 for denne studien. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft er en av de viktigste årsakene til dødsfall på verdensbasis. Ifølge Verdens helseorganisasjon kreft står for ca 13% av alle dødsfall i verden [1]. Til tross for omfattende investeringer, etterforskning og forskning over flere tiår, de tilgjengelige anti-kreft narkotika lå bak forventninger og derfor nye, svært aktive, godt tolerert og ideelt muntlig bio-tilgjengelige kreftlegemidler er sterkt nødvendig. Pyrazin-2-karboksylsyre N «(7-fluor-pyrrolo [1,2-α] kinoksalin-4-yl) -hydrazide-oksalsyre ko-krystall, referert til som NVX-412 (figur 1), er en lovende kandidat medikament for behandling av en rekke krefttyper. Denne nye molekylære enheten stoffet kandidatene oppfyller kriteriene for Lipinskís regel fem, noe som gir et første hint om narkotika-lignende egenskaper og om en antatt narkotika kandidat kan være egnet som legemiddel [2]. NVX-412 er en co-krystall av oksalsyre og NVX-144, dens foreldre bly sammensatte. NVX-144 oppdagelse og kjemiske strukturen ble beskrevet av Grande og kolleger [3]. Den tilhører den kjemiske klassen av quinoxalinhydrazides og ble utviklet gjennom rasjonell drug design [3]. Det faktum at NVX-144 danner en ko-krystall med oksalsyre er av spesiell interesse, ettersom Aakerøy et al. har vist at ko-krystaller av nitrogenholdige heterosykliske grupper med karboksylsyrer viser fordeler i forhold til de tilsvarende salter gjelder visse fysikalske egenskaper tigere for farmasøytiske formuleringer [4]. NVX-412 bekrefter denne oppfatningen ved å vise økt cytotoksisk aktivitet i forhold til foreldre sammensatte NVX-144 i HT-29 og HCT116 tykktarmskreft cellelinjer med en IC
50 som er 3-4 ganger lavere [3].
A: Pyrazine-2-karboksylsyre N «- (7-fluor-pyrrolo [1,2-α] kinoksalin-4-yl) -hydrazide-oksalsyre ko-krystall; Molekylær Formel: C
18H
13FN
6O
5, Molecular Vekt: 412 g /mol B: Solvent tilgjengelig mesh modell. Hvit: karbon; gul: fluor; blå: nitrogen; red: oksygen. Begge strukturene ble generert med ChemBio 3D Ultra 12,0 (CambridgeSoft, MA, USA).
Så langt er virkningsmekanismen av NVX-412 ikke kjent. Her viser vi at NVX-412 er en ny lovende anti-cancer middel som utøver sin anti-neoplastiske effekt i et bredt spekter av tumorcellelinjer av forskjellig histologisk. Vi foreslår videre at NVX-412 har en bi-modal virkningsmekanisme som primært cytostatisk på lavere og overveiende cytotoksiske ved høyere konsentrasjoner. Vi viser at NVX-412 induserer S-fase rest, så vel som DNA-skade, og en nedgang i DNA-replikasjon. Virkningsmekanismen av NVX-412 er uavhengig av p53.
Materialer og metoder
Drugs
NVX-412 (figur 1) ble hentet fra Novelix Pharmaceuticals, Inc. (La Jolla, CA, USA). For
in vitro
studier ble forbindelsen oppløst i DMSO (25 mM stamløsning lagret ved -80 ° C) og fortynnet ved de konsentrasjoner som indikert. Nutlin-3 og (S) – (+) – camptothecin (CPT) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (Wien, AUT) og løst i DMSO (aksjer: 3,5 mM og 5 mg /ml, henholdsvis). Alle løsninger ble nylaget før bruk.
