Abstract
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken blant gynekologisk kreft og er den femte største årsaken til alle kreftrelaterte dødsfall blant kvinner. Utviklingen av nye molekylære mål er derfor viktig for mange pasienter. Nylig har SRY-relaterte transkripsjonsfaktor SOX2 blitt mye rapportert å være involvert i flere patofysiologiske sykdommer, inkludert vedlikehold av stamcelleegenskaper og kreftutvikling. Inntil nå har SOX2 i hovedsak vært vist seg å fremme utviklingen av kreft, selv om dens hemmende roller i kreft har også blitt rapportert. Imidlertid er rollen til SOX2 i eggstokkreft i stor grad ukjent. I denne studien, vi har oppdaget uttrykk for SOX2 i 64 menneskelige serøs ovarialcancer (SOC) vev og paret tilsvarende metastatisk prøver ved hjelp av immunhistokjemi. Resultatene viste at ekspresjon av SOX2 i primære tumorer er mye lavere enn i de tilsvarende metastatiske lesjoner. Vi videre funnet at SOX2 overekspresjon fremmer spredning, migrasjon og invasjon, mens hemme vedheft evner av SOC celler. Til slutt fant vi ut at SOX2 rettet Src kinase, et ikke-reseptor tyrosin kinase som regulerer celle migrasjon, invasjon og heft i SOC celler. Sammen utgjør disse resultatene antydet at Src kinase er et nøkkelmolekyl i SOX2-mediert migrasjon og invasjon av SOC celler
Citation. Wang X, Ji X, Chen J, Yan D, Zhang Z, Wang Q, et al. (2014) SOX2 Forbedrer Migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler via Src Kinase. PLoS ONE 9 (6): e99594. doi: 10,1371 /journal.pone.0099594
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 9 februar 2014; Godkjent: 15 mai 2014; Publisert: 17 juni 2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (NSFC nr 81272883, nr 81020108027 og nr 81172478). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarian epithelial kreft står for 80-90% av alle eggstokkreft og er den ledende morderen blant alle gynekologiske kreftformer [1]. På grunn av mangel på tidlige symptomer, er ovarialcancer vanligvis diagnostisert på et avansert metastatisk stadium. Utbredt metastaser er de viktigste årsakene til dårlig prognose for pasienter med eggstokkreft. Selv om overlevelse har økt noe i løpet av de siste 25 årene, fem-års overlevelse er fortsatt under 50% [1]. Derfor studerer de metastatiske mekanismer for eggstokkreft har vært et fokus på verdensbasis.
SOX2, et medlem av SRY-relaterte høy mobilitet gruppe boksen familie, ble opprinnelig funnet å opprettholde den embryonale stamcelle pluripotency [2] . Mer nylig, SOX2 ble vist å være involvert i en serie av maligniteter. Tallrike studier har vist at SOX2 fremmer cellevekst, migrasjon, invasjon og tumormetastaser i flere tumortyper, for eksempel glioblastom [3], kolorektal kreft [4], prostatakreft [5], brystkreft [6], [7] og osteosarkomer [8]. Videre høye uttrykk nivåer av SOX2 korrelerer med tumorprogresjon eller dårlig prognose av flere kreftformer. I kontrast, ble svulsten-undertrykkende rolle SOX2 også rapportert i magekreft [9], og plateepitelkreft lungekreft [10].
Nylig har flere studier funnet at SOX2 uttrykk er betydelig økt i eggstokkreft vev sammenlignet med normale eggstokk vev ved hjelp av immunhistokjemi [11], [12]. Multivariat analyse videre demonstrert at SOX2 overekspresjon er en dårlig prognostisk faktor i eggstokk-kreft [13], [14]. Disse funnene antydet at SOX2 kan fungere som en svulst fremmende genet i eggstokkreft. Men de funksjonelle roller og presise mekanismene er fortsatt unnvikende i eggstokkreft. For å klargjøre rollen og underliggende mekanismer for SOX2 i ovarian epitelial cancer, undersøkte vi uttrykket for SOX2 i serøs eggstokk-karsinom (SOC) og passet metastatiske vev, så vel som i SOC cellelinjer. Videre analyserte vi effekten av SOX2 genet på spredning, migrasjon og vedheft evner av SOC celler.
