Abstract
Vedvarende RET aktivering er en hyppig hendelse i papillær thyroideakarsinom (PTC) og medullær skjoldbruskkjertelen carcinoma (MTC). I disse kreftformene, aktiverer RET ERK /MAPK, de PI3K /AKT /mTOR og JAK /Stat3 veier. Her testet vi effekten av en JAK1 /2-hemmer, AZD1480, i
in vitro Hotell og
in vivo
veksten av skjoldbrusk kreft cellelinjer som uttrykker onkogene RET. Skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer husing
RET Twitter /PTC1 (TPC-1),
RET
M918T (MZ-CRC1) og
RET
C634W (TT) endringer, samt TPC-1-xenotransplantater, ble behandlet med JAK-inhibitor, AZD1480. Denne inhibitor førte til vekst-inhibering og /eller apoptose av skjoldbruskkreftcellen linjene
in vitro
, så vel som til tumorregresjon av TPC-1-xenografter, hvor det effektivt blokkerte STAT3 aktivering i tumor og stromale celler. Denne hemmingen ble assosiert med redusert spredning, redusert blodårer tetthet, kombinert med økt nekrose. Men AZD1480 undertrykte veksten av STAT3- mangel TPC-1 celler
in vitro Hotell og
in vivo
, viser at effektene i denne cellelinjen var uavhengig av STAT3 i kreftceller. I alle cellelinjer, JAK hemmer redusert fosfor-Y1062 RET nivåer, og mTOR effektor fosfor-S6, mens JAK1 /2 downregulation av siRNA ikke påvirker cellevekst eller RET og S6 aktivering. Som konklusjon, AZD1480 effektivt blokkerer proliferasjon og tumorvekst av aktiverte RET- tyroid cancer-cellelinjer, sannsynligvis gjennom direkte RET hemming i kreftceller, så vel som ved modulering av mikromiljøet (f.eks via JAK /fosfo-STAT3 inhibering i endotelceller). Dermed AZD1480 bør vurderes som et terapeutisk middel for behandling av RET- aktivert skjoldbrusk kreft
Citation. Couto JP, Almeida A, Daly L, Sobrinho-Simões M, Bromberg JF, Soares P (2012) AZD1480 blokker Vekst og tumorigenesis av RET- Aktivert skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer. PLoS ONE 7 (10): e46869. doi: 10,1371 /journal.pone.0046869
Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR), Italia
mottatt: 18 juni 2012; Godkjent: 06.09.2012; Publisert: 02.10.2012
Copyright: © Couto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den portugisiske Foundation for Science and Technology (FCT). Joana P. Couto er støttet av en FCT stipend SFRH /BD /40260/2007. Ana Almeida er støttet av en FCT stipend SFRH /BD /79135/2011. J. Bromberg støttes av R01-CA87637-06, U54: CA148967, Marjorie og Charles Holloway Foundation, Lerner Foundation, Sussman Family Fund og Astra Zeneca. IPATIMUP er en Associate Laboratory av den portugisiske departementet for vitenskap, teknologi og høyere utdanning som er delvis støttet av FCT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller manuskript forberedelse
Konkurrerende interesser:. Jacqueline Bromberg har fått forskningsmidler fra Astrazeneca. Hun har hatt en rådgivende rolle i Astrazeneca og Mediummune og fikk Honoria for forelesninger. Det finnes ingen patenter eller produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
omorganisert under Transfeksjon (RET) proto-onkogen koder for en av de første reseptor tyrosinkinaser (RTK) som ble funnet å være involvert i kreft [1]. RET ligander tilhører den glial avledet neurotrofisk celle- (GDNF) familien, og som ved inngrep med RET, indusere autofosforylering av intracellulære tyrosinrester, hvor flere adaptere binde [2]. Disse adaptere medierer aktivering av flere veier, deriblant mitogen aktivert proteinkinase (MAPK) signalveien, i fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) vei, c-jun N-terminal kinase (JNK) reaksjonsveien, p38 vei, SRC, ERK5, PLC-γ og Signal Svinger og Activator av transkripsjon (STAT) 3 [3].
den første onkogen rolle RET ble beskrevet i den vanligste endokrine kreft, papillær thyroideakarsinom (PTC) [4] , som et resultat av genomiske rearrangementer som fører til dens konstitutiv aktivering og til økt celleoverlevelse, proliferasjon og motilitet [5].
RET Twitter /PTC rearrangementer er den nest vanligste genetisk endring i PTC, som finnes i 30% av tilfellene [6].
