Abstract
Epitelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM) er overuttrykt i mange kreftformer, inkludert kreft i eggstokkene og EpCAM overekspresjon korrelerer med redusert overlevelse av pasienter. Det var målet med denne studien er å oppnå en målrettet metylering av den EpCAM-promoteren og stillhet EpCAM-genekspresjon ved hjelp av en konstruert sink finger-protein som spesifikt binder EpCAM-promoteren sammensmeltet til det katalytiske domenet til Dnmt3a DNA-metyltransferase. Vi viser at forbigående transfeksjon av denne konstruksjonen økt metylering av den EpCAM-promoteren i SKOV3-celler fra 4-8% i ubehandlede celler til 30%. Opp til 48% metylering ble observert i stabile cellelinjer som uttrykker det kimære metyltransferase. Kontrollforsøk bekreftet at metyleringen var avhengig av sammensmeltingen av sink finger og metyltransferase domenene og spesifikk for mål-region. De stabile cellelinjer med metanoldenaturert EpCAM-promotoren viste en 60-80% reduksjon av ekspresjonen EpCAM, bestemt ved mRNA og proteinnivå og oppviste en betydelig redusert celleproliferasjon. Våre data tyder på at målrettet metylering av EpCAM arrangøren kan være en tilnærming i behandling av EpCAM overekspresjon kreft
Citation. Nunna S, Reinhardt R, Ragozin S, Jeltsch A (2014) Målrettet Metylering av epitelceller adhesjonsmolekyl (EpCAM) Arrangøren for å kneble sitt uttrykk i eggstokkreft celler. PLoS ONE 9 (1): e87703. doi: 10,1371 /journal.pone.0087703
Redaktør: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, Frankrike
mottatt: 29 oktober 2013; Godkjent: 01.01.2014; Publisert: 29 januar 2014
Copyright: © 2014 Nunna et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet av Sander Foundation og DAAD (Deutscher Akademischer Austauschdienst). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft oppstår i bukhulen av eggstokkene er den syvende vanligste kreftformen hos kvinner og andre ledende dødsårsaken i verden blant gynekologisk kreft [1] – [3]. I de fleste kvinner, er eggstokkreft vanskelig å behandle med en fem års overlevelse på rundt 20% i kreft diagnostisert i avansert stadium [4] – [6]. Platinabaserte analoger som cisplatin eller karboplatin er de viktigste standard kjemoterapi å behandle kreft i eggstokkene i innledende stadier [7]. Imidlertid er deres anvendelse hindret av ervervet eller indre motstand av kreftceller til medikamentet [8]. Til tross for en økt forståelse i etiologien av eggstokkreft har det vært liten endring i overlevelse av pasienter i løpet av de siste 30 årene, fordi i de tidlige stadier eggstokkreft er symptomfri og det er ingen effektiv tumor spesifikke og sensitive markører for å overvåke epitelial eggstokk-kreft [9]. Det er derfor et umiddelbart behov for nye strategier for behandling av eggstokkreft
eggstokkkreftceller oppviser i forhold til ekspresjon av de Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) når sammenlignet med normale eggstokk-celler [10] -. [14 ]. EpCAM (NCBI Reference Sequence NM_002354.2, også kalt GA733, KSA, 17-1 A antigen, eller CD326) er et 40 kDa epiteliale celleoverflaten glykoprotein som formidler Ca
2+ uavhengig homofilist celle-celle adhesjon [10], [ ,,,0],15], [16]. Epitelet av friske individer uttrykker EpCAM, med unntak av plateepitel og av spesifikke epitelceller hos voksne hepatocytter og keratinocytter [17]. EpCAM er overuttrykt i varierende grad i en rekke humane karsinomer [18], [19], kreft-initiere celler, og i stamfar og normale stamceller [20]. Det har nylig blitt vist at EpCAM oppregulerer
c-myc, cyklin A
og
E
og den påvirker cellesyklusen og forbedrer celleformering [21]. I tillegg er det involvert i atom Wnt-signalveien som også fremmer cellevekst og tumordannelse [20].