NCI-60 DTP (Developmental Therapeutics Program) humane tumorcellelinje Screen
NVX-412 ble inkludert i en anti-kreft aktivitet skjermen ved National Cancer Institute (NCI) [5]. Forbindelsen ble testet mot 59 forskjellige humane tumorcellelinjer, som representerer leukemi, melanom og kreft i lunge, tykktarm, hjerne, eggstokk, bryst, prostata og nyre (for en fullstendig liste over cellelinjer henvises til Shoemaker et al. 2006 [5]). Metodikken av dette
in vitro
kreft skjermen er beskrevet i detalj på NCI nettsted (https://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html). I korte trekk ble humane tumorcellelinjer av kreft screening panel dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 5% FCS og 2 mM L-glutamin i 96-brønners plater med en tetthet som varierer fra 5000 til 40 000 celler /brønn. Etter 24 timer ble eksperimentelt legemiddel ble tilsatt ved 5 konsentrasjoner pluss kontroll og cellene ble inkubert i ytterligere 48 timer. For bestemmelse av den veksthemmende virkning av forbindelsen B en sulphorhodamine Analysen ble utført som benytter en kjemisk fiksering trinn ved slutten av medikamentbehandling, og en etterfølgende farging i 10 minutter. Etter et vasketrinn, ble absorbans bestemt ved 515 nm. Tre forskjellige doseresponsparametre blir så beregnet: vekst inhibering på 50% (GI
50), som er den legemiddelkonsentrasjon som resulterer i en 50% reduksjon i netto protein øker, medikamentkonsentrasjonen som resulterer i total vekstinhibering (TGI) og LC
50, som indikerer et netto tap av celler etter behandling [5].
Dose-responskurver av HT-29, HepG2, HeLa og HCT116 kreftceller. Celler ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av NVX-412 i 72 timer og tellet med en Beckman Coulter ViCell XR. B: klonogene overlevelse av HepG2 og HT-29 celler. HepG2 og HT-29-celler ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av NVX-412 i 12 eller 14 dager, henholdsvis. Klonogene overlevelses ble signifikant redusert på en doseavhengig måte. C: Formerinasanalyse kinetikk enn tre dager behandling med ulike konsentrasjoner av NVX-412 i HT-29 celler viser betydelig redusert spredning på 300 nM og en nedgang i celletall på 1fiM NVX-412 behandling. Data representerer middelverdier (± SD) på minst 2 uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism 5.0. * Indikerer p-verdi 0,05, indikerer **** p-verdi. 0,0001 (Toveis ANOVA)
Cellelinjer
Følgende cellelinjer var brukt i denne studien (cellelinjer fra NCI-60 DTP humane tumorcellelinje skjermen ikke inkludert): Den isogen menneskelige tykktarmskreft cellelinjer HCT116 p53 + /+ og p53 – /- og RKO p53 + /+ og p53 – /- ble kjøpt fra horisont Discovery Ltd (Cambridge, UK) og ble dyrket i McCoys 5A medium supplert med 10% FCS, 1% Pen Strep og 2 mM L-glutamin (når p53-status av HCT116-celler ikke er spesifisert p53 + /+ celler ble anvendt) . CLBL-1 (canine B-celle lymfom) [6], OSW [7] og CL-1 (canine T-cellelymfom) [8] og GL-1 (canine B-celle leukemi) [9] cellelinjer var vennlig levert av BC Rütgen (University of Veterinary Medicine, Wien, AUT), og ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FCS og 1% Pen Strep. De B-celle non-Hodgkins lymfom cellelinjer SU-DHL-6 og SU-DHL-8, kjøpt fra DSMZ (tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer, Braunschweig, GER), ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FCS og 1% Pen Strep. De samme dyrkningsbetingelser ble brukt for alle de andre lymfom- og leukemicellelinjer Raji [10], [11], Ramos, [10], [11], KG-1 [10], [12], [13], [14 ], KG-1a [14], HL-60 [10], [12], [13], BV173 [10], [11], NALM-1 [12], [13] og K562 [10], [ ,,,0],12], [13], som ber ble gitt av P. Valent (Medical University of Vienna, Wien, AUT) og er alle tidligere utgitt cellelinjer tilgjengelige enten fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) eller DSMZ . Hs27, en normal fibroblast cellelinje, ble gitt av D. Barlow (Research Center for Molecular Medicine, Wien, AUT) og ble dyrket i DMEM med 10% FCS og 1% Pen streptokokk [15], [16]. Hs578T ble dyrket i Minimum Essential Medium-α (MEM) supplert med 10% FCS, 1% Pen streptokokk og 1% L-glutamin og var en slags gave fra T. Grunt (Medical University of Vienna, Wien, AUT) [17] . Begge cellelinjer, Hs27 og Hs578T, er tilgjengelig fra ATCC. HUVEC normale humane umbilikalvene endotelceller ble anskaffet fra Lonza (Walkersville, Maryland, USA) og ble dyrket i Clonetics® EGM® BulletKit media. Menneske hvite preadipocytes (HWP) ble kjøpt fra PromoCell (Heidelberg, GER) og ble dyrket i preadipocyte vekstmedium som tilbys av selskapet. Bryst adenokarsinom-cellelinje MCF-7, cervical carcinoma-cellelinjen HeLa, den hepatocellulært karsinom-cellelinje HepG2 og kolorektal adenokarsinom-cellelinje HT-29 ble oppnådd fra ATCC og dyrket i DMEM supplert med 10% FCS og 1% Pen Strep . Hvis ikke annet er oppgitt alle cellekultur reagenser ble kjøpt fra Gibco (Grand Island, NY, USA).