RET
punktmutasjoner ble også funnet i medullær skjoldbruskkjertelen carcinoma (MTC) [7], [8], og står for nesten all arv tilfeller og ca 50% av sporadisk MTC [9].
onkogen RET har vært implisert i mediering av tumor-assosiert betennelse, som mutante former av RET indusert ekspresjon av IL-8 [10] og andre inflammatoriske molekyler [11]. Videre RET /PTC oppregulert et sett av inflammation- beslektede gener i thyrocytes [12], [13] og mange av disse hører til IL-6 /JAK /STAT3 sti [14]. IL-6 /JAK /STAT3 signale utløses av IL-6 kopling til sin reseptor-komplekset, omfatter en reseptor for IL-6 (IL-6R), og den signaloverførende komponent, gp130 [15]. Påfølgende fosforylering av reseptor-assosiert Jaks formidler tyrosinfosforylering av statistikk, spesielt STAT3. I tillegg IL-6 aktiverer ERK /MAPK og PI3K /AKT trasé [16]. Deregulert JAK /STAT-signalering (hyperaktive) er blitt beskrevet i en rekke sykdommer, inkludert kreft [17] – [20]. Selektive JAK1 /2 små-molekyl-hemmere som er utviklet for å behandle JAK- mutert myeloproliferative lidelser [21], [22] er for tiden i kliniske studier for en rekke kreftformer. AZD1480 er en potent liten-molekyl JAK1 /2-inhibitor [23] som er under fase I-kliniske forsøk for behandling av myeloproliferative sykdommer. Vi undersøkte effekten av AZD1480 på IL-6 /JAK og RET- avhengige signalisering (STAT3, ERK /MAPK og PI3K /AKT) så vel som dets biologiske virkninger i human thyroid kreft modeller (cellelinjer og en xenograft modell). AZD1480 effektivt hemmet veksten og tumorigenesis av skjoldbrusk kreft cellelinjer som bærer onkogene
RET
endringer, sannsynligvis gjennom hemming av PI3K /AKT signalering, som støtter bruk av denne inhibitor for pasienter med skjoldbrusk kreft, spesielt de med avansert MTC, for hvem er det ingen effektive behandlingsalternativer.
Resultater
AZD1480 blokkerer veksten av skjoldbruskkjertelen kreftcellelinjer som bærer
RET
onkogene endringer
i denne studien , bestemt vi følsomheten av skjoldbruskkjertelen kreftcellelinjer husing onkogene former for
RET
til JAK1 /2-hemmer, AZD1480. Spesielt vi analysert PTC-avledet TPC-en (
RET Twitter /PTC1 omorganisering), MTC-avledet MZ-CRC1 (
RET
M918T mutasjon) og TT (
RET
C634W mutasjon) cellelinjer. Som sammenligning behandlet vi de samme cellelinjene med et MEK1 /2-inhibitor, AZD6244, som har vist seg å ha lav effekt i
RET
-mutated celler [24], i motsetning til
BRAF
-mutated celler. I samsvar brukte vi to andre skjoldbrusk kreft cellelinjer, K1 (PTC-avledet) og C643 (anaplastisk skjoldbrusk carcinoma- avledet) som havne
BRAF
V600E og
HRAS
G13R mutasjoner, henholdsvis som kontroller av AZD6244 effekt. Cellene ble behandlet over 5 påfølgende dager med AZD6244, AZD1480 eller en kombinasjon av både narkotika, og celletettheten ble bestemt.
AZD1480 hemmet veksten av alle
RET
-mutated /omorganiseres cellelinjer etter 1 (MZ-CRC1, TT) og 2 dager (TPC-1) behandling (p 0,0001, fig. 1A) og minimalt redusert vekst av C643, mens du har ingen effekt på K1 (fig S1.). Vi har observert at AZD6244 minimalt redusert vekst av C643 og MZ-CRC1 etter 4/5 dager med behandling (p 0,001 Fig. 1A og S1), hadde ingen effekt på veksten av TT (Fig. 1A) og reduserte TPC- en vekst med 50% etter 5 dagers behandling. I motsetning til dette, AZD6244 hemmet effektivt veksten av
BRAF
– mutant K1-cellelinje (Fig. S1). Intet additiv eller synergistisk effekt av kombinert inhibering av Meks og Jaks ble observert. AZD1480 inhiberte ikke veksten av en ikke-ondartet rotte skjoldbruskcellelinje, PCCl3 (Fig. 1A). IC50-er for AZD1480 ble bestemt til å være i høy nM området (~200-450 nM) for disse cellelinjer (Fig. 1B og S2), og redusert som en funksjon av tid (48 og 72 timer), noe som tyder på en cytostatisk virkning (fig. 1B).