Selv om den eksakte rolle EpCAM er unnvikende i progresjon av kreft i eggstokkene, EpCAM i forhold til ekspresjon korrelerte signifikant med redusert overlevelse hos pasienter med stadium III /IV av sykdommen, og i løpet av ekspresjon av EpCAM i bryst og galleblærekreft har en sterk sammenheng med dårlig prognose [22] – [24]. Anti-EpCAM-antistoffer ble brukt til å identifisere sirkulerende tumorceller i blodet hos kreftpasienter, og for å tilveiebringe prognostisk informasjon som tillater behandling av pasienter [25]. I tillegg har direkte tilknytning til EpCAM med progresjonen av eggstokkreft foreslått at det kan tjene som potensielt terapeutisk mål for behandling av eggstokkreft og forskjellige tilnærminger har blitt etablert for å målrette EpCAM [26], [27]. EpCAM antistoffer som MT201 eliminere effektivt kreftceller fra eggstokkreft pasienter [28]. For eksempel har Catumaksomab blitt godkjent for behandling av ondartede ascites, og det har vært brukt for epitelovarialcancer og ikke-eggstokk-kreft [29] – [31]. Selv om anti-EpCAM monoklonale antistoffer tilveiebringe beskyttelse mot kreft [32], [33], antistoffavhengig cytotoksisitet er avhengig av CH2-domenet av antistoffet som varierer betraktelig fra sats til sats i løpet av antistoffproduksjon [34]. I tillegg er anti-EpCAM-antistoffer mislyktes i å gi en hvilken som helst klinisk beskyttelse mot tykk- og prostata kreft på grunn av den store størrelsen på det antistoff som begrenser fordeling og levering [34] – [36]. Derfor, er bedre og mer generelle strategier for målrettet undertrykkelse av EpCAM nødvendig.
Som et alternativ tilnærming, onkogene funksjon av EpCAM ble hemmet ved å redusere ekspresjonen av dets gen. En metode for å oppnå dette var det anvendelsen av antisense-RNA som har ført til en sterk reduksjon i celleformering og metabolisme i humane karsinomceller [21]. På lignende måte, siRNA mediert stanse av EpCAM uttrykk sterkt reduserte cellemigrering og invasiv potensialet av brystkreftceller [23]. EpCAM-ekspresjon ble også stilnet av ekspresjonen av et sink-finger-protein som bindes til EpCAM-promoteren [37] og en blanding av en EpCAM rettet mot Sink finger-domene med en repressor domene [38]. Men gjorde alle disse metodene ikke fører til en vedvarende nedregulering som stimulerte forsøk på å koble genet undertrykkelse med epigenetiske merker, som DNA metylering. DNA-metylering spiller en viktig rolle i epigenetisk regulering av genekspresjon [39] – [42]. I pattedyr, forekommer DNA-metylering ved C5 posisjonen av cytosin hovedsakelig i sammenheng med CpG-dinukleotider. CPG rike regioner kalles CpG øyer og ofte forekommer i genet promoter regioner [43]. Den EpCAM promoter inneholder en CpG island, metylering som omvendt korrelerer med EpCAM uttrykk, tumorinvasjon og progresjon i ulike typer kreft [13], [44]. Til støtte for dette konseptet, kan det bli vist at DNA-metylering innføres ved promoteren i en urettet måte førte til nedregulering av den EpCAM-genet [45].