Materialer og metoder
Menneske SOC prøver og kliniske opplysninger
SOC primær og matchet metastatisk vev (omentum) ble hentet fra Avdeling for patologi ved første Folkets sykehus i Shanghai. Bruk av prøvene ble godkjent av Human Investigation Etisk Komité av fort Folkets sykehus i Affiliated Shanghai Jiao Tong University. Alle disse prøvene ble innhentet skriftlig informert samtykke. De spesifikke eksempler brukt i denne studien, er blitt beskrevet i foregående publikasjon [15]. Totalt 64 serøs cystadenocarcinoma med omentum metastaser (stadium III) ble undersøkt. I en alder av pasienter med eggstokkreft varierte fra 34 til 81 år (median på 61,2). Det er 55 tilfeller med overgangsalderen. De formaldehyd-fiksert og parafininnstøpte vevsprøver fra 64 tilfeller av SOC ble samlet mellom januar 2003 og desember 2010. Pasienter med tidligere stråling eller kjemoterapi ble ekskludert. Patologiske diagnoser av de ovennevnte eggstokkene lesjoner ble gjort av to gynekologiske patologer ved hjelp av World Health Organization klassifisering.
Immunhistokjemisk (IHC) farging og evaluering
IHC analyse for SOX2 protein uttrykk ble utført som tidligere rives. I korthet ble SOX2 uttrykk påvist ved anvendelse av et kanin-monoklonalt anti-humant SOX2 (Cell Signal Technology, Danvers, MA, USA). Snittene ble inkubert med anti-SOX2 (1:100 fortynning) i et fuktkammer i 2 timer etterfulgt av en 60-minutters inkubasjon med et biotinylert sekundært antistoff. Prosentandelen av positivt fargede celler og intensiteten av fargingen i disse snittene ble på en blindet måte. Positive celler ble indikert ved nærværet av brune flekker i både kjernen og cytoplasmaet. IHC Resultatene ble evaluert under et lysmikroskop, og gitt poeng som følger: 0 mindre enn 5% positive celler; 5 til 25 januar% positive celler; 2 26-75% positive celler; og 3 76% positive celler. Stain intensitet ble scoret som: 0, ingen farging; 1, svak-gul; 2, brun-gule; og 3, mørkebrun. Ekspresjonsnivået (pluss de to score) ble klassifisert som: – (0), + (1-2), ++ (3-4), og +++ (5-6). Poeng ≥3 ble definert som høyt nivå uttrykk og score 3 ble definert som lav-nivå ekspresjon. Individuelle IHC score for hvert tilfelle ble brukt for statistisk analyse. Alle IHC lysbilder ble selvstendig etter to etterforskere.
Cellelinjer og cellekultur
eggstokkreft cellelinjer Hei, HO8910, og HO8910-pm ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og kultivert basert på retningslinjene i depotet. Cellene ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) /F12 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). De MCV152 og Moody cellelinjer ble vennlig levert av Dr Wenxin Zheng (Universitetet Arizona, Tucson, AZ, USA). SKOV3 celler ble kjøpt fra Beijing Union Medical College (Beijing, Kina). De tre SOC cellelinjer og HEK-293T ble dyrket i DMEM supplementert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, natriumpyruvat og L-glutamin ved 37 ° C med 5% CO2.