(A) TPC-1, ble MZ-CRC1 og TT-cellelinjer behandlet med AZD6244 (1 uM), AZD1480 (1 uM), og en kombinasjon av begge medikamenter (1 pM hver) for den angitte tid. En rotte avledet ikke-ondartet skjoldbruskcellelinje, PCCl3, ble behandlet med AZD1480 (1 uM) eller kontroll DMSO. Vekst ble bestemt ved sulphorhodamine B analysen. (B) Cellelinjer ble behandlet i 48 eller 72 timer med forskjellige konsentrasjoner av AZD1480 (0,1, 0,5 og 1 um) og celletettheten ble bestemt. Data er vist som gjennomsnitt ± SE av tre uavhengige eksperimenter. *** P. 0,0001
Gitt følsomheten
RET
-mutated /omorganiseres cellelinjer til AZD1480, vi videre analysert cellesyklusen profilen til TPC-en, MZ- CRC1 og TT behandlet i 72 timer med AZD1480 (fig. 2A). JAK inhibitor førte til en G1 arrest i TPC-1 (94% mot 79% i kontrollgruppen, p = 0,01). I de tre cellelinjene, ble prosentandelen av celler i S-fase ble redusert etter behandling AZD1480 (TPC-1: 2% mot 8% i kontrollgruppen, p = 0,01; MZ-CRC1: 4% vs. 11%, p = 0,004; TT: 6% vs. 11%, p = 0,09). På tilsvarende måte, andelen av celler i G2 /M ble også redusert i TPC-1-celler behandlet med den JAK inhibitor (1% vs. 13% i kontrollgruppen, p = 0,01). I MZ-CRC1 og TT, en betydelig økning i den subG1 populasjonen (indikativ for celledød ved apoptose) ble påvist (18% vs. 2%, i DMSO-behandlede, p = 0,04, og 11% mot 0,6%, p 0.0001 , henholdsvis) etter 72 timer med AZD1480 behandling. For å bekrefte virkningen av AZD1480 i apoptose, ble cellelinjer behandlet med AZD1480 i 48 timer og farget med TUNEL-reagens, og viser en økning i antallet av apoptotiske MZ-CRC1 (p = 0,02) og TT (p = 0,1) -celler sammenlignet til DMSO-behandlede celler (fig. 2B). Som ventet gjorde AZD1480 fremkalte ikke noen apoptose i TPC-1 (Fig. 2B). Parallelt vi observerte økte nivåer av den cyklin-avhengige kinase inhibitor, p27, og reduserte nivåer av cyklin D1 og av anti-apoptotiske protein, BCL-2, i AZD1480- behandlede celler (Fig. 2C).
(A) TPC-1, MZ-CRC1 og TT ble behandlet med AZD1480 (1 uM +) i 72 timer. Celler ble underkastet syklusprofilanalyse ved strømningscytometri. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SE). (B) Celler ble behandlet med AZD1480 (1 uM) i 48 timer og apoptotisk celledød ble bestemt ved TUNEL. (C) AZD1480 induserer p27 oppregulering og cyclin D1 og BCL-2 downregulation i skjoldbrusk kreft cellelinjer. TPC-1, MZ-CRC1 og TT cellelinjer ble behandlet med AZD1480 (1 uM) i 24 timer. Cellelysater ble analysert med de angitte primære antistoffer, ved western-blotting. * P 0,05; *** P. 0,0001
AZD1480 induserer regresjon av TPC-1 xenoimplantater
Effektene av JAK inhibitor på
in vivo
vekst av TPC- 1 celler ble evaluert ved subkutan injeksjon i flankene av nakne mus. Når tumorer nådde ~0.5 cm
3, ble musene behandlet med bærer, AZD1480 eller AZD6244 i 16 påfølgende dager (Fig. 3A). Tumorene fra kontrollmus og mus som ble behandlet AZD6244- fortsatte å vokse til dag 9, og på grunn av deres store størrelse, ble musene avlivet. I motsetning til dette, AZD1480- behandlede mus viste tegn på tumorregresjon etter 4 dager og etter 16 dager, målt i de ~23% av sin opprinnelige størrelse (Fig. 3A). Immunhistokjemisk farging av representative tumorsnitt viste signifikant fosfo-STAT3 nedregulering av AZD1480 i tumorceller og stromale celler (endotelceller). MEK-inhibitor, redusert AZD6244 fosfo-ERK1 /2 nivåer i tumorer (Fig. 3B). Histologisk meste av tumormasse (90%) fra AZD1480- behandlede tumorer var sammensatt av nekrotisk vev, mens de fleste tumorer celler av kontroll og AZD6244 gruppene var levedyktige og aktivt prolifererende, sett fra Ki67-farging (fig. 3C) . Ytterligere karakterisering av disse tumorer viste en reduksjon i endotelceller (Meca-32) etter AZD1480 behandling, sammenlignet med kontroll og AZD6244 gruppene (p = 0,06 og p 0,0001 henholdsvis Fig. 3C). Ingen signifikante forskjeller ble detektert i mange apoptotiske celler (TUNEL), hvis prosentandel var lav i hele tumorer.
