Abstract
Lungekreft er blant de mest dødelige kreftformer med høy metastaser og tilbakefall, noe som trolig skyldes eksistensen av lungekreft stamceller (cscs). Cscs i mange tumorer, inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er blitt identifisert ved hjelp av adhesjon molekyl CD44, enten individuelt eller i kombinasjon med annen markør (er). MicroRNAs (mirnas) regulerer både normale stamceller og cscs og feilregulering av miRNAs har vært innblandet i tumorigenesis. Nylig ble MIR-34a funnet å være nedregulert i NSCLC celler, men de biologiske funksjonene i MIR-34a i regulerende NSCLC celle atferd har ikke blitt grundig undersøkt. Her viser vi at transfeksjon av syntetisk MIR-34a, men ikke den negative kontroll (NC) miRNA oligonukleotider (oligoer) i tre NSCLC-cellelinjer, det vil si, A549, H460, og H1299, inhiberte deres holoclone formasjon, klonogene ekspansjon, og tumor regenerering in vivo. Videre lentiviral vektor-mediert overekspresjon av MIR-34a i renset CD44
hi H460 celler også hemmet svulst utvekst. I kontrast, uttrykk for MIR-34a antagomirs (dvs. antisense oligonukleotider) i CD44
lo H460 celler fremmet svulst utvikling. Vår studie viser at MIR-34a er en negativ regulator av tumorigene egenskaper NSCLC celler og CD44
hi lunge cscs, og etablerer en sterk begrunnelse for å utvikle MIR-34a som en roman terapeutisk middel mot NSCLC.
Citation: Shi Y, Liu C, Liu X, Tang DG, Wang J (2014) The mikroRNA MIR-34a Hemmer ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) Vekst og CD44
hi Stem-Like NSCLC Cells. PLoS ONE 9 (3): e90022. doi: 10,1371 /journal.pone.0090022
Redaktør: Gokul M. Das, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 29 november 2013; Godkjent: 24 januar 2014; Publisert: 04.03.2014
Copyright: © 2014 Shi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (Grant nr 81141096 og Grant nr 81372512) og Key Prosjekt Fund of Shanghai Science and Technology Association, Kina (Grant nr 05119554) J. Wang, og NIH (R01- CA155693), Department of Defense (PC120817), CPRIT (RP120380), og MDACC Senter for Cancer epigenetikk og RNA Senter Laura John Arnold Foundation tilskudd til DG. Tang. C. Liu ble støttet delvis av en DOD post-doc (PC121553). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cancer stamceller (CSC), dvs. kreft celler med bestemte stamcelleegenskaper, har blitt rapportert i mange humane tumorer og antas å være ansvarlig for startfasen, terapi motstand, progresjon, tilbakefall og metastase [ ,,,0],1] – [3]. MicroRNAs (mirnas), små ikke-kodende RNA, regulere omtrent 20% -30% av genene i det humane genom, og har vært implisert i regulering av proliferasjon, differensiering, migrasjon og apoptose ved inhibering av proteintranslasjon og /eller indusere messenger degradering ved binding til de komplementære sekvenser av den 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) i sine mål mRNA [4], [5]. mirnas kan fungere som både onkogener og tumorsuppressorgener [6], [7], og har dukket opp som viktige regulatorer av cscs også.
mikroRNA-34a (MIR-34a) fungerer som en tumor suppressor [ ,,,0],8] og er nedregulert i noen humane kreftformer, inkludert brystkreft [9], prostatakreft [10], osteosarkom [11], og lungekreft [12], [13]. Lungekreft er den mest dødelig malignitet over hele verden. Arbeidet i de siste årene viser at både små-celle (SCLC) og ikke-småcellet (NSCLC) lungekreft inneholde cscs [14], [15]. Som i de fleste andre tumorer, har potensielle lunge cscs blitt anriket og renset ved anvendelse av funksjonelle analyser [16] – [18], så vel som celleoverflatemarkører så som CD133, CD34, CD90, CD44 og [3]. CD44 er et membranbundet glykoprotein som medierer en kompleks rekke funksjoner. Noen studier har vist at CD44
+ celler er anriket for tumor utbredende kapasitet, og at CD44 er en potensiell CSC markør i NSCLC [19]. Liu
m.fl.
har vist at Mir-34a kan hemme prostata cscs og metastasering av direkte undertrykke CD44 [20]. Identifisering av CD44 som en direkte og funksjonelt relevant MIR-34a mål avslører en tidligere verdsatt signalveien [20].