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad. CA. USA). Gratis DNA (cDNA) ble syntetisert med stats-Script RT reagent Kit (Takara, Japan). Brett inductions ble beregnet ved hjelp av formelen 2- (ddCt) bruker GAPDH som en intern kontroll genet. Real-time PCR ble utført ved hjelp SYBR Premiks Ex Taq (Takara, Japan). Den genspesifikke primer-par var som følger: SOX2 (F) 5′-CGG CAA CCA GAA AAA CAG C-3 «, SOX2 (R) 5′-TCT CCG TCT CCG ACA AAA GT-3′; GAPDH (F) 5»-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3 «, GAPDH (R) 5′-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3».
Transient transfeksjon av SOX2 små interfererende RNA (siRNA) og Src siRNA
Ho8910-pm og SKOV3-celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved en tetthet på 4 x 10
5-celler /brønn. Etter 24 timers dyrking ble mediet erstattet med Opti-MEM (Invitrogen) i fravær av antibiotika og dyrket. siRNA som tilsvarer genet ble designet og syntetisert ved Genepharma (Shanghai, Kina). Totalt 100 pmol siRNA ble transfektert bruker 5 mL av lipofektamin RNAiMax reagens (Invitrogen). Etter inkubering i ytterligere 48 timer ble de behandlede celler brukt for å undersøke effekten av genet uttømming ved hjelp av Western blot-analyse eller Transwell og adhesjons-analyser. SiRNA sekvenser mot SOX2 inkludert: (1) 5′-CUGCAGUACAACUCCAUGATT-3 «; (2) 5»-GGACAUGAUCAGCAUGUAUTT-3 «; (3) 5»-CCA UGG Guu CGG UGG UCAA TT-3 «. SiRNA sekvenser mot Src inkludert: (1) 5»-CAG GCU GAG GAG UGG UAU UTT-3 «; (2) 5»-GCC ACG UCA UGA AGC ATT ACU-3 «; (3) 5»-CUC GGC UCA UUG AAG ACA ATT-3 «
Plasmid bygging
SOX2 ORF sekvensen ble forsterket fra SOX2 vektor, som ble produsert av Shanghai R . S Bioteknologi Co Ltd (Shanghai, Kina). Integriteten av cDNA ble bekreftet ved sekvensering. Den SOX2 ORF-sekvensen ble satt inn i EcoRI-BamHI-setet av den pWPXL plasmid og ligert inn i vektor (en gave fra Dr. Didier Trono). Primersekvensen av SOX2 følger: SOX2 (F) 5′-CGC GGA TCC ATG TAC AAC ATG ATG GAG ACG GAG C-3 «; SOX2 (R) 5»-CCG GAA TTC GAT TTA TCG CGT CGA CTC ACA TG-3 «.
Lentivirus produksjon og celle transduksjon
Emballasjen plasmid psPAX2 og konvolutten plasmid pMD2.G var gaver fra Dr. T. Didier Trono. pWPXL-SOX2 vektor ble transfektert med psPAX2 og pMD2.G inn HEK293T celler ved hjelp Lipofectamine2000 (Invitrogen). Virus ble høstet 48 timer etter transfeksjon og virale titere ble bestemt. Ho8910-celler ble infisert med 1 x 10
6 rekombinante lentivirus overføringsenheter i nærvær av 6 ug /ml polybrene (Sigma, MO., USA).
Celle- ekstracellulære matriks (ECM) adhesjonsassayet
evnen som ovarian carcinoma celler til å følge ECM komponenter ble kvantifisert som tidligere beskrevet [16]. 96-brønners plater ble belagt med 1 mg /ml matrigel (BD, USA), 10 ug /ml plasma fibronektin (Millipore, Billerica, MA, USA), 10 ug /ml type I kollagen (Millipore, Billerica, MA, USA) , 10 ug /ml laminin (Millipore, Billerica, MA, USA), eller med 100 ug /ml bovint serumalbumin (BSA, Sigma, USA), og inkubert over natten ved 4 ° C. Deretter ble ikke-spesifikke bindingsseter blokkert med 1% BSA i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) i 4 timer ved 37 ° C eller over natten ved 4 ° C, deretter Platene ble vasket med PBS to ganger. Cellene (4,0 x 10
4cells /100 ul) fortynnet med DMEM ble tilsatt til de belagte 96-brønners plater og inkubert ved 37 ° C i 30~60 minitus i en CO2 inkubator. Ikke-adherente celler ble fjernet ved vasking med PBS. Festede celler ble analysert ved bruk av en celletelling leder-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner, og den optiske tettheten ble målt ved 450 nm. Disse forsøkene ble utført in triplo og gjentatt to ganger.