(A) TPC-1 celler (10
6) ble injisert subkutant i flankene av nakne mus. Etter svulst engraftment (~0.5 cm
3), mus ble fordelt i fire grupper (n = 5 /gruppe) med liknende gjennomsnittlig tumorvolum. Grupper ble behandlet med medikament kjøretøy (ubehandlet), AZD6244, ved 25 mg /kg, en gang om dagen, eller AZD1480, ved 30 mg /kg, bi-daglig. Tumorvolumer ble bestemt bi-ukentlig (gjennomsnitt ± SE). (B) AZD1480- og AZD6244- behandlet TPC-1 tumor snitt ble immunofarget for fosfo-STAT3 og fosfo-ERK1 /to uttrykk, respektivt. Fosfor-Stat3-positive stromale celler er skissert med en stiplet linje (forstørrelse: 400x). (C) JAK inhibitor reduseres spredning og vaskulogenese av TPC-1 xenografter. H E farging av TPC-1 tumorer behandlet med narkotika kjøretøy (kontroll), AZD6244 eller AZD1480. Representative tumorsnitt ble farget for spredning (Ki67), angiogenese (Meca-32) og apoptose (TUNEL) markører. Original forstørrelse: 200x. Kvantifisering er representert grafisk. ** P 0,001; *** P. 0,0001
AZD1480- mediert veksthemming er uavhengig av Stat3
Jåks er de viktigste formidlere av IL-6 /gp130 /STAT3 signalering, og i flere kreft modeller, er JAK hemmere «anti-tumorigen effekter mediert av STAT3. For å bestemme hvorvidt STAT3 var nødvendig for JAK-inhibitor-mediert vekstarrest, vi stabilt redusert STAT3 i TPC-1-celler ved hjelp av en kort hårnål, som bestemt ved western-blot og immunhistokjemi (fig. 4A, C2). Cellene ble behandlet med AZD1480 i fire sammenhengende dager og
in vitro
cellevekst ble overvåket, avslører betydelig veksthemming av TPC-1 shSTAT3 celler (p 0,0001, Fig. 4B).
In vivo
vekst ble undersøkt ved å injisere shSTAT3 celler subkutant og, når det når ~0.5 cm
3, tumor-bærende mus ble behandlet med bærer eller AZD1480, i 21 dager. Kontrollgruppen ble avlivet etter 8 dager på grunn av den store størrelsen av svulstene. AZD1480 behandling indusert regresjon (tumorvolum var ~24% av den opprinnelige størrelse; p 0,0001) av TPC-1 shSTAT3 tumorer (fig 4C1.). Fosfo-STAT3 ble bekreftet å være redusert i tumorcellene til kjøretøy-behandlede mus, men ikke i stromale celler, mens tumor- og Stromale fosfo-STAT3 ble betydelig redusert i AZD1480- behandlede mus (fig. 4c2).