HCT116, HeLa og HT-29 celler ble behandlet i inntil 72 timer som angitt. En DMSO kontroll ble utført, men viste ingen forskjeller i forhold til UTC. Etter 24, 48 og 72 timer bildene ble tatt (A, C, E). Paneler B, D og F viser kvantifisering av cellestørrelser etter 48 timers behandling med angitte konsentrasjoner av NVX-412. Boksplott representerer data av celler telles innen 5 forskjellige synsfelt. Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism 5.0. **** Tyder p-verdi 0,0001 (Mann-Whitney U test). A, B: HCT116. C, D: HeLa. E, F: HT-29. UTC, Ubehandlet kontroll; CPT, Camptothecin.
cytotoksisitetsassayer
Celler ble sådd ut i 24-brønners plater. Etter celler ble tillatt å komme seg i 24 timer, ble NVX-412 har lagt inn frisk vekst medium. Den maksimale DMSO-konsentrasjon oppnådd i alle forsøkene var under 0,01%. Respektive kontrolleksperimenter ved høyeste DMSO-konsentrasjon ble utført for å utelukke DMSO-induserte effekter. Etter 72 timers inkubasjon andelen av levedyktige celler ble bestemt ved celle telling med en Z1 Coulter partikkelteller (Beckman Coulter, Wien, AUT), en ViCell XR (Beckman Coulter, Wien, AUT) eller en CASY® celleteller (Scharfe, Reutlingen , Tyskland). Cytotoksisitet ble uttrykt som IC
50-verdier som ble avledet fra de tilsvarende dose-responskurver.
klonogene Analyser
klonogene analyser, HT-29 og HepG2-celler ble sådd ut i 60 mm retter på en tetthet på 1000 celler per tallerken. Etter 24 timer NVX-412 ble tilsatt ved de angitte konsentrasjoner. Etter dyrking i 12-14 dager (da assessable kolonier var synlige), ble kolonier fiksert i 70% etanol, farget med 0,5% krystallfiolett og telles manuelt.
Western Blot analyse for p-p53 (Ser15) i HCT116-celler etter 24 og 48 timers inkubering med 0, 0,15, 0,5 og 1 pM NVX-412 og 1 uM CPT som positiv kontroll. B: Tilsvarende immunofluorescens farging for p-type p53 (Ser15) (grønn) av HCT116-celler etter 24 timers inkubering med 0, 0,15, 0,5 og 1 pM NVX-412 og 1 uM CPT som positiv kontroll. Kjerner er farget med Hoechst 33342 (blå). C: Bekreftelse av p53 status i HCT116 p53 + /+ og p53 – /- celler ved immunblotting. Celler ble dyrket i nærvær og fravær av 375 pM 5-FU i 24 timer. D, E: Cell Numbers of HCT116 p53 + /+ og p53 – /- (D), RKO p53 + /+ og p53 – /- (E) celler etter 72 timer inkubasjon med NVX-412 eller Nutlin-3. Celler ble dyrket i 72 timer med forskjellige konsentrasjoner av NVX-412 eller Nutlin-3, respektivt. Levedyktige celler ble bestemt ved hjelp av en Beckman Coulter ViCell XR. Data representerer gjennomsnittsverdiene (± SD) av to uavhengige eksperimenter.