Cell proliferasjonsanalyser
celler ble sådd i en tetthet på 2000 celler per brønn i 96-brønners plater og inkubert. En alikvot av 10 ul av CCK-8 ble tilsatt til brønnene og inkubert i 2 timer. Absorbansen ble målt ved 450 nm for å beregne antallet av levedyktige celler i hver brønn. Hver måling ble utført in triplo, og forsøkene ble gjentatt to ganger.
For koloni formasjons assays, ble cellene sådd ut i seks-brønns plater ved en tetthet på 200 celler pr brønn og dyrket ved 37 ° C i to uker. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene fiksert med 100% metanol og farget med 0,1% (w /v) Crystal Violet. Megascopic cellekolonier ble talt opp ved hjelp av Image-Pro Plus 5.0-programvaren (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Hver måling ble utført in triplo, og forsøkene ble alle utført minst tre ganger
migrering og invasjon assays
Cellemigrering analysen.: 4 x 10
4 celler ble suspendert i 200 ul serumfritt DMEM-medium og sådd ut i det øvre kammer av hvert innskudd. Deretter ble 500 ul DMEM inneholdende 10% FBS tilsatt til en 24-brønns plate. Etter inkubering ved 37 ° C (Ho8910: 12-14 h; Ho8910-pm: 12-14 h; SKOV3: 12-14 h), cellene som migrerte ble fiksert og farget i 30 minutter i en 0,1% krystallfiolett oppløsning i PBS
celle invasjon assay.: kamrene var jevnt dekket med 60 ul Matrigel fortynnet med DMEM til en viss prosentandel, og inkubert ved 37 ° C i 2-4 timer. Deretter, 4 x 10
4 celler ble suspendert i 200 ul DMEM og sådd ut i de øvre kamrene, og 500 ul DMEM inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubasjon ved 37 ° C (Ho8910:24-26 t; Ho8910-pm: 24-26 h; SKOV3 24-26 h)., Ble cellene fiksert og farget
Western blot analyse
De behandlede celler ble lysert med radioimmunopresipitasjonsanalyse analyse (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoksykolsyre, natrium, 0,1% SDS). Cellelysater ble separert ved 7,5 til 12,5% SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, USA), og blokkert med PBS inneholdende Tween-20 og 5% ikke-fettmelk i 1 time. Proteiner av interesse ble inkubert med tilsvarende primære antistoffer over natten ved 4 ° C. De ble deretter vasket tre ganger med vaskebuffer (0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvann) og inkubert med det passende sekundære antistoff ved romtemperatur i 1 time. Antistoffet komplekset ble oppdaget ved hjelp av forbedret chemiluminescence Kit (Pierce, Rockford, en L. USA). Følgende primær antistoffer SOX2, FAK, fosfor-FAK (Y397), Src, fosfor-Src (Y416), p130cas, fosfor-p130cas, ERK1 /2, fosfor-ERK1 /2, MMP2 og MMP9, ble kjøpt fra Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA).
Statistical Analysis
Alle resultater er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet. Statistiske analyser ble utført med Fishers eksakte test i tabell 1. For overlevelsesanalyse, ble Kaplan-Meier-overlevelseskurver konstrueres, og forskjellene mellom dem ble testet ved log-rank test. Ellers ble forskjeller mellom gruppene analysert ved anvendelse av Students t-test (to-halet).