Åpenbart for å redusere bivirkninger av et epigenetisk genet Slå behandling, en målrettet levering av tie epigenetiske merker som DNA metylering er nødvendig. Dette krever kobling av en katalytisk enhet som leverer lyddemping signal med et målsøkende del, som sikrer den spesifikke bindingen av den katalytiske enhet til en definert genomisk mål-[46] – [48] (fig. 1). Forskjellige molekylære enheter er i bruk for sekvensspesifikk målretting funksjon, inkludert fusjon av DNA-metyltransferase del til en triplex formings oligonukleotid [49], fusjon for å konstruerte Sink finger-proteiner (se nedenfor), TAL effektorer [50], [51] og i fremtidige potensielt konstruert CRISPR /CAS-systemer [52]. Siden sink fingre var de første protein moduler som design av sekvens spesifikke DNA-binding ble mulig [53] – [58], innledende målrettet metylering studier støttet seg på kunstige sink-finger-proteiner som målgruppe enhet [59]. Ved å følge denne fremgangsmåten, undertrykkelse av virale gener [60], nedregulering av Maspin og SOX2 [61] og den VEGFA gensuppresjon [62] ble oppnådd i humane cellelinjer. I dette arbeidet har vi smeltet en sink finger protein som er rettet mot EpCAM promoter [37] til DNA metyltransferase 3a (Dnmt3a) katalytisk domene for å metilat EpCAM arrangøren, som senere skulle føre til EpCAM demping. Vi brukte SKOV3-celler som er avledet fra humane kvinnelige adenokarsinomceller og er benyttet som en modell for eggstokkreft [45]. Vi viser at de målrettede metylering av promoteren fører til reduksjon av den EpCAM genekspresjon, noe som ytterligere støtter ideen om at målrettet DNA-metylering er en generell tilnærming for å genet demping. Videre viser vi at lyddemping av EpCAM fører til en reduksjon i spredning av SKOV3 celler.
Den blå linjen representerer den ZF bindingssetet, ubesatte lollipops representerer unmethylated CPGs og fylte lollipops representerer metylert CPGs.
Materialer og metoder
Cell kultur, transfeksjon og berikelse av transfeksjon
SKOV3 menneskelige eggstokkreft celler ble hentet fra ATCC (American Type Culture Collection). Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (PAA) supplert med 10% føtalt bovint serum og 2 mM L-glutamin (PAA). For transient transfeksjon, 3,5 x 10
5-celler ble sådd ut i T25-kolber, og cellene ble transfektert etter en dag med 12 ul av Fugene HD transfeksjon-reagens (Promega) og 6 ug av tre plasmid-DNA som uttrykker en forskjellig Sink finger fusjonskonstruksjoner som brukes i dette arbeidet, den LNGFR markør, og GFP i et forhold på 10:2.5:1 som tidligere beskrevet [62]. De transfekterte celler ble beriket hjelp MACSelect ™ LNGFR system (Miltenyi Biotec) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, når cellene ko-transfektert med LNGFR molekyl, er det uttrykt på celleoverflaten. Etter fire dager ble celler inkubert med magnetiske kuler konjugert med anti-LNGFR-antistoff i 15 minutter ved 4 ° C. Transfekterte celler ble ført gjennom en MACS separasjonskolonne som er lagt inn i en separator MACS og vasket to ganger med PBE buffer (fosfatbuffer saltvann med 0,5% bovint serumalbumin og 5 mM EDTA) for å vaske bort ikke-transfekterte celler. Etter vasking, blir bare transfekterte celler som er bundet ved hjelp av magnetiske kuler holdt tilbake i kolonnen, og de anrikede celler ble eluert i PBE og anvendt for ytterligere metylering analyse.
For stabil cellelinje generasjon, 2 x 10
5-celler ble sådd per brønn i 6 brønners plater, og cellene ble transfektert med 6 ul av Fugene HD transfeksjon reagens og 2 ug av EpCAM ZF-Dnmt3aCD plasmid DNA. Etter 48 timer ble cellene dyrket i medium inneholdende 800 ng /ml G418 i seks uker. Monoklonale kolonier ble oppnådd og ytterligere utvidet i nærvær av G418-inneholdende medium, og to av de stabile cellelinjer ble brukt for videre eksperimenter.