Proliferation Kinetics
HT-29 celler ble belagt (2 × 10
4 celler /brønn) i 24 -vel platene. Etter en gjenvinningsperiode på 24 timer ble NVX-412 tilsatt i friskt vekstmedium til endelige konsentrasjoner på 0, 300 og 1000 nM, hhv. Etter 24, 48 og 72 timer celle tall ble bestemt med en Z1 Coulter partikkelteller.
morfologi Analyser
For å undersøke mulige morfologiske endringer ved behandling med NVX-412, HCT116, HeLa og HT- 29 cellene ble sådd ut i 6-brønns plater og inkubert i opptil 72 timer med de angitte konsentrasjoner av NVX-412, DMSO som vehikkelkontroll og 1 pM camptothecin (CPT) som en positiv kontroll for apoptotisk morfologi. Kontrollforsøk ble utført for å sikre at morfologiske endringer er ikke på grunn av forskjeller i konfluens. Etter 24, 48 og 72 timer bildene ble tatt med et Olympus IX71 invertert mikroskop og kamera system (Olympus Color View III) ved 20 × forstørrelse.
Kvantifisering av cellestørrelser
Cell størrelser ble kvantifisert ved hjelp av spesialisert bildebehandlingsprogrammer (ImageJ 1.45d, amerikanske NIH, Bethesda, MD, USA). Gjennomsnittlige områder av alle celler som er tilstede i løpet av 5 forskjellige synsfelt per prøve ble bestemt etter 48 timers behandling med 0, 0,15 og 1 pM NVX-412. Den ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test ble brukt til å vurdere statistisk signifikans av forskjeller mellom cellestørrelser, fordi Kolmogorov-Smirnov test viste at dataene ikke var normalfordelt (GraphPad Prism 5.0, La Jolla, CA, USA).
A: Cellesyklus syklus~~POS=HEADCOMP analyser av flowcytometri for HT-29, HeLa og HCT116-celler behandlet i 24 timer som indikert med NVX-412 eller CPT. Prosentandeler av celler i G1, S og G2 /M-fasen av cellesyklusen er vist. Celler ble analysert under anvendelse av et FACScan BD. B: NVX-412 reduserer DNA-replikasjon i en reversibel måte i HeLa og HCT116-celler. HeLa og HCT116-celler behandlet i 24 timer som indikert. I tillegg, etter 24 timers behandling ble cellene tillatt å komme seg i 24 timer i normal vekstmedium uten NVX-412 eller CPT. DNA-replikasjon Hastigheten ble analysert ved hjelp av BrdU-inkorporering. C: Western Blot for pChk1 (Ser296) i HCT116 cellene etter 0-48 timer inkubasjon med 150 nM NVX-412. D: NVX-412 induserer γH2AX i HeLa-celler på en reversibel måte. Celler ble behandlet i 3 og 24 timer som indikert. I tillegg, etter 24 timers behandling ble cellene tillatt å komme seg i 24 timer i normal vekstmedium uten NVX-412 eller CPT. Data representerer ganger endring i gjennomsnittlig γH2AX fluorescens intensitet per kjerne (± SD) som kvantifisert fra immunfluorescens stainings. UTC, Ubehandlet kontroll; CPT, Camptothecin. Middelverdiene for minst 2 uavhengige eksperimenter er vist. Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism 5.0. **** Tyder p-verdi. 0,0001 (Toveis ANOVA)
Western Blot
Behandlet celler ble direkte lysert i NP40 cellelyse buffer (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) inneholdende protease og fosfatase-inhibitorer. Protein konsentrasjoner ble målt kolorimetrisk (D
C Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Proteiner ble separert ved hjelp av SDS – polyakrylamid gelelektroforese og blottet på nitrocellulosemembraner (Whatman ™, Wien, AUT). Lik lasting ble sjekket av Ponceau S (Serva, Heidelberg, GER) farging. Bundet antigen ble visualisert med den forbedrede chemiluminescence deteksjon system (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Disse prosedyrene ble utført i henhold til produsentens protokoller. Antistoffer som er spesifikke for de følgende proteiner av interesse ble anvendt: pChk1 (Ser296), p-p53 (Ser15), ble β-Tubulin og GAPDH erholdt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) ved 1:1000 fortynning. Sekundære antistoffer var peroksidase-merket geit anti-kanin eller anti-mus IgG (Cell Signaling Technology) (1:2000).