(A) STAT3 ble knockdown i TPC-1 celler ved en kort hårnål. Fosfor-STAT3 og STAT3 downregulation ble bekreftet av western-blotting. (B) TPC-1 shSTAT3 cellene behandlet med DMSO eller AZD1480 (1 uM) og veksthemning ble bestemt ved SRB-analysen. Resultatene er gjennomsnitt ± SE av tre uavhengige forsøk. (C) TPC-1 shSTAT3 celler ble injisert subkutant i begge flanker av nakne mus. Når tumorer nådde ~0.5 cm
3, mus ble likt fordelt i to grupper: en var kontrollgruppen (bærer) og den andre ble behandlet med AZD1480 ved 30 mg /kg, bi-daglig. (C1) Tumorvolumet ble målt ved de angitte tidspunkter. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SE. (K2) Representant H E og fosfor-STAT3 farging av svulster seksjoner fra ubehandlet (kjøretøy) eller AZD1480- behandlet TPC-1 shSTAT3 svulster. Pilene viser phospho-STAT3- positive murine stromale celler. Forstørrelse: 200x. *** P. 0,0001
AZD1480 hemmer RET Y1062 fosforylering og nedstrøms PI3K /AKT /mTOR signaliserer
onkogene RET effektor veier inkluderer ERK /MEK, PI3K /AKT og STAT3 [ ,,,0],3]. Gitt den betydelige veksten undertrykkende handlinger av JAK inhibitor på onkogene
RET Anmeldelser – forvandlet TPC-en xenograft uavhengig av STAT3, hypotese vi at AZD1480 kan ha en direkte effekt på RET-mediert signalering. Vi behandlet TPC-1, MZ-CRC1, TT (fig. 5A) så vel som en modell for induserbar RET /PTC3 ekspresjon i PCCL3 (fig. 5B), med AZD1480 og /eller AZD6244, i 24 timer. De uttrykk og fosforylering nivåene av RET, så vel som av de viktigste effektorer av JAK /STAT3, ERK /MAPK og PI3K /AKT vei, nemlig fosfo-STAT3 Tyr705, fosfo-ERK1 /2-Thr202 /Tyr204 og fosfo-AKT Ser473 /fosfo -S6 Ser235 /236, henholdsvis, ble undersøkt av western-blot analyse. AZD1480 og AZD6244 effektivt reduserte nivåene av deres nedstrøms mål fosfo-STAT3 og fosfo-ERK1 /2, henholdsvis, i alle cellelinjer (Fig. 5A, B). MZ-CRC1 uttrykte ikke fosfo-ERK1 /2 på basalnivåer (Fig. 5A). I tillegg AZD1480 reduserte nivåene av fosfo-ERK1 /2 i PCCl3-RET /PTC3 og TT, samt av fosfo-AKT, fosfo-S6 og fosfo-RET i alle cellelinjer (Fig. 5A, B). I motsetning til dette, AZD6244 behandlingen økte fosfo-STAT3 i TPC-1-celler, øket fosfo-AKT og fosfo-S6 i MZ-CRC1 celler og øket fosfo-RET i PCCl3-RET /PTC3 celler (Fig. 5A, B). Det er ingen bevis hittil viser en funksjonell sammenheng mellom RET og Jaks. For å avgjøre om redusert fosfor-RET skyldtes off-target effekter av AZD1480, knockdown vi JAK1 /2 uttrykk i TPC-en, MZ-CRC1 og TT celler ved short inter (SI) RNA. På 48 timer ble JAK1, JAK2 og fosfor-Stat3 nivåer nedregulert i alle cellelinjer, uten effekter på fosfor-RET, fosfor-ERK1 /2 og fosfor-S6 (fig. 6A). I motsetning til AZD1480, gjorde JAK1 /2 knockdown ikke redusere spredning av en hvilken som helst av cellelinjene, som sees av BrdU-inkorporering (fig. 6B). Vi utførte en in vitro kinase analyse og bekreftet at AZD1480 direkte inhiberte RET-kinaseaktivitet.: 40% inhibering ved 0,001 uM, 90% hemning ved 0,1 uM og 99% ved 1 pM (Fig. S3)
(A ) TPC-1, MZ-CRC1, TT og et (B) PCCl3-RET /PTC3 doksycyklin-induserbar cellelinje ble behandlet i 24 timer med AZD1480 (1 uM), AZD6244 (1 uM), eller en kombinasjon av begge medikamenter. Totale celleproteinekstrakter ble probet med antistoffer for de angitte effektorer av JAK /STAT3, ERK /MAPK og PI3K /AKT signalveier, samt for fosfo-RET Y1062. I den nedre panel av TPC-1, er DMSO (D) lane ikke-sammenhengende til AZD6444 (6244) bane, i den samme gelen. (C) TPC-1 xenoimplantater «representative seksjonene ble probet for aktivering av STAT3 (fosfo-STAT3), ERK /MAPK (fosfo-ERK1 /2) og PI3K /AKT (fosfo-S6) signalveier. Kvantifisering er representert grafisk (gjennomsnitt ± SE). * P 0,05; ** P. 0,001
(A) Uttrykket av JAK1 eller /og JAK2 ble nedregulert av siRNA i TPC-en, MZ-CRC1 og TT cellelinjer. Nivåene av de angitte proteiner og deres fosforylering status ble bestemt etter 48 timer, med western-blot analyse. (B) Celleproliferasjon ble målt ved BrdU-inkorporering, 48 timer etter transfeksjon med en kombinasjon av sirnas som målretter både JAK1 og JAK2. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SE av tre uavhengige forsøk. * P. 0,05
Vi undersøkte fosforylering nivåer av STAT3, ERK og S6 i TPC-1 xenografter behandlet med kjøretøy, AZD1480 og AZD6244. I likhet med det som ble observert i TPC-1 og de andre RET-aktivert cellelinjer
in vitro
, JAK inhibitor førte til en signifikant reduksjon av fosfo-S6 og fosfo-STAT3 nivåer (p 0,001) i tumoren, mens ingen nedgang ble observert i bilen eller AZD6244- behandlet svulster (fig. 5C). Fosfor-ERK nivået uendret mellom kontroll og AZD1480 grupper, og ble betydelig redusert (p = 0,01) i AZD6244- behandlede gruppen (Fig. 5C).