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Expression of SOX2 i primærsvulster og tilsvarende metastatiske lesjoner i SOC
Ovarian. kreft vevsprøver fra 64 pasienter ble anvendt i denne studien, og ekspresjon av SOX2 ble analysert i disse vev ved hjelp av immunhistokjemiske (IHC) farging. Som vist i tabell 1, 21 ut av 64 (32,8%) av primær lesjon vev hadde forholdsvis lave nivåer av SOX2 protein, mens 15 av 64 (23,4%) av de metastatiske vev viste lav ekspresjon av SOX2 protein. Men 43 av 64 (67,2%) av primær lesjon vev hadde relativt høye uttrykk nivåer av SOX2 protein, mens 49 av 64 (76,6%) av metastatisk vev viste høye uttrykk nivåer av SOX2 protein. Spesielt uttrykket nivåer av SOX2 var høyere i metastatiske lesjoner enn de i deres sammenkoblede primære tumor vev (Figur 1A og 1B).
(A), (B) representerer to eksempler på 64 tilfeller. Blant A, representerer øvre venstre en primær kreftvev, nedre venstre representerer de tilsvarende metastaser (omentum). Høyre, forstørrelse av vev i svart ramme. Den arragement av B er lik A. (C), (D) Kaplan-Meier-overlevelseskurver analyse viser gjenstand med høy SOX2 ekspresjonsnivået har større risiko for død. Eggstokkreft vev med SOX2 uttrykk (score≥3) ble klassifisert som SOX2 høyt nivå. Blant C, Pasienter med SOX2 høyt nivå (n = 43) hadde signifikant lavere overlevelse enn de med SOX2 lavt nivå (n = 21) i SOC primære vev (
p
= 0,0358, log-rank test). Blant D, Pasienter med SOX2 høyt nivå (n = 49) hadde signifikant lavere overlevelse enn de med SOX2 lavt nivå (n = 15) i SOC metastatisk vev (
p
= 0,0029, log-rank test).
korrelasjonene mellom SOX2 uttrykk og kliniske patologiske faktorer i menneske SOC ble videre undersøkt. Interessant, fant vi ut at SOX2 uttrykket var signifikant assosiert med histologisk grad. Spesielt, SOX2 ekspresjonen var forholdsvis høy i mindre differensierte tumorer (tabell 1). Den positive farging av SOX2 økt gradvis fra G2 til G3 klasse, noe som indikerer at SOX2 protein ble økt under utviklingen av SOC. Ellers var det ingen signifikant sammenheng mellom SOX2 uttrykk og alder eller serum CA125 nivåer.
Foreningen for SOX2 uttrykk med OS (total overlevelse) varighet og priser på ulike måneder ble studert. Pasienter med høyt nivå SOX2 uttrykk hatt kortere OS varighet enn de med lavt nivå SOX2 uttrykk i primær svulstvev og metastatisk vev, henholdsvis (figur 1C og 1D). Sammen utgjør disse funnene antydet at uttrykket av SOX2 kan forutsi dårlig prognose i menneskelig ovarialcancer.
SOX2 øker trekkende og metastatiske potensialer og reduserer vedheft evne SOC celler
For å velge passende cellelinjer for å studere biologiske funksjon SOX2, vi først analysert protein nivåer av SOX2 i seks ovarie tumorcellelinjer. Vi fant at protein nivåer av SOX2 var sterkt variert i ulike eggstokkreft cellelinjer. Som vist i figur 2A og figur 2B, ble ekspresjonen av SOX2 forholdsvis øket i SKOV3 og høyt metastatisk cellelinje Ho8910-pm sammenlignet med moder ovarian cancer cellelinje Ho8910. Uttrykket av SOX2 var relativt lav i godartet ovarian serøs cystadenoma eternalized cellelinje MCV152 og den udødelige menneskelige eggstokkreft epitelial cellelinje Moody.