Metylering analyse av EpCAM-promoteren og ikke-target-genet metylering
Genomisk DNA ble isolert ved anvendelse av QIAamp® DNA mini-sett (QIAGEN), og bisulfitt omdannelse ble utført som beskrevet tidligere [63]. I korthet 400 ng genomisk DNA ble spaltet med SphI restriksjonsenzym over natten ved 37 ° C. Bisulfitt omdannelse ble utført i nærvær av NaOH og natriumbisulfitt ved bruk av følgende betingelser: 15 min inkubasjon ved 99 ° C, 30 min ved 50 ° C, 5 minutter ved 99 ° C, 1,5 timer ved 50 ° C, 5 min ved 99 ° C og 1,5 timer ved 50 ° C. Under inkubasjon med bisulfit, er unmethylated cytosin omdannes til uracil men denaturert cytosines forblir uendret. Deretter ble DNA konsentrert og renset ved å anvende Amicon ultra sentrifugal-filter (Millipore) og PCR amplifisert ved å bruke spesifikke primere bisulfitt. Den uracil forsterkes som Tymin i denne reaksjonen. PCR-produktet ble subklonet ved bruk av PCR-kloning StrataClone kit og individuelle kloner ble sekvensert. For å analysere sin metylering status, ble 220 bp av EpCAM arrangøren med 16 CPGs forsterket ved hjelp av spesifikke primere (For: 5′-CTT TTT AAG GTT TTA GAG TAG-3 «og Rev: 5»-AAA AAA TAA ATA AAC TCC CCT CCC -3 «). For ikke-target genet metylering ble fire amplikonene fra gener (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 og WRB, henholdsvis) analysert; sekvensene av alle amplikonene og en liste over primere som brukes er gitt i Supplementary Information S1. Data ble analysert ved hjelp av BISMA programvare [64].
RT qPCR analyse
Total RNA ble isolert fra stabile cellelinjer og kontrollere SKOV3 celler ved hjelp Purelink ™ RNA mini kit (Ambion). En total på 1,0 ug RNA ble omdannet til komplementær DNA ved bruk av M-MuLV revers transkriptase (NEB) med oligo dT primere. Q-RT PCR ble utført ved hjelp av CFXConnect ™ Real-Time system (Bio-Rad). EpCAM transkripsjon uttrykk nivåer ble kvantifisert ved hjelp SsoFast ™ EvaGreen® SuperMix (Bio-Rad) og EpCAM spesifikke primere (for: 5′-GAACAATGATGGGCTTTATG-3 «, rev: 5′-TGAGAATTCAGGTGCTTTTT-3′) ved hjelp av beta aktin som intern kontroll (for : 5»-TCACCAACTGGGACGACATG-3 «, Rev: 5′-ACCGGAGTCCATCACGATG-3»). Den relative mengde av transkripsjon ble målt ved hjelp av terskelsyklus forsterkning (C
T) som er inverst korrelert med mengden av RNA tilstede. The ganger endring i EpCAM RNA ble beregnet ved hjelp av ΔΔCt metoden. Ct-verdiene bestemmes som gjennomsnittet av triplikater og eksperimentet ble utført i to tekniske rapporter.
Western blotting
Cellelysater ble fremstilt fra stabile cellelinjer og tak SKOV3-celler ved hjelp av RIPA-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP40 og 1 mM PMSF), og det totale proteininnhold ble kvantifisert ved BCA protein assay kit ™ (Thermo Scientific). Fire ug totalt protein ble løst i 10% SDS-PAGE-geler og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen ble blokkert over natten ved inkubering med 4% bovint serumalbumin i fosfat-buffer saltoppløsning, og probet med kanin-anti-humant IgG EpCAM i 1:4000 fortynning (Abcam Ab71916), etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert geit-anti-kanin-IgG i 1: 4000 fortynning (GE Healthcare). Blottene ble utviklet ved hjelp av forbedret chemiluminescence western blotting løsning (Thermo Scientific), og bildene ble tatt på X-ray filmer, skannet og kvantifisert ved hjelp av Image J programvare.