Diskusjoner
RET
genet endringer er onkogene «drivere» i skjoldbruskkjertelkreft patogenesen, særlig i MTC og PTC. Onkogen RET er en potent aktivator av ERK /MAPK og PI3K trasé og kan indusere ekspresjon av inflammatoriske mediatorer slik som CCL2, CXCL-1, GM-CSF, IL-1β og IL-6 [5], [25] – [ ,,,0],27]. Videre kan RET /PTC og mutant RET induserer fosforylering av STAT3 enten direkte [14], [28], eller i en JAK-avhengig måte [29]. Jaks er tyrosinkinaser som medierer IL-6-avhengige STAT3 aktivering, noe som har vist seg å fremme progresjon av kreft i en rekke eksempler på faste tumorer. Viktigere, JAK2 aktiverende mutasjoner er viktige i patogenesen av myeloproliferative sykdommer, og som har ført til utviklingen av Jaks lavmolekylære inhibitorer [22], [23]. Heri undersøkte vi de biologiske effektene av en JAK1 /2-hemmer, AZD1480, på veksten av PTC-termstorer og MTC- avledet skjoldbrusk kreft cellelinjer husing aktivere
RET Twitter /PTC rearrangements og
RET
mutasjoner, respektivt. Vi observerte at AZD1480 hemmet veksten av TPC-en, MZ-CRC1 og TT med IC
50s 500 nM, som er 2 til 10 ganger under det som er rapportert for andre kreftcellelinjer [23], [30]. Blokken i veksten skyldes en G1 cellesyklusarrest i TPC-1-celler, mens i MZ-CRC1 og TT, JAK inhibering betydelig økt apoptose. På den annen side, et MEK1 /2-inhibitor, AZD6244, klarte ikke å endre
in vitro
vekst av MZ-CRC1 og TT. Ingen additive eller synergistiske effekter på
in vitro
vekst ble observert ved å kombinere begge hemmere. Tvert imot, AZD6244 (men ikke AZD1480) hemmet effektivt veksten av en
BRAF
V600E- mutant cellelinje, K1. Både AZD1480 og AZD6244 hatt minimal effekt på veksten av en
RAS Anmeldelser – mutant cellelinje, C643. Den ufølsomhet av RET-aktiverte thyroid kreft celler til MEK-hemning har tidligere blitt demonstrert, i motsetning til den høye følsomheten til thyroid kreft celler som uttrykker
BRAFV600E product: [31]. Denne motstanden kan reflektere evne onkogene RET å aktivere alternative signalveier, spesielt PI3K /AKT /mTOR vei [32]. Videre AZD6244 forårsaket oppregulering av fosfor-RET Y1062 i PCCl3-RET /PTC3 modell samt av mTOR effektorer, fosfor-S6 og fosfor-AKT, i MZ-CRC1. Overaktivering av en mTOR-reaksjonsveien i respons til MEK-hemning kan muligens forklares ved hjelp av feed-back-inhibering, og har tidligere blitt rapportert i andre modeller [33], hvor den formidler celle motstand mot AZD6244 [34], [35].