Immunofluorescensanalyse Farging av p-p53 (Ser15) og γH2AX (Ser139)
HCT116 og HeLa-celler ble sådd på glassdekkglass i seks-brønns plater. 24 timer etter plating ble HCT116-celler inkubert med 0,15, 0,5 og 1 pM NVX-412 og 1 uM CPT i 24 timer for farging av p-p53. For å undersøke γH2AX ble HeLa-celler inkubert med 0,21, 0,5 og 1 mikrometer NVX-412 og 1 mikrometer CPT for 3 eller 24 timer. I tillegg ble cellene tillatt å komme seg i 24 timer i normal vekstmedium etter 24 timers inkubering med NVX-412 eller CPT (utvasking eksperiment). Etter at de respektive behandlingene ble cellene vasket og fiksert med 4% metanol-fritt formaldehyd (Polysciences Inc. Warrington, PA, USA) i 15 minutter ved romtemperatur og deretter permeabilisert med 0,2% Triton X-100 /PBS i 2 minutter ved værelses temperatur. Etter blokkering med geiteserum (5%) i 1% BSA /0,3% Triton X-100 /PBS, ble den respektive primære antistoff tilsatt og cellene ble inkubert ved 4 ° C over natten. Antistoffer som ble brukt var: mus p-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) ved 1:100 fortynning og mus p-H2AX (Ser139) (Millipore, Billerica, MA, USA) ved 1:1000 fortynning i 1% BSA /PBS, respektivt. Cellene ble deretter vasket 3 ganger i 10 minutter med 0,25% BSA /0,1% Triton X-100 /PBS og inkubert med Alexa Fluor 488 konjugert sekundært anti-mus-antistoff (1:1000 i 0,25% BSA /0,1% Triton X-100 /PBS) i 1 time ved romtemperatur i mørket. Cellene ble vasket 3 ganger i 10 minutter med 0,05% Tween-20 /PBS som inneholder Hoechst 33342 (Sigma Aldrich, Wien, AUT) og montert med montering medium (Fluoprep, bioMérieux, Marcy l’Etoile, FRA). Fluorescens ble umiddelbart tatt opp på en Zeiss LSM700 laser scanning mikroskop.
Kvantifisering av γH2AX
Den vanlige prosedyren for vurdering γH2AX induksjon er å telle γH2AX foci. Siden med NVX-412 og den positive kontrollen CPT γH2AX aktivisering var at sterke, ingen skjelnes og tellbar foci ble sett. Derfor ble den gjennomsnittlige γH2AX fluorescens intensitet per kjerne bestemt. For å oppnå dette, ble γH2AX intensiteter innenfor et bestemt felt målt ved hjelp av nummer én -4.6.9 (Basic freeware versjon, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) og ble delt på antall kjerner på dette feltet.
Fastsettelse av p53 Status Dependency
isogene tykktarmskreft cellelinjer HCT116 p53 + /+ eller p53 – /- og RKO p53 + /+ eller p53 – /- ble dyrket i 12-brønners plater. Etter en gjenvinningsperiode på 24 timer, NVX-412 eller Nutlin-3 ble tilsatt i friskt vekstmedium ved de angitte konsentrasjoner. Nutlin-3, en antagonist MDM2 og p53 følgelig sti aktivator ble anvendt for å bevise de differensielle biologiske virkningene av p53-status. Etter 24 eller 72 timer celle tall ble bestemt med et Beckman Coulter ViCell XR.