Selv om det er bevis for at MIR-34a er redusert i NSCLC, de biologiske funksjonene i denne miRNA i NSCLC forbli lett undersøkt. I denne studien, ved hjelp av en rekke biologiske analyser kombinert med omfattende xenograft tumor eksperimenter, rapporterer vi at Mir-34a negativt regulerer CSC-tilknyttede eiendommer samt tumor-initiering kapasitet på tre NSCLC celler.
Materialer og metoder
Dyr og dyreforsøk
immun~~POS=TRUNC NOD-SCID (ikke-overvektige diabetikere alvorlig kombinert immunmangel) mus ble produsert for det meste fra våre egne hekkekolonier og vedlikeholdes i standardbetingelser i henhold til institusjonelle retningslinjer. Alle dyrerelaterte studier på dette prosjektet har blitt godkjent av M.D. Anderson Cancer Center IACUC (Institutional Animal Care og bruk komité; ACUF # 08-05-08132). Den nåværende forskning innebærer ikke mennesker (dvs. levende individer eller identifiserbare privat informasjon). Alle andre studier presentert her var de etterforsker initierte og ikke krever godkjenning fra andre kontrollorganer.
Cells og grunnleggende eksperimentelle prosedyrer
De tre humane NSCLC cellelinjer (A549, H460, og H1299 ) ble oppnådd fra ATCC. Alle celler ble opprettholdt i media anbefalt av ATCC supplementert med 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen-Life Technologies). Celler ble inkubert i en fuktet inkubator ved 37 ° C som følger med 5% CO
2. Celler ble rutinemessig opprettholdt i 75 cm
2 vevskulturflasker (Corning Incorporated, USA) og høstes ved hjelp av 0,05% trypsin. Mest grunnleggende eksperimentelle prosedyrer er beskrevet i våre tidligere publikasjoner [20], [21].
Transient transfeksjon med syntetiske oligonukleotider (oligo)
Vi transfektert bulk celler eller renset CD44
+ NSCLC celler med 33 nm MIR-34a eller ikke-måls negative kontroll miRNA (MIR-NC) oligonukleotider (Ambion, Austin, TX) ved å bruke Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Alternativt transfektert vi de rensede CD44
– NSCLC celler med 33 nM av anti-MIR-34a (anti-34a) eller anti-MIR-NC (anti-NC) oligoer (Ambion). Vi vanligvis høstet de transfekterte celler for in vitro eller in vivo studier etter dyrking i 48 timer.
Lentiviral-mediert overekspresjon av MIR-34a
En lentiviral vektor koding forhånds MIR-34a (Lenti -34a) og styrevektor (lenti-CTL) ble oppnådd fra Systems Biosciences (SBI) [20]. Lentivirus ble produsert i 293ft emballasje celler og titers fastsatt for GFP å bruke HT1080 celler. NSCLC-celler ble infisert ved en MOI på 25 i nærvær av 8 mikrogram /ml polybren og høstet 48-72 timer etter infeksjon.
Kvantitativ RT-PCR
Mature miRNA og CD44 mRNA-nivåer ble kvantifisert ved bruk av TaqMan mikroRNA Analyser (Applied Biosystems) [20]. Kort fortalt ble totalt RNA isolert med Mirvana PARIS miRNA Isolation Kit (Ambion). Kvantitative miRNA uttrykket data ble normalisert til interne «rengjøring» mirnas, dvs. MIR-24 og MIR-103. Kvantitative mRNA expression data ble normalisert til interne «housekeeping» mRNA, dvs. GAPDH. Forskjeller mellom den positive og tilsvarende negative populasjoner, dvs. ddCt verdier, for hver av de mirnas eller mRNA’ene ble omdannet til prosent av ekspresjon ved hjelp av formelen 2
-ddCt [20].