Cell Proliferation assay (CCK8 assay)
celleproliferasjon analyser ble utført ved anvendelse Celletelling telling~~POS=HEADCOMP kit-8 (CCK8) assay (Dojindo) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble SKOV3-celler eller stabile cellelinjer CD1 og CD2 sådd ut i en tetthet på 1,5 x 10
4 celler i 200 ul medium i en 96-brønners cellekulturplate og dyrket i tre dager i DMEM med 10% FCS ved 37 ° C med 5% CO
2. Etter tre dager ble cellene behandlet med 10 ul av den CCK8 reagens per brønn og inkubert i 4 timer i CO
2 inkubator. Deretter ble 100 ul supernatant fra hver brønn overført til nye 96-brønners plater, og absorbansen ble målt ved 450 nm ved hjelp av spektrofotometer. Den CCK8 reagenset inneholder WST-8 [2- (2-metoksy-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfofenyl) -2H-tetrazolium, mononatriumsalt] oppløst i vann og celle kulturmedium, som kan komme inn i cellen hvor den blir redusert ved dehydrogenaser for å gi en oransje farget formazanprodukt. Mengden av formazan som dannes er direkte proporsjonal med antallet levende celler.
Celletelling assay
SKOV3-celler eller stabile cellelinjer CD1 og CD2 ble sådd i en brønns cellekulturplate i en tetthet på 2 x 10
5cells per brønn og dyrket i fire dager i DMEM med 10% FCS ved 37 ° C med 5% CO
2. Etter fire dager ble cellene vasket to ganger med fosfatbuffer saltvann, trypsinert og høstet separat og en enkeltcellesuspensjon ble fremstilt. Celler ble fortynnet i Trypan blå flekk 0,4% (Gibco) i et forhold på 1:01, og det totale antall levedyktige celler i hver brønn ble telt ved bruk av et Neubauer tellekammer eller hemocytometer. Levende celler kan skilles fra døde celler, fordi døde celler ta opp fargestoff og mørk blå flekk, mens membraner av levende celler er intakt og forhindre opptak av fargestoff.
Resultatene
Målrettet DNA-metylering av EpCAM-promoteren i eggstokkkreft SKOV3-celler
det var målet med denne studien er å oppnå en målrettet metylering av den EpCAM-promoteren og stillhet EpCAM genekspresjon. Vi har benyttet en konstruert sink-finger-protein som spesifikt binder EpCAM-promotoren [37] og smeltet det med det katalytiske domenet av den Dnmt3a DNA-metyltransferase (Dnmt3aCD), som tidligere har blitt brukt for å innføre rettet DNA-metylering [60], [62 ]. For mål-spesifikk metylering, SKOV3 kreftceller, som har en unmethylated EpCAM promoter og aktiv EpCAM uttrykk [11], ble transient transfektert med det kimære Sink finger – Dnmt3a katalytisk domene (ZF-Dnmt3aCD) konstruksjoner. Etter fire dager ble transfekterte celler ble anriket ved MACS utvalg og metylering status for EpCAM-promoteren (fig. 2) ble analysert ved hjelp av bisulfitt omdannelse og sekvensering av individuelle kloner. I to uavhengige forsøk, utransfekterte SKOV3 celler viste en basal nivå på 4-8% DNA metylering. Imidlertid øket metylering til 29% (± 4%) i ZF-Dnmt3aCD transfekterte celler i to uavhengige eksperimenter (fig. 3). Viktigere, våre data viser at metylering nivåer av 80% kunne oppnås på noen konkrete CpG stedene i målområdet, som nettstedene 14-16. Den EpCAM-promoteren viste basalnivået av metylering i SKOV3-celler som ble transfektert med kontroll-vektorer, enten vektorkontroll alene, sink finger uten Dnmt3aCD eller Dnmt3aCD uten sink finger, henholdsvis (fig. 3). Oppdagelsen av at uttrykket av uønskede Dnmt3a katalytiske domenet ikke førte til en stor økning i DNA metylering ved EpCAM arrangøren er i samsvar med tidligere observasjoner på et annet mål locus [62].