DNA Replication Ranger
HeLa og HCT116-celler ble sådd ut i sort 96-brønners plater. Etter at cellene ble tillatt å komme seg i 24 timer NVX-412 eller CPT ble lagt i friskt vekstmedium. Etter 24 timers inkubasjon en kjemiluminescerende BrdU inkorporering ELISA (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) ble utført med halvparten av platene i henhold til produsentens protokoll. Celler i de resterende platene ble tillatt å komme seg i 24 timer i normal vekstmedium før DNA-replikasjon ble målt (utvasking eksperiment). For å sjekke om en mulig nedgang i DNA replikering rate er ikke bare på grunn av lavere celletall på grunn av celledød induksjon, andelen av levedyktige celler ble bestemt i parallell med en MTT-basert cytotoksisitet analysen i henhold til produsentens protokoll (EZ4U, Biomedica, Wien, Østerrike). Kolo (ved 492 og 620 nm) og kjemiluminescerende målinger ble utført ved hjelp av en FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland).
flowcytometrisk cellesyklusen Analyser
HT-29, HeLa og HCT116 cellene ble sådd ut i 6-brønns plater. Etter at cellene ble tillatt å komme seg i 24 timer, ble NVX-412 tilsatt i friskt vekstmedium ved de respektive IC
50 konsentrasjon og 0,5 og 1 pM. CPT ble anvendt ved 50 nM og 1 pM. For å analysere cellesyklusfordeling, ble cellene samlet opp etter 24 timers inkubering og vasket med PBS. Celler ble fiksert i 70% etanol i minst 2 timer. For analyse ble celler overført til PBS, inkubert med RNAse A (0,04 ug /ml endelig konsentrasjon) i 30 minutter ved 37 ° C, behandlet med 40 ug /mL propidium-jodid i 30 minutter ved 4 ° C og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri ved hjelp av BD FACScan (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA). De resulterende DNA-histogram ble kvantifisert ved hjelp ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, USA)
Statistiske analyser
Hvis ikke annet er angitt, to-veis ANOVA (variansanalyse;. GraphPad Prism 5.0) ble brukt for å vurdere den statistiske betydningen av forskjeller mellom dataene.
Resultater
NVX-412 Utøver sterk anti-neoplastisk aktivitet
for å få en uavhengig oversikt over utvalget av aktiviteten av NVX-412 (figur 1) mot et panel av godt beskrevet cancercellelinjer, er medikamentkandidat ble inkludert i en anti-kreft-aktivitet skjerm utført av NCI mot 59 forskjellige humane tumorcellelinjer som stammer fra forskjellige kreft typer. Denne skjermen viste en meget sterk og bred anticanceraktivitet av NVX-412 i tumorcellelinjer av alle krefttyper i det lave nanomolare området med en gjennomsnittlig IC
50 på ca 200 nM (tabell 1). Leukemiske cellelinjer var mest følsom med en gjennomsnittlig IC
50 av 62 nM. I tillegg til NCI-60 DTP humane tumorcellelinjeraster (se tabell 2), ble ytterligere cellelinjer avledet fra forskjellige tumortyper og to forskjellige arter, inkludert mennesker og canine-celler og også normale ikke-cancerceller testet. Etter avtale med data innhentet i NCI-skjermen, disse dataene viste anti-kreft aktivitet i alle cellelinjene som ble testet alle tvers av en rekke krefttyper. Figur 2A viser doseresponskurver for HT-29 colon adenokarsinom, HepG2 leverkreft, livmorhalskreft og HeLa HCT116 kolon karsinom celler, som er cellelinjer som benyttes for alle videre eksperimenter i denne studien. Normale humane endotelceller (HUVEC) og humane hvite preadipocytes (HWP) viste en nedsatt følsomhet i forhold til cancercellelinjer. For HUVEC celler IC
50 ble bestemt på 2,0 mikrometer og for menneske hvite preadipocytes HWP på 1,0 mikrometer, henholdsvis.