Klonal og klonogene analyser
for holoclone assays [22], belagt vi NSCLC-celler ved en klonal tetthet (dvs. 50 celler /brønn) i en 6-brønners skål, telles antall holoclones flere dager senere, og presenterte andelen celler som etablerte en holoclone som kloning effektivitet. For klonogene analyser [20], for det første, blandet vi metylcellulose (MC) med serumfritt medium supplert med 5 ug ml-1 insulin, 20 ng ml-1 EGF og 10 ng ml-1 bFGF (Sigma). Deretter sådd vi cellene generelt ved 1000 celler /brønn i MC blandingen ved forholdet 1:10 i 24-brønners ultra-lav festet (ULA) plater og som er oppregnet kolonier 2-3 uker etter plettering. For alle ovennevnte eksperimenter, kjører vi et minimum tredoble brønner for hver tilstand og gjentatt eksperimentene når gjennomførbart.
Flowcytometri analyse og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)
Uttrykk for CSC markører ble evaluert ved flow cytometri. Cellene ble farget bor i fargeløsning som inneholder BSA og FITC-konjugert monoklonalt anti-CD44 (klon # G44-26, BD Biovitenskap) eller PE-konjugert monoklonalt anti-CD133 (klon # AC133, Miltenyi Biotech) ved konsentrasjon anbefalt av produsenter. Tilsvarende isotype-matchet mus immunglobuliner ble brukt som negative kontroller (BD Bioscience). Minst 10.000 celler ble analysert. For celle sortering, ble merking av celleoverflatemarkører utført under steriliserte forhold og celler ble sortert etter BD FACSVantage Cell sorter (BD Biovitenskap). Den øverste 10% kraftigst farget, og de nederste 10% mest svakt fargede celler ble valgt som de positive og negative populasjoner, henholdsvis. Sortering renhet på over 90% ble sørget for ytterligere in vitro og in vivo eksperimenter. Alle data ble analysert ved FlowJo programvaren (versjon 7.6.1).
Aldefluor analysen
Aldefluor Assay Kit (Aldagen, Inc. Durham, North Carolina) ble brukt til å profilere aldehyd dehydrogenase ( ALDH) aktivitet hos NSCLC celler [23]. Celler ble inkubert i Aldefluor analysebuffer inneholdende ALDH proteinsubstrat BODIPY-aminoacetaldehyd (BAAA) i 40 minutter ved 37 ° C. Celler som kan katalyserer BAAA til sin fluorescerende produkt BODIPY-aminoacetat (BAA) ble ansett ALDH
+. Sortering porter for FACS ble trukket i forhold til cellenes utgangs fluorescens, som ble bestemt ved tilsetning av ALDH spesifikk hemmer diethylaminobenzaldehyde (DEAB) i løpet av inkubasjonen og DEAB-behandlede prøver tjente som negative kontroller. Ikke-levedyktige celler ble identifisert ved propidium jodid (PI) positivitet. Cellene ble sortert etter BD FACSVantage Cell sorter.
Tumor transplantasjonsforsøk
Celler ble injisert i 60 mL av medium:Matrigel blanding (01:01) subkutant (sc) i NOD /SCID mus ( 6-8 uker gamle). Vi transfektert bulk H460, A549, eller H1299 celler med MIR-34a eller MIR-NC oligonukleotidene (33 Nm). 48 timer senere, tre forskjellige celle doser på 500 000, 50 000, eller 5000 ble implantert. For H460-celler, ytterligere 2 millioner celler som hver (n = 7) ble implantert. I tillegg til oligo transfeksjon, vi også smittet noen celler med lenti-34a eller lenti-CTL vektorer (MOI 25) [20], og 48 timer senere, tre celle doser på 500 000, 50 000, 5000 ble implantert. Endelig transfektert vi renset CD44
lo H460 celler med anti-34 eller anti-NC oligonukleotidene (33 nM) og også smittet renset CD44
hi H460 celler med lenti-34a eller lenti-ctl vektorer (MOI 25). 48 timer senere ble cellene ved forskjellige doser implantert. Tumorveksten ble undersøkt på en daglig basis og individuelle tumorvolum ble målt ved hjelp av et digitalt skyvelære og tilnærmet i henhold til formelen V = 1 /2ab
2 (a er den lengste diameter og b den korte diameter av tumoren). På slutten av forsøkene, ble musene avlivet og svulster ble høstet, målt og fotografert.