Genet er vist i blått , sin CpG øy i grønt og amplicon i svart. Den amplicon sekvens er gitt nedenfor, er ZF bindingssetet sekvens skyggelagt i rødt. Dette bildet ble generert ved hjelp av University of California Santa Cruz genom nettleser (https://genome.ucsc.edu/) [66]
Følgende forkortelser ble brukt. SKOV3 celler, ubehandlede celler; ZF, SKOV3-celler transfektert med Sink finger-konstruksjonen, ZF-Dnmt3aCD, celler transfektert med sink finger Dnmt3a katalytisk domene-konstruksjon; VEC cntrl, celler transfektert med tom vektor; Dnmt3aCD, celler transfektert med en Dnmt3aCD konstruere uten Sink finger; CD1, stabil cellelinje som uttrykker ZF-Dnmt3aCD 1; CD2, stabil cellelinje som uttrykker ZF-Dnmt3aCD 2. De horisontale rader angir CPGs i amplikonet analysert og de vertikale rader representerer individuelle kloner som ble sekvensert. De blå og røde farger representerer unmethylated CpG og denaturert CpG, henholdsvis for hvit fargede områder, er metylering tilstand ukjent på grunn av tekniske årsaker.
Siden vi gjennomførte metylering eksperimenter i forbigående transfekterte celler etter MACS markering, en bakgrunn av utransfekterte celler var fortsatt til stede, som vi anslår å være i størrelsesorden 20%, basert på mikroskopisk observasjon. For å oppnå en homogen celleprøve, der alle cellene ble behandlet med den kimære metyltransferase, genererte vi to uavhengige stabile cellelinjer (kalt CD1 og CD2), som uttrykker den Sink finger Dnmt3aCD kimære metyltransferase. Genomisk DNA ble isolert fra begge cellelinjer og metylering status for EpCAM-promoteren ble analysert som beskrevet ovenfor. Våre resultater viser at metylering nivåer av EpCAM promoter ble økt til 46% i stallen cellelinje CD1 og 48% i CD2 (Fig. 3).
Off-målet genet metylering
Å analysere metylering på andre loci som kan følge våre målrettet metylering, vi undersøkt metylering status av ytterligere fire ikke-målgener (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 og WRB) som beskrevet i materialer og metoder. De SKOV3-celler viste en metylering av 1%, 1%, 17% og 2%, respektivt, i de fire amplikoner (fig. 4 og [62]). SKOV3-celler forbigående transfektert med ZF-Dnmt3aCD viste metylering nivåer på 1%, 1%, 22% og 1%, hvilket er nesten identiske med resultatene oppnådd med de ubehandlede SKOV3-celler (Fig. 4). De stabile cellelinjer CD1 og CD2 viste også metylering mønstre veldig lik kontrollcellene (Fig. 4). Selv om disse resultater ikke utelukke ytterligere metylering som forekommer på et eller annet individ loci, viser de en metylering av det EpCAM-promoteren ikke er ledsaget av en massiv, uspesifikk og genom-bred DNA-metylering, noe som indikerer at målretting var i det minste delvis vellykket.
metylering av fire ikke-målgener ble analysert (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 og WRB). Data presentasjon er som i fig. 3. sekvenser av regionene analysert her er gitt i Supplementary Information S1.
EpCAM uttrykk er undertrykt av målrettet DNA metylering av EpCAM genet promoter
For å finne ut om arrangøren metylering førte til transkripsjonen stanse av den EpCAM genekspresjon, ble totalt RNA isolert fra SKOV3-celler og de stabile cellelinjer CD1 og CD2 og EpCAM mRNA-nivåer ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Som vist på fig. 5A og B, ble det observert en reduksjon av EpCAM ekspresjon av 80% i stabil cellelinje CD1 og 60% i stabil cellelinje CD2. Den EpCAM undertrykkelse av målrettet DNA metylering ble bekreftet på proteinnivået ved western blotting, hvor vi observerte en tilsvarende reduksjon av EpCAM uttrykk i de stabile cellelinjer i forhold til SKOV3 celler (Fig. 5C og D).