NVX-412 viser Bi-modal aktivitet og induserer morfologiske endringer
For bedre å forstå NVX-412-induserte effekter, ble cellevekst, celleoverlevelses og celledød eksperimenter utført. Klonogene overlevelsesanalyser [18] ble utført med HepG2 og HT-29-celler. Cellene ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av NVX-412 i 12 eller 14 dager, henholdsvis. Som det kan ses i figur 2B, NVX-412 redusert evne til HepG2 og HT-29-celler til å danne kolonier i en doseavhengig måte. Av notatet, til konsentrasjonen av NVX-412 oppnå halv-maksimal effekt bestemmes av klonogene analysen er lik konsentrasjonen som bestemt ved 3-dagers proliferasjonsassay. Spredningskinetikk ble bestemt over 3 dager med behandling med HT-29 colon carcinoma celler (figur 2C). På IC
50 (300 nM), proliferasjon av celler ble signifikant redusert etter 2 dager, sammenlignet med de ubehandlede kontrollceller. Ved konsentrasjoner over IC
50 (ved 1 uM), begynte celleantall å avta under antallet av cellene sådd ved begynnelsen av forsøket, noe som tyder på en direkte induksjon av celledød i tillegg til cellesyklus-stans. Videre er morfologien av celler eksponert for NVX-412 ved enten IC
50 eller høyere konsentrasjoner (1 uM) ble undersøkt i HCT116, HeLa og HT-29-celler (Figurene 3A, C, E). Behandling med NVX-412 på IC
50 ført til endringer i den morfologiske utseende av alle tre undersøkte celletyper innen 24 timer; cellene dukket opp større enn ubehandlede celler. DMSO alene som kjøretøykontrollen ikke endre morfologisk utseende (DMSO kontroll ikke vist). For å undersøke dette interessant fenomen i mer detalj, ble cellestørrelser kvantifisert etter 48 timers behandling med NVX-412. En meget betydelig økning i cellestørrelser ble observert for alle de tre testede cellelinjer (figur 3B, D, F). I løpet av de neste 48 timene en reduksjon av celletettheter kunne observeres for HCT116, HeLa og HT-29-celler. Men dette bildet endret seg dramatisk da høyere konsentrasjoner av NVX-412 ble brukt. Igjen ble cellene viste en endret morfologisk utseende og utvidet størrelse i forhold til ubehandlede celler (figur 3), men allerede etter 48 timer ble antall frittliggende og døde celler øket (data ikke vist), i likhet med behandlingen med celledød indus CPT.
NVX-412 Apg p53 status Uavhengig
for å undersøke en mulig p53 status avhengighet av NVX-412, ble fosforylering status av p53 på Ser15 bestemt [19], [20]. Immunfluorescens stainings for p53 fosforylert ved Ser15 ble utført i HCT116-celler etter 24 timers inkubering med forskjellige konsentrasjoner av NVX-412 (figur 4B). Som forventet, celler behandlet med 1 uM CPT var positive for nukleær farging av p-type p53 (Ser15), mens ubehandlede celler var tydelig negativ. Inkubasjon med IC
50 konsentrasjon av NVX-412 førte ikke til p-type p53 (Ser15) farging, mens celler behandlet med høyere konsentrasjoner (0,5 og 1 um) viste en positiv farging. Dette samsvarer med Western Blot analysen som ble utført under de samme forholdene og samtidig poeng etter 24 og 48 timer (Figur 4A). Igjen, ubehandlede celler og celler behandlet under eller på IC
50 var negative for fosforylerte p53, mens kontrollforsøk med 1 uM CPT og celler behandlet med NVX-412 ved konsentrasjoner over IC
50 viste en sterk induksjon .