Semi-kvantitativ RT-PCR analyse av SOX2 i seks eggstokkene tumor cellelinjer. (B) Western blot-analyse av den SOX2 protein ekspresjon i tilsvarende cellelinjer. GAPDH ble anvendt for normalisering. (C) Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse og Western blot analyse av SOX2 i Ho8910-SOX2, Ho8910-pm-siSOX2, SKOV3-siSOX2 celler. GAPDH ble brukt for normalisering.
For å undersøke funksjonen av SOX2 i SOC cellene videre ble SOX2 genet overexpressed av lentiviral infeksjon i Ho8910, som ble bekreftet av real-time PCR og Western blotting (figur 2C). Deretter fant vi ut effekten av SOX2 overekspresjon på spredning av SOC celler. Resultatene viste at overekspresjon av SOX2 genet kunne fremme SOC celleproliferering (figur 3A og figur 3B). Videre undersøkte vi effekten av SOX2 overekspresjon på trekk, invasive og lim evner av SOC cellene ved hjelp av Transwell analyser og celle ECM vedheft analyser. Resultatene viste at overekspresjon av SOX2 proteinet kunne gi en betydelig fremme migrering og invasjon av SOC-celler (figur 4A), samtidig redusere adhesjon av celler til SOC Matrigel, fibronektin, type I kollagen og laminin (figur 5A).
Stabil transfeksjon av SOX2 plasmid fremme celleproliferasjon og klone dannelse (A) CCK8 analyser i HO8910. (B) Clone formasjons analyser i HO8910. Transient transfeksjon av SOX2 siRNA hemme celledeling og klone dannelse (C) CCK8 analyser i HO8910-pm. (D) Clone formasjons analyser i HO8910-pm. (E) CCK8 analyser i SKOV3. (F) Clone formasjons analyser i SKOV3.
(A) Stabil transfeksjon av SOX2 plasmid i HO8910. Top, Transwell migrasjon analyser; Bottom, Transwell invasjons analyser. (B) Transient transfeksjon av SOX2 siRNA i HO8910-pm. Top, Transwell migrasjon analyser; Bottom, Transwell invasjons analyser. (C) Transient transfeksjon av SOX2 siRNA i SKOV3. Top, Transwell migrasjon analyser; Bottom, Transwell invasjons analyser.
(A) Reduser heft etter stabil transfeksjon av SOX2 plasmid i HO8910. (B) Øke heft etter transient transfeksjon av SOX2 siRNA i HO8910-pm. (C) Øke heft etter transient transfeksjon av SOX2 siRNA i SKOV3.
Neste vi slått ned uttrykket av SOX2 genet ved hjelp av forbigående transfeksjon av siRNAs i to cellelinjer med relativt høy uttrykk for SOX2, Ho8910 -PM og SKOV3. Forstyrrelser effektivitet ble bekreftet av real-time PCR og Western blotting (figur 2C). Deretter ble effekten av knockdown av SOX2 på proliferasjonen av disse cellene ble bestemt ved bruk av CCK-8 analyser og klon formasjons analyser. Resultatene viste at forstyrrelse av SOX2 protein redusert spredning av disse SOC-celler (figur 3C-3F). Videre fant vi at knockdown av SOX2 protein uttrykk hemmet trekk og invasive evnene til SOC celler ved Transwell-analyser (figur 4B og 4C), mens fremme celle adhesjon til Matrigel, fibronektin, type I kollagen og laminin (figur 5B og Figur 5C). Tatt sammen, disse resultatene antydet at SOX2 genet kan ha en viktig rolle i cellevekst, migrasjon, invasjon og adhesjon av SOC-celler.