En ) Eksempel på RT qPCR analyse av EpCAM (til venstre) og beta aktin (høyre) mRNA beløp i SKOV3 celler og i to uavhengige cellelinjer som stabilt uttrykker ZF-Dnmt3a konstruere (CD1 og CD2). B) Kvantifisering av RT qPCR analyse av EpCAM uttrykk som vist i panel A. Vi har gjennomført to uavhengige RNA preparater hver analysert i tre tekniske rapporter. Bildet viser gjennomsnittet av både resultater, feilLinjene angir standard feil. C) Eksempel på Western blot analyse av EpCAM uttrykk i SKOV3 celler og CD1 og CD2 stabile cellelinjer (øvre panel). Beta aktin ble brukt som lasting kontroll (nedre panel). De EpCAM og beta aktin band er merket med piler. D) Kvantifisering av Western Blot analyse av EpCAM uttrykk som vist i panel C. Figuren viser et gjennomsnitt av to uavhengige eksperimenter, feil linjene viser standardavviket til dataene.
Redusert EpCAM uttrykk forbinder med en reduksjon på celleproliferasjon
for å undersøke om redusert EpCAM uttrykk påvirket spredning av SKOV3 celler, ble et likt antall ubehandlede celler samt CD1 og CD2 celler sådd og celleproliferasjon analysen ble utført etter tre dager. For dette ble cellene behandlet med den CCK8 reagens oppløst i cellekulturmedium og inkubert i 4 timer i inkubatoren. I løpet av denne tiden, kan reagenset diffundere inn i cellene, hvor det blir redusert av cellulære dehydrogenaser for å fremstille en oransje farget formazanprodukt, som kan bli detektert ved absorpsjon ved 450 nm. Siden mengden av formazan er direkte proporsjonal med antallet levende celler, gir denne analysen et enkelt anslag over antallet levende celler i prøven. Som vist på fig. 6A, var det 60% reduksjon av levende celler i CD1 og 40% i CD2 sammenlignet med SKOV3 cellekontroll, som er i en meget god korrelasjon med reduksjon av EpCAM ekspresjon i begge cellelinjer. For å bekrefte disse resultatene kan vi også gjennomført levedyktig celle telling ved anvendelse av Trypan blå, som beskrevet i materialer og metoder. For dette et likt antall celler ble sådd ut og inkubert i fire dager. Deretter ble det totale antall levedyktige celler telles. Som vist i fig. 6B viser resultatene bekreftet den celleproliferasjonsanalyse, fordi det var en omtrent 50% reduksjon av antall levende celler i CD1 og omtrent 40% i CD2. Vi konkluderer med at nedregulering av EpCAM fører til en betydelig reduksjon av den proliferative potensial av SKOV3-celle in vitro.
A) Resultater av CCK8 celle proliferasjonsanalyser utført med CD1 og CD2 stabile cellelinjer og SKOV3-celler som henvisning. Resultatene plottes er fra fire uavhengige forsøk og feilLinjene angir standard feil av gjennomsnittet. B) levedyktig celle telling utført av trypanblått farging. Grafen viser data fra to uavhengige eksperimenter og feilLinjene angir standard feil av gjennomsnittet.
Diskusjoner
Målrettet DNA metylering ved fusjon av en DNA metyltransferase domene (her katalytisk domene av Dnmt3a) og en målsenhet (her en konstruert sink finger) er en attraktiv metode for genet Slå [46] – [48]. Det finnes noen tidligere eksempler på vellykket bruk av denne metoden for å oppnå genet Slå i humane celler [60] – [62]. Her viser vi målrettet metylering og genet Slå av EpCAM-genet, som er et lovende mål i tumorterapi. Vi viser fravær av off-target virkninger i det hele tatt loci som ble inspisert med henblikk på dette, noe som indikerer at målretting var (i det minste delvis) vellykket. Våre resultater støtter forestillingen om at målrettet metylering og genet Slå er en universell tilnærming med bred anvendelse. Videre demonstrerer vi at stanse av EpCAM ekspresjon fører til en reduksjon i den proliferative potensial på SKOV3-celler.