Videre AZD1480 potent hemmet
in vivo
vekst av TPC-1 xenografter, noe som resulterer i tumor regresjon, mens svulster fra AZD6244- behandlet mus vokste litt mer enn kontroll svulster, noe som tyder på at behandling
RET
-mutated skjoldbrusk kreft med dette hemmer kan fremme tumorvekst. I TPC-1 svulster, og i likhet med de effektene
in vitro
, AZD1480 blokkert spredning samtidig ikke vesentlig påvirker apoptose. Imidlertid
in vivo
, observerte vi markert tumorregresjon, med tumorer som viser store områder av nekrotisk vev og en signifikant reduksjon i antall blodkar. Den sistnevnte kan ha forårsaket et fall i næringsstoff, og oksygentilførselen til tumorene, sannsynligvis forklarer fremhevet nekrose, og følgelig tumor reduksjon. Slike effekter på tumorvekst, har tidligere blitt dokumentert i andre kreft modeller (lunge, bryst, prostata, hjerne) [23], [36], [37]. I disse modellene JAK inhibering var spesielt effektiv i fosfo-STAT3-positive tumorer /cellelinjer. Imidlertid AZD1480 har også vist seg å hemme vekst av cancercellelinjer uavhengig av STAT3 aktivering, særlig ved høyere doser [23], muligens på grunn av off-target virkningene av medikamentet. I en fersk rapport, AZD1480 blokkert både JAK /STAT3 og FGFR3 signalering i myelom celler [30]. For å teste om de veksthemmende effekten av AZD1480 var avhengig av STAT3 i modellene våre, vi banket ned STAT3 i TPC-1 celler. STAT3 mangel i disse celler ikke påvirker deres følsomhet for JAK hemming sammenlignet med kontrollceller. Videre AZD1480 var like effektivt i å blokkere veksten av STAT3- mangel TPC-1-xenografter, som viste omfattende nekrose, på samme måte som AZD1480-behandlede paren TPC-1 tumorer. I tillegg har vi slått ned JAK1 og JAK2 ekspresjon i TPC-1, MZ-CRC1 og TT-cellelinjer ved siRNA, som ikke hadde noen effekt på deres proliferasjon. Disse dataene viser at AZD1480 hemmer veksten av RET-aktivert skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer
in vitro Hotell og
in vivo
, uavhengig av JAK /STAT3 signalering i kreftceller.
Vi søkte å identifisere hvilke mekanismer som forklarer veksthemmende effekten av AZD1480
in vitro Hotell og
in vivo
. I alle cellelinjer, AZD1480 effektivt redusert fosfo-STAT3 nivåene, herunder C634W mutant TT-cellelinje, selv om dette onkogen form av RET ble beskrevet som aktiverende STAT3 uavhengig av Jaks, gjennom to tilkoblings områder på RET (Tyr752 og Tyr928) [28] . Vi foreslår at våre resultater avvike på grunn av bruken av en annen JAK-inhibitor, med forskjellig potens enn den som brukes av Schuringa
et
al
.
Hittil har ingen data har vist en rolle for Jåks i RET aktivering (Y1062 fosforylering) og heller ikke om aktivering av nedstrøms MAPK og PI3K veier. Vi fastslått at AZD1480 blokkert RET Y1062 fosforylering i TPC-en, MZ-CRC1, TT, samt i en betinget modell av
RET /PTC3
uttrykk. Dessuten, selv om AZD1480 ikke hemme ERK /MAPK-veien i de fleste av våre cellelinjer, det blokkerte aktiveringen av PI3K effektorer AKT og S6. Lignende resultater ble oppnådd i den AZD1480- behandlede TPC-1 xenotransplantater, hvor ingen forskjeller i ERK /MAPK-nivåer ble påvist, og fosfo-S6 var signifikant nedregulert. Vi viste at disse effektene var uavhengig av Jaks, som fosfor-RET, fosfor-ERK og fosfor-S6 tyder ikke endre på JAK1 /2 knockdown av siRNA. Vi demonstrerte at AZD1480 hemmer kinaseaktiviteten av rekombinant RET på en doseavhengig måte, noe som sannsynligvis understreker de inhiberende og mutant-RET spesifikke virkninger av AZD1480 på veksten og overlevelsen av thyroid kreft celler direkte. Faktisk
in vitro
kinase essay fra en tidligere rapport har vist at AZD1480 kan hemme -50% og 90% av RET aktivitet 0.1 og 1 mikrometer konsentrasjoner, henholdsvis [23].