Statistisk analyse
Vi brukte uparet tosidige Student
t
-test for å sammenligne forskjeller i celle tall, kloning effektivitet, tumor vekter, og andre relaterte parametere. Vi ansatt Chi-kvadrat test for å sammenligne forekomsten og ventetid. Vi brukte ANOVA (F-test) for å sammenligne forskjeller i flere grupper. I alle disse analysene, en
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Diskusjon
MIR-34a hemmer NSCLC celle holoclone formasjon og klonogene kapasitet
Resultater og.
MIR-34a har vist seg å ha tumorundertrykkende funksjoner [8], [20], [21], [24] – [33], og til å være under-uttrykt i noen tumorer, så vel som visse tumorigen subpopulasjoner [ ,,,0],10] som CD44
+ prostata cscs [20]. MIR-34a er en direkte p53 target [32] og dens promoter er forstummet i enkelte kreftceller [30]. Det har vært noen eksperimentelle bevis for at Mir-34a er nedregulert i NSCLC celler [12], [13]. For å belyse den potensielle biologiske konsekvensen av tap av miR34a ekspresjon i NSCLC-celler, ser vi først transfektert tre NSCLC-celler, A549 (p53 villtype), H460 (p53 villtype), og H1299 (p53 mutant), med syntetisk modne speil 34a eller MIR-NC oligoer (33 nM) [20] i 48 timer, og deretter platet cellene i triplikat ved klonal tetthet (dvs. 50 celler /brønn) i 6-brønns plater. Vi så vurdert dannelsen av holoclones, som har vist seg å nære selvfornyende cscs som kan langsiktig forplanter svulster [22], 12 dager (d) etter plating. Som vist i figur 1 (A-C), MIR-34a-overekspresjon i betydelig grad hemmet holoclone etablering i alle tre modellene NSCLC. Av betydning, selv om MIR-NC transfektert NSCLC celler dannet store og tettpakkede holoclones, Mir-34a transfektert NSCLC celler grunnlagt mye mindre og /eller løst pakket paraclones (se Figur 1B for eksempler). Deretter utførte vi strengere, forankrings-uavhengig, klonogene analyser i metylcellulose (MC), som har blitt mye brukt for å måle celleautonome aktiviteten av potensielle cscs [3]. Som i klonale analyser, MIR-34a overekspresjon sterkt hemmet sfæren dannende kapasitet av bulk A549, H460 og H1299-celler (figur 1D-E).
(A-C) Klonale analyser. Celler transfektert med MIR-34a eller MIR-NC oligoer (33 nM) ble platet ut in triplo på 50 celler /brønn på 6-brønners plater. Forsøket ble avsluttet ved 12 d og brønnene ble Giemsa-fargede (A). Vist i B er representative bilder. Resultatene vist i A og B var representative for to uavhengige eksperimenter. (C) Kvantitativ presentasjon av resultatene i A. Søyler representerer gjennomsnitt ± S.D. (D-E) klonogene analyser i MC. En total på 1000 celler per brønn ble sådd ut for klonogene analysen. Bilder ble tatt på d 15 etter plating og vist i D er representative felt. (E) Kvantitativ presentasjon av resultater i D. Barer representerer gjennomsnitt ± standardavvik
De ovennevnte eksperimentelle resultatene gir bevis for at restaurering av MIR-34a uttrykk hos NSCLC celler hemmer både klonale og klonogene egenskaper. Som de 3 NSCLC cellene har forskjellig p53 status, resultatene tyder også på at de hemmende effekter av MIR-34a er p53-uavhengig. Som forventet, celler transfektert med Mir-34a oligonukleotidene viste økt dramatisk MIR-34a nivåer som vurdert av qPCR analyse av modne MIR-34a (figur 2A). Interessant, men de 3 NSCLC celletyper viste en stor variasjon i de økte MIR-34a nivåer, med H1299 celler beholde den høyeste mengden av eksogent MIR-34a 48 timer etter transfeksjon (Figur 2A). Som diskutert tidligere, er MIR-34a et direkte mål transkripsjonen av p53 [32] og H1299 celler har mutert p53. En mulighet er at både p53 og MIR-34a nivåer i lungekreftceller må være veldig kontrollert. Følgelig, i A549 og H460-celler som har villtype p53, blir enda eksogent innførte p53 nedbrytes raskt mens det i p53-mutant H1299-celler, de transfekterte modne MIR-34a oligoer overleve mye lenger (figur 2A).