for ytterligere å undersøke en potensiell p53 status avhengighet av aktiviteten til NVX-412 to forskjellige isogen cellelinje modeller med ulik sin p53 status ble undersøkt; HCT116-celler med et p53 + /+ og p53 – /- fenotype og RKO celler med et p53 + /+ og p53 – /- fenotype. P53-status av cellene ble bekreftet ved immunblotting (figur 4C). På figur 4D og 4E dose-responskurver for NVX-412 og kontroll Nutlin-3 i p53 + /+ og p53 – /- celler er vist. Det kan påvises at i begge cellelinjer, HCT116 og RKO, p53-status ikke påvirker følsomheten til NVX-412; IC50-verdiene for isogene cellelinjene var sammenlignbare. I motsetning til at responsen på Nutlin-3 viste en klar p53 status avhengighet, med p53 + /+ celler blir mye mer følsom enn p53 – /-. Celler
NVX-412 induserer S-fase Arrest, øker nivået av DNA-skader Markører og reduserer DNA replikering
Basert på resultatene som er beskrevet ovenfor, forsøkte vi å få mer innsikt i cellesyklus effekten av NVX-412. Vi utførte derfor flowcytometrisk cellesyklus analyser i HT-29, HeLa og HCT116-celler. I alle tre cellelinjene undersøkt en doseavhengig økning i den fraksjon av S-faseceller ble observert etter 24 timers inkubering med NVX-412 (figur 5A). Allerede etter 24 timers behandling med NVX-412 på IC
50-konsentrasjoner ble det observert en økning i det relative antall av S-fase celler som ble enda mer uttalt med høyere konsentrasjoner. I tillegg kan en økning i sub-G0 /G1 cellepopulasjonen, som er karakteristisk for apoptotiske celler, ble observert ved høyere konsentrasjoner av NVX-412 og også av CPT (data ikke vist). CPT tjente som positiv kontroll for G2 /M- eller S-fase arrest. I HT-29 og HeLa celler CPT indusert G2 /M arrest ved 50 nM og S-fase arrest på en mikrometer. I HCT116-celler 50 nM CPT induseres også G2 /M-fase rest, mens ved en konsentrasjon på 1 uM de fleste av cellene var allerede døde (ikke vist i figuren). Cellesyklus-forsinkelses observert ved FACS-analyse er kompatibel med resultatene fra ELISA-BrdU-inkorporering som viste en reduksjon av DNA-replikasjon ved NVX-412 behandling i HeLa og HCT116-celler (Figur 5B). Igjen, CPT ble anvendt som en positiv kontroll for reduksjon av DNA-replikasjon hastighet. Interessant, når cellene ble tillatt å komme seg i 24 timer i normal vekstmedium etter 24 timers behandling, DNA-replikasjon gjenvunnet og hastigheten øket til normale nivåer både i HeLa-celler og i HCT116-celler. Etter CPT behandling en bedring ble bare observert ved den laveste konsentrasjonen testet. Å studere en mulig DNA-skader induserende effekten av NVX-412, ble endringer i Ser296 fosforylering status for Chk1 undersøkt. Fosforylering ble funnet å være økt etter 4 timer med NVX-412 behandling, som er indikativ for en DNA-skade effekt (figur 5C). For å følge opp denne observasjonen, ble induksjon av γH2AX foci bestemmes av immunfluorescens farging i HeLa celler (Figur 5D). γH2AX nivåer ble funnet å være forhøyet etter en 24 timers behandling i et dose-avhengig måte. I tråd med evne til cellene til å reetablere sin normale DNA replikasjon rate etter en 24 timers restitusjonsperiode (figur 5B), γH2AX nivåer redusert til nesten basale nivåer innen 24 timer etter seponering av NVX-412 (figur 5D, svarte striper ). Effekten av en mikrometer CPT som ble brukt som positiv kontroll for γH2AX induksjon var ikke reversibel.
Diskusjoner
Vi undersøkte antineoplastiske aktivitet av NVX-412, et nytt legemiddel kandidat. I en omfattende skjerm utført av NCI, ble NVX-412 funnet å ha sterk anti-kreft aktivitet i submicromolar serien med en gjennomsnittlig IC
50 til 200 nM for alle cellelinjer kombinert. Ytterligere data samlet inn fra 21 kreftcellelinjer understreket potent anti-kreft aktivitet av NVX-412. Vår første funnene gir første bevis for at NVX-412 er et interessant forsknings -. Stadium narkotika kandidat som kan holde løftet som en roman terapeutisk, spesielt mot hematologiske maligniteter
klonogene overlevelses analyser viste at NVX-412 betydelig redusert eller helt blokkerte evnen av HepG2 og HT-29-celler til å danne kolonier. Disse resultatene pent bekreftet resultatene fra kortsiktige spredning eksperimenter.