I Avslutningsvis viste vi at JAK1 /2-hemmer, AZD1480 kan blokkere veksten og indusere celledød av skjoldbruskkjertelen kreftcellelinjer huse forskjellige former for onkogene
RET in vitro Hotell og
in vivo
. I disse cellene, AZD1480 hemmer sannsynligvis RET direkte, som fører til den derav følgende blokkering av PI3K /AKT /mTOR veien, noe som synes å være den foretrukne onkogene drivkraft RET-aktiverte celler. Selv om disse effektene var uavhengig av STAT3 i thyroid kreft celler, AZD1480 effektivt hemmet fosfo-STAT3 i stroma, særlig i endotelceller. Faktisk er JAK-hemmere kjent modulatorer av mikromiljøet gjennom hemming av angiogenese og myeloid celle mobilisering i en STAT3- avhengig måte [36], [38]. Gitt den betydelige reduksjon i vaskularitet AZD1480- behandlede tumorer og derav følgende tumor nekrose, foreslår vi at fosfo-STAT3 inhibering i mikromiljøet (endotelceller) samvirker med RET inhibering i cancerceller for å indusere tumor regresjon. I tillegg kan vi ikke forkaste at andre RET-uavhengig tyrosin kinaser (som FLT1, FGFR [23]) kan bli berørt av AZD1480, bidra til vekst arrestasjonen av RET- aktiverte cellene og svulster.
Viktigere, MZ -CRC1, som havner på M918
RET
mutasjon assosiert med MEN2B syndrom, var svært følsomme for veksthemmende effekten av AZD1480. Pasienter diagnostisert med MEN2B utvikle seg raskt progressiv, multifokal MTC med lymfeknutemetastaser, som vanligvis krever total tyreoidektomi før 1 års alder [39]. Jo større følsomhet for MZ-CRC1 å AZD1480 sammenlignet med TT (skjuler de mindre aggressive C634W mutasjon), kan forklares med ulike kapasiteter på MEN2A- og MEN2B- RET mutanter å aktivere nedstrøms trasé, nemlig PI3K /AKT vei [40]. Til sammen disse resultatene støtter bruk av AZD1480 å behandle aggressive former for skjoldbruskkjertelkreft, spesielt MEN2B- MTC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle prosedyrene for dyr forskning ble inkludert i en protokoll (nummer 0011091) godkjent av MSKCC Institutional Animal Care og bruk Committee (IUAC), etter forsøksdyr barnevernloven guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og retningslinjer og retningslinjer for gnagere eksperiment.
Cell kultur og narkotika
TPC-en, K1, C643 (gitt av professor Marc Mareel, Belgia) og TT (kjøpt fra American Type Culture Collection – ATCC) [29], [ ,,,0],41] cellelinjer ble holdt i RPMI, 10% FBS, 1% PenStrep. PCCl3-RET /PTC3 ble gitt av Dr. James Fagin og ble dyrket som beskrevet tidligere [13]. MZ-CRC1 (gitt av Dr Robert Hofstra, Nederland) [29] og 293T (ATCC) ble opprettholdt i DMEM, 10% FBS, 1% PenStrep. Alle celle kultur reagenser var fra GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, USA. AZD1480 [23] og AZD6244 [24] var gaver fra Dennis Huszar og Michael Zinda (Astrazeneca, London, UK).
Lentiviral infeksjoner og generering av stabile cellelinjer
STAT3 shRNA lentiviral konstruere er tidligere beskrevet [42]. Virale partikler som bærer konstruksjonene ble samlet i 293T-celler. De virale partikler i supernatanten ble utfelt ved hjelp av en polyetylenglykol-virus presipiteringsoppløsning (System Biosciences LLC, Mountain View, CA, USA). Lentiviral konstruksjoner inngår en transkripsjon kassett koding forbedret grønt fluorescerende protein [42], som tillot utvalg av celler ved å sortere.
Whole celle proteinekstrakter og vestlige blotting
Celler ble lysert i radio-immunoprecipitation assay buffer, supplert med protease og fosfatase-hemmere (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Proteiner ble kvantifisert ved hjelp av en modifisert Bradford assay (Biorad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), løses ved SDS-PAGE og overført til Hybond ECL membraner (GE Healthcare, Little Chalfont, England). De primære antistoffer for fosfo-STAT3 (Tyr705), STAT3, fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ERK1 /2, fosfo-AKT (Ser473), AKT, fosfo-S6 (Ser235 /236), og S6 var fra celle~~POS=TRUNC Technologies, Inc, Danvers, MA, USA. Cyclin D1 antistoff var fra Neomarkers, Fremont, CA, USA. Actin antistoff, fosfor-RET (Y1062), total RET (C-19) og p27 var fra Santa Cruz BT, Santa Cruz, USA, BCL-2 antistoff var fra DAKO, Glostrup, Danmark, og α-tubulin var fra Sigma Aldrich , St. Louis, MO, USA. Peroksidase konjugerte sekundære antistoffer var fra Santa Cruz BT.