(A) NSCLC celler fersk transfektert med MIR-34a oligonukleotidene viste MIR-34a nivåer flere størrelsesordener høyere enn de transfektert med MIR-NC oligos. De angitte NSCLC-celler ble transfektert med MIR-34a eller MIR-NC oligoer, og 48 timer senere, ble høstet og anvendt i tumor eksperimenter (nedenfor), mens et lite antall av celler ble satt til side og anvendt i QRT-PCR måling av speil 34a mRNA nivåer. Vist er gjennomsnitts MIR-34a nivåer (i log skala; n = 2) i MIR-34a transfekterte celler i forhold til de i MIR-NC transfekterte celler (faktiske gjennomsnittsverdier som er angitt i barene). (B-D) MIR-34a oligo transfeksjon hemmet A549 tumorvekst. Indikert er svulst forekomst (svulster utvikles /antall injeksjoner;%), tid for innhøsting (inkludert selve injeksjons og termineringsdato), mener svulst vekt (i gram), og
P
verdier for kreft vekter. Brutto tumor bilder er ikke i samme skala. (E-G) MIR-34a oligo transfeksjon hemmet H460 tumorvekst. (H-L) MIR-34a oligo transfeksjon hemmet H1299 tumorvekst.
Bevis for at Mir-34a overekspresjon også hemmer tumor utvikling
Vi deretter vurdert de potensielle krefthemmende effekter av MIR-34a på de tre NSCLC celletyper in vivo (figur 2). Vi transfektert 33 nM av MIR-34a eller MIR-NC oligonukleotidene i A549 celler i 48 timer og deretter implantert 50000 (50 k) celler subkutant (s.c) inn immun-mangel NOD /SCID-mus. Som vist i figur 2B-D, MIR-34a-transfekterte celler utviklet svulster som bare var omtrent halvparten av størrelsen på MIR-NC tumorer og det tidligere også vokste langsommere. Det skal bemerkes at forskjellen i tumorvekt var ikke statistisk signifikant på grunn av de relativt små prøvestørrelser. Tilsvarende MIR-34a overekspresjon H460 celler utviklet mye mindre og tregere voksende svulster i forhold til Mir-NC transfektert H460 celler (Figur 2E-G). H460 celler infisert med en MIR-34a lentiviral vektor (dvs. lenti-34a) også regenereres mindre og tregere voksende svulster enn kontrollgruppen vektor infiserte celler (figur S1 A-C). Viktigere, MIR-34a overekspresjon i H460 celler redusert svulst forekomst (75% i MIR-NC vs. 50% i MIR-34a,
P
0,01; Figur 2E). Til slutt, vi utførte en begrensende fortynning svulst analysen ved å implantere 5 k, 50 k, eller 500 k av MIR-NC eller MIR-34a transfektert H1299 celler i NOD /SCID-mus og på hver celle dose vi observert mindre og tregere voksende svulster avledet fra MIR-34a overekspresjon celler sammenlignet med svulster fra MIR-NC transfektert H1299 celler (Figur 2H-L). Igjen, MIR-34a overekspresjon redusert svulst forekomst på to celle doser implanterte (dvs. 5 k og 500 k,
P
0,01; Figur 2I). Faktisk, MIR-34a transfektert H1299 celler viste signifikant lavere tumor initiere frekvens (TIF) enn tilsvarende MIR-NC-kontroller (
P
= 4.64E-179) som bestemmes ved å bruke Limdil funksjon av Statmod pakken (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html). De relativt sterkere tumor-hemmende effekter av MIR-34a på H1299-celler med hensyn til tumor forekomst er sannsynligvis relatert til mye høyere nivåer av eksogent MIR-34a i transfekterte H1299-celler (figur 2A).