Overekspresjon av SOX2 fører til økt fosforylering av flere pro-proteiner matastatic
Vi ytterligere utforsket de molekylære mekanismene bak SOX2-mediert cellemigrasjon og tumor metastase. Vi fant at stabile overekspresjon av SOX2 resulterte i økt fosforylering av Src og FAK og deres molekylære (P130-CAS) i Ho8910 celler (figur 6). Videre målrettet knockdown av SOX2 genet førte til en redusert fosforylering av disse proteiner i Ho8910-pm og SKOV3-celler (figur 6).
(A) Høyre, Western blot-analyse proteiner uttrykk etter stabil transfeksjon av plasmid SOX2 i ho8910. Middle, western blot analyse proteiner uttrykk etter transient transfeksjon av SOX2 siRNA i HO8910-pm. Høyre, western blot analyse proteiner uttrykk etter transient transfeksjon av SOX2 siRNA i SKOV3. (B) Den arragement av B er lik A.
knockdown av Src fremmer celle adhesjon og reduserer celle migrasjon og invasjon
Resultatene ovenfor antydet at aktiveringen av Src kinase kan være ansvarlig for tyrosinfosforylering av P130-cas i SOC celler. For å avgjøre om Src kinase aktivitet er nødvendig for SOX2-indusert fosforylering av P130-cas, vi banket ned Src genet ved siRNA i Ho8910-vektor og Ho8910-SOX2 celler. Interferens effektivitet ble bekreftet ved Western-blotting (figur 7B). Vi fant at knockdown av Src protein uttrykk hemmet trekk og invasive evner Ho8910-SOX2 celler i Transwell analyser (figur 7A), mens fremme celle adhesjon til matrigel, fibronektin, type I kollagen, men ikke laminin (figur 7C). Videre fant vi at fosforylering av P130-cas kunne dempes i Ho8910-SOX2 celle ved knockdown av Src genet (figur 7B). Sammen utgjør disse resultatene indikerte at Src kinase aktivitet er viktig for SOX2-mediert adhesjon og migrasjon av SOC celler.
(A) Transwell migrasjon og invasjon analyser. (B) Western blot analyse proteiner uttrykk (C) Heft analysen.
Diskusjoner
SOX2 er en viktig regulator for å opprettholde den pluripotency og selvfornyelse av embryonale stamceller og bidrar til omprogrammering av differensierte somatiske celler tilbake til en pluripotent stamcelle tilstand. Mer nylig har forbedret SOX2 ekspresjon blitt påvist i en rekke ondartede svulster som tyder på at SOX2 også regulerer tumorigenesis [3] – [10]. Tallrike studier har vist at høy uttrykk for SOX2 er korrelert med lymfesystemet og vaskulær invasjon, dårlig differensiering, og redusert sykdomsfri overlevelse [3] – [8]
Selv om foreningen av SOX2 uttrykk med dårlig klinisk. resultatet av eggstokkreft har blitt rapportert [11], [12], de funksjonelle roller og mekanismer i denne svulsten var mindre foretatt tidligere, spesielt i tumormetastase og adhesjon. I vår studie, SOX2 overekspresjon fremmet celleproliferasjon og klone formasjon. Men resultatet er ikke fullt ut i samsvar med tidligere rapporter [13], [14]. Dette kan være på grunn av de forskjellige ovarie cancer-cellelinjer som benyttes. Nylig har det blitt rapportert at SOX2 mål fibronektin til å fremme cellemigrering og invasjon i eggstokk-kreft [14]. I denne studien fant vi at Src kinase kan være assosiert med SOX2-induserte endringer i eggstokkreft. Økt invasjon kan være relatert til økt fosforylering av flere pro-metastatiske proteiner indusert av SOX2 overekspresjon.