I en nyere artikkel, der Gun et al. (2013) rapporterte en om todelt stanse av EpCAM etter uttrykk for en sink finger smeltet repressor Kruppel-forbundet boksen (SKD) domene, som ble levert med en retroviral vektor [38]. Interessant, dette førte til en reduksjon i proliferasjon i brystkreftceller, men ikke i SKOV3-celler. Tilsvarende hadde en RNAi basert stanse av EpCAM i SKOV3 cellene ikke redusere celleproliferasjon i dette arbeidet. Disse resultatene med SKOV3 cellene ikke er i samsvar med våre data, men det er viktige forskjeller i oppsettet av begge studiene. Først av alt, van der Gun et al. (2013) brukte en undertrykkelse domene, mens vi ansatt en DNA metylering mediert epigenetisk stillemekanisme. Faktisk EpCAM lyddemping var litt sterkere i vårt oppsett, 60-80% i våre cellelinjer vs. 50% observert av van der Gun et al. (2013), som kan påvirke resultatene. For det andre, van der Gun et al. (2013) leverte sin lyddemping konstruere med retrovirale vektorer og bruke tomme vektorer som kontroll. Celleproliferasjon ble analysert 4-6 dager etter transduksjon. Vår studie ansatt cellelinjer som uttrykker taushet konstruksjoner i en stabil måte etter en innledende transient transfeksjon. Begge fremgangsmåter har sine fordeler og ulemper. I retrovirale levering er cellulære effekter målt noen dager etter en retroviral infeksjon, som kan sterkt påvirke cellulære responser. I tillegg, i stabil cellelinje, ble EpCAM stilnet i flere uker før analysen celleformering ble foretatt, noe som ga cellen lang tid for å svare til den reduksjon av EpCAM uttrykk. I motsetning til dette sprednings tester av van der Gun et al. (2013) ble utført i 4 til 6 dager etter transduksjon og i RNAi forsøkene avlesnings ble utført 1 til 3 dager etter transfeksjon siRNA, som kan være en annen årsak til forskjellen i resultater. Det er en ulempe ved den stabil cellelinje måte at enkeltcellelinjer er studert som kan ha samlet seg spesielle tilpasninger. Men det faktum at begge stabile linjer studert her viste lignende effekter, løser delvis denne bekymringen. Vi konkluderer med at ytterligere forsøk vil være nødvendig for å løse dette problemet, men reduksjon av proliferativ potensialet for en svulst cellelinje observert her etter epigenetisk stanse av den EpCAM arrangøren er et lovende resultat for potensielle terapeutiske anvendelser av EpCAM stanse i behandling av kreft med EpCAM overekspresjon
for fremtidige anvendelser av målrettet genet stanse, må effektiviteten av levering av målrettede metyltransferase konstruere forbedres.; flere virale levering strategier er tilgjengelige for dette formål, og er for tiden utviklet i vårt laboratorium og på andre steder [61], [65]. Etter at utviklingen av flere aktive og funksjonelle chimeriske metyltransferaser som arbeider i cellekulturmodeller, vil det være en neste kritisk milepæl av fremtidig arbeid for å integrere disse enzymene inn i et effektivt leveringssystem som gjør det mulig infeksjon av tumorceller i dyr (eller menneske) legeme, og fører til hemming av tumorutvikling i dyremodeller. Hvis dette kan oppnås, vil det også være nødvendig å bestemme den potensielle off-target metylering på et genom bred skala og på en kvantitativ måte i forskjellige vev. For dette har flere genom bred DNA-metylering analysemetoder er tilgjengelige. Avhengig av mengden av target-metylering og den berørte loci, vil en risikoanalyse tillater å vurdere om disse reagensene kan være trygt for kliniske forsøk. Om nødvendig spesifisitet av målretting kan forbedres ved hjelp av sink fingre moduler som gjenkjenner lengre sekvenser enn brukt her. Omsider andre målrettingsmetoder, som TAL effektor domener eller CRISPR avledet metoder kan benyttes, men for dem spesifisitet er et problem også.
Hjelpemiddel Informasjon
Informasjon S1.
Primer og amplicon sekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0087703.s001 product: (PDF)
Takk
Vi erkjenner takknemlig bidrag og hjelp av Dr . Kirsten Liebert og Dr. Yingying Zhang i den tidlige fasen av prosjektet.