Som i tilfellet av A549 celler, forskjellene i kreft vekter i MIR-34a vs. MIR-NC transfektert H460 og H1299 cellene nådde ikke statistisk signifikans, sannsynligvis på grunn av relativt små utvalg (Figur 2E og henholdsvis 2I,), som er en svært vanlig fenomen i slike xenograft tumor analyser. En annen plausibel forklaring er at de transfekterte oligos ble gradvis dårligere in vivo, som vi har gjentatte ganger observert i lignende svulst eksperimenter ved hjelp av MIR-34a [20] og la-7 [21] oligos. Til støtte, de resterende tumorer avledet fra MIR-34a transfekterte celler viste ingen økning i MIR-34a (data ikke vist), i motsetning til det nettopp transfekterte celler (figur 2A). En interessant observasjon var at p53-mutant H1299-celler opprettholdt signifikant høyere nivåer av eksogent MIR-34a (figur 2A), som også ut til å manifestere de sterkeste tumor-hemmende virkninger i denne cellelinjen (sammenlign figur 2I vs. figur 2B og 2E ).
MIR-34a overekspresjon hemmer CD44
hi H460 svulst regenerering mens anti-34a fremmer tumorvekst i renset CD44
lo H460 celler
Det har vært sterke eksperimentelle bevis for at MIR-34a kan manifestere tumor-hemmende effekter ved å målrette cscs [10], [20], [21] og NSCLC cellekulturer har vist til havn stammelignende kreftceller [3], [14] – [19]. Derfor lurer vi på om de biologiske effektene av MIR-34a på de 3 NSCLC celler (figur 1 og 2) kan være knyttet til sin handling på stilk-lignende kreftceller. For å løse dette spørsmålet, vi først bestemt prosentandelen av celler som var positive for Aldefluor, CD44, CD133 og, analyser eller markører ofte brukt for å berike lunge cscs. Vi har observert ~1-2% Aldefluor positiv H460 og H1299-celler, noe som i stor grad var «ablasjon» i nærvær av ALDH inhibitor DEAB (figur 3). Av ukjente grunner flere gjentatte eksperimenter viste at 90% av A549 celler ble Aldefluor-positive og denne andelen ble ikke påvirket av DEAB (figur 3). Praktisk talt 100% av A549, H460, og H1299 cellene ble CD44-positive (middelverdier er 97,2%, 99,3% og 99,2%, henholdsvis; n = 3) (figur 3). I motsetning til dette, var det nesten ingen ekspresjon av CD133 i disse tre NSCLC-cellelinjer (figur 3C). Det er interessant at disse analysene kan identifisere overlappende bestander av stammelignende NSCLC celler som renset ALDH
hi H1299 celler viste høyere nivåer av CD44 mRNA (Figur S1D). I innledende studier, implantert vi 5 k eller 10 k rensede ALDH
hi og den tilsvarende ALDH
lo H1299 celler i NOD /SCID-mus. Ved 5 k, den ALDH
hi og ALDH
lo celler utviklet 4/5 (1,22 g, 0,32 g, 0,24 g og 0,12 g) og 1/7 (0,99 g) svulster, henholdsvis. Ved 10 k, den ALDH
hi og ALDH
lo celler utviklet 3/8 (0,36 g, 0,2 g, 0,1 g) og 1/8 (0,03 g) svulster, henholdsvis. Disse foreløpige resultatene tyder på at ALDH
hi H1299 celler ha høyere tumor-regenererende kapasitet, en viktig CSC egenskap.
(Til toppen) Den Aldefluor analysen i 3 NSCLC celler. DEAB-behandlede prøver tjente som negative kontroller. ~1-2% H460 og H1299 celler ble Aldefluor-positive, mens 90% av A549 celler ble Aldefluor-positive. (Midt) Representant flowcytometri profilen til CD44 (FITC) uttrykk i 3 NSCLC celler. Praktisk talt 100% av A549, H460, og H1299 cellene ble CD44-positive (middelverdier er 97,2%, 99,3% og 99,2%, henholdsvis; n = 3). (Bottom) Flowcytometri analyse av CD133 (PE) uttrykk i 3NSCLC celler. Det var nesten ingen uttrykk for CD133 i disse tre NSCLC cellelinjer.