Src-kinase er en ikke-reseptor tyrosin-kinase, og er kjent for å spille viktige roller i forskjellige signalbaner av proliferasjon, migrering , heft, og angiogenese under svulst utvikling og progresjon [17], [18]. Src kinase er overuttrykt eller aktivert i flere faste tumorer, inkludert brystkreft [19], prostatakreft [20], tykktarmskreft [21], magekreft [22] og kreft i bukspyttkjertelen [23]. Videre har det vist seg at Src var forbundet med SOX2 uttrykk og selvfornyelse av stammen lignende side-populasjonsceller i ikke-småcellet lungekreft [24]. Selv om metastase er en multifaktoriell prosess, er invasjon en kritisk link for kreftceller til å spre. I denne studien fant vi at stabil overekspresjon av SOX2 førte åpenbart økt fosforylering av Src og økt invasjon evne, mens knockdown av SOX2 gen førte til redusert fosforylering nivå av Src og invasjon evne i SOC. Deretter invasjonen muligheten var også redusert etter knockdown av SOX2 eller Src.
p130cas kan fosforylert av Src eller FAK familie kinaser. Det fungerer som et stillas molekyl for å regulere proteinkomplekser som kontrollerer cellemigrering og adhesjon, apoptose, cellesyklus, differensiering og til og med progenitor-cellefunksjon [25], [26], [27]. I denne studien vi også funnet at det fosforylering nivået av p130cas ble regulert av Src-kinase i SOC linjer.
kontroll av celle-matrise-adhesjon spiller også en viktig rolle i å kontrollere kreftcelle migrering under metastase [28]. I det tidlige stadium av tumormetastase, nedsatt adhesjon evne til kreftceller vil føre til kreftcelleavgivelse og invasjon til andre områder. I vår studie, kan vedheft reduksjon også være på grunn av økt uttrykk av matrix metalloproteinaser (MMP2 og MMP9) etterfulgt av overekspresjon av SOX2. Fak fremmet dannelsen av Src-p130cas-Crk-Dock180 signale kompleks, som fører til selektiv heving av Ras GTPase og JNK, og resulterte i økt MMP2 og MMP9 uttrykk [29]. Vi fant at knockdown av Src genuttrykk kan redusere uttrykket av MMP2 og MMP9. MMP2 og MMP9 er viktige metalloproteinaser som forringer ECM og redusere celle adhesjon evne. En annen årsak til adhesjon reduksjonen kan skyldes økt fosforylering nivå av Src og Erk. En studie har vist at Src overekspresjon kan hemme protein ekspresjonsnivået av integrin-underenheten ved Erk i colon tumorceller [30]. Så vi utledet at Src overekspresjon endre uttrykk eller funksjon av inte subenheten i eggstokkreft celler. Dette forklarer også hvorfor høyt uttrykk for FN indusert av SOX2 overekspresjon i eggstokkreft [14], ikke førte til vedheft forbedring [31], men en lavere heft i vår studie. I vår studie SOX2 modulert SOC vedheft til matrigel, fibronektin, type I kollagen, ikke inkludert laminin. Spesifikke mekanismer må bli ytterligere undersøkt.
I denne studien fant vi at en av de mekanismer som SOX2 fremmet SOC cellemigrasjon og metastase er gjennom fosforylering og aktivering av p130cas og høy uttrykk for MMP2 og MMP9 . Det er godt dokumentert at Src-familie-kinaser er de viktigste kinaser som fremmer tyrosinfosforylering av p130cas og øker ekspresjon av MMP2 og MMP9 [26], [32], [33]. Sammen fant vi at SOX2-indusert fosforylering og aktivering er delvis avhengig av aktivering av Src kinase.
I konklusjonen, våre funn antydet at SOX2 spiller en sentral rolle i SOC cellemigrasjon og metastase, og src kinase signalkaskade kan være en viktig del av SOX2 pro-metastatisk signalnettverk i SOC celler.
Takk
Vi er svært takknemlig til professor Didier Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, 1015 Lausanne, Sveits) for å gi pWPXL, psPAX2 og pMD2.G plasmider. Vi takker også Doctor Deshui Jia (Shanghai Cancer Institute, Shanghai, Kina) for hans stor hjelp i språket redigering.