I PC3 prostatakreftceller, nesten 100% cellene er positive for CD44 [34]. Det er imidlertid PC3-celler som uttrykker svært høye nivåer av celleoverflate-CD44 (dvs. CD44
hi) og de lave nivåer av CD44 (dvs. CD44
lo). Av betydning, CD44
hi PC3 celler viste signifikant høyere klonale og klonogene potensialer enn isogene CD44
lo PC3 celler [34]. Tegning på denne analogien, vi renset ut CD44
hi (dvs. topp 10%) og CD44
lo (dvs. bunn 10%) H460 celler (figur 4A). Som forventet, CD44
hi H460 cellene uttrykte høyere nivåer av CD44 mRNA enn CD44
lo H460 celler (
P
= 0,0009) (figur 4B). Bemerkelsesverdig, lentiviral-mediert MIR-34a overekspresjon i CD44
hi H460 celler betydelig hemmet tumorvekst (figur 4C, E og F). Mer imponerende, anti-MIR-34a antagomirs [20] dramatisk fremmet svulsten regenerering og tumor vekst på CD44
lo H460 celler i alle tre celle doser (100 k, 10 k, og 1 k) testet (figur 4D , G-J).
(A-B) CD44 ekspresjon nivå. (A) Representative diagrammer av strømningscytometri-analyse av CD44 (FITC) ekspresjon i H460-celler. (B) CD44 mRNA nivåer i renset CD44
Hei og CD44
lo H460 celler vurderes av QRT-PCR. (C, E, F) MIR-34a overekspresjon i renset CD44
hi H460 celler ved lentiviral infeksjon hemmet svulst gjenfødelse. (C) Indikert er svulst forekomst (svulster utviklet /antall injeksjoner;%), tid for innhøsting (inkludert selve injeksjons og termineringsdato), mener svulst vekt (i gram, F), og
P
verdier for tumor vekter. Brutto tumor bilder er ikke i samme skala. (E) Den tumorvekstkurve. (D, G-J) Anti-MIR-34a fremmet tumorvekst av renset CD44
lo H460 celler. (D) Indikert er svulst forekomst (svulster utviklet /antall injeksjoner;%), tid for innhøsting (inkludert selve injeksjons og termineringsdato), mener svulst vekt (i gram, G), og
P
verdier for tumor vekter. Brutto tumor bilder er ikke i samme skala. (H-J) Svulsten vekstkurve ved tre ulike celle doser.
I sammendraget, har vi vist at Mir-34a overekspresjon hemmer NSCLC celle holoclone dannelse og klonogene ekspansjon in vitro, og enda viktigere, tumor regenerering in vivo. Disse hemmende effekter av MIR-34a kan skyldes dens virkning på stilk-lignende NSCLC celler. Til støtte for denne muligheten, håndheves uttrykk for MIR-34a spesifikt i CD44
hi H460 celler sterkt hemmet deres tumor-regenererende aktivitet mens antagonister av MIR-34a dramatisk fremmet svulst regenerering i CD44
lo H460 celler. Disse observasjonene stemmer overens med CD44 være en direkte og funksjonell målet på MIR-34a i prostata [20] og noen andre kreft [31] celler og foreslår at Mir-34a regulerer negativt svulsten-initiere kapasitet på NSCLC cscs. Fremtidig arbeid vil ta sikte på å belyse de underliggende mekanismer og interaksjoner mellom MIR-34a og CD44 uttrykk i NSCLC celler.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
MIR-34a hemmer H460 tumorvekst og ALDH
hi H1299 celler uttrykker høyere CD44 mRNA nivåer. (A-C) Lentiviral-mediert MIR-34a overekspresjon i H460-celler hemmet tumorvekst. (A) De endepunkt tumor vekter. (B og C) Tumor vekstkurver ved to forskjellige celle doser. (D) De CD44 mRNA nivåer i renset ALDH
hi og tilsvarende ALDH
lo H1299 celler vurderes av QRT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090022.s001 plakater (TIF)
takk
Vi takker T. Davis for å få hjelp i alle kreftforsøk og P. Whitney for FACS. Vi takker også andre medlemmer av Tang lab for nyttige diskusjoner og support.
