Abstract
En fersk genome-wide forening studie av lungekreft blant ikke-røykende kvinner i Asia viste at rs2736100 polymorfisme i
TERT-CLPTM1L
locus på kromosom 5p15.33 var sterkt og signifikant assosiert med risiko for adenokarsinom av lungen. Den telomerase genet
TERT
er en revers transkriptase som er kritisk for telomerer replikering og stabilisering ved å kontrollere telomerlengde. Vi har tidligere funnet at lengre telomerlengde målt i perifere hvite blodlegemer DNA var assosiert med økt risiko for lungekreft i en prospektiv studie av røyking menn i Finland. For å følge opp dette funnet, gjennomførte vi en nøstet pasient-kontroll-studie av 215 kvinnelige lungekreft tilfeller og 215 kvinnelige kontroller, 94% av dem ble aldri-røykere, i den potensielle Shanghai kvinner Health Study kohorten. Det var en dose-respons-sammenheng mellom tertiles av telomer-lengden og risiko for lungekreft (odds ratio (OR), 95% konfidensintervall [CI]: 1,0, 1,4 [0,8 til 2,5] og 2,2 [1,2 til 4,0], henholdsvis ; P trend = 0,003). Videre foreningen var uendret etter hvor lang tid fra blodprøvetaking til sak diagnose. I tillegg rs2736100 G allele, som vi tidligere har vist seg å være forbundet med risiko for lungekreft i denne kohort, var signifikant assosiert med lengre telomerlengde i de samme forsøkspersonene (p trend = 0,030). Våre funn tyder på at personer med lengre telomerer lengde i perifere hvite blodceller kan ha en økt risiko for lungekreft, men krever replikasjon i flere potensielle kohorter og bestander
Citation:. Lan Q, Cawthon R, Gao Y, Hu W, Hosgood HD III, Barone-Adesi F et al. (2013) Lengre telomerlengde i perifere hvite blodcellene er forbundet med risiko for lungekreft og rs2736100 (
CLPTM1L-TERT
) polymorfisme i en prospektiv kohortstudie blant kvinner i Kina. PLoS ONE 8 (3): e59230. doi: 10,1371 /journal.pone.0059230
Redaktør: Olga Y. Gorlova, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 19 september 2012; Godkjent: 12 februar 2013; Publisert: 26 mars 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av egenutført midler fra National Cancer Institute (Bethesda, MD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Telomerase genet
TERT
er en revers transkriptase som er kritisk for telomerer replikering og stabilisering ved å kontrollere telomerlengde. Telomerer er DNA-proteinkomplekser som cap endene av kromosomene og fremme kromosom stabilitet. Hittil assosiasjoner mellom telomerlengde og kreftrisiko er mangelfulle. De fleste innledende studier brukt en case-kontroll design og rapporterte at kortere telomerer lengde målt i perifere hvite blodceller var assosiert med økt risiko for kreft [1]. I motsetning til dette har noen nylige publikasjoner bruke en prospektiv utforming antydet at lengre telomerlengde kan være assosiert med øket risiko for visse tumorer, inkludert lunge-, lymfom, leverkreft, melanom og [2] – [5]. Nylig har to case-control studier har rapportert at lengre telomerlengde var assosiert med kolorektal, brystkreft, og brystkreft overlevelse [6] – [9]. Kortere telomerlengde har vært forbundet med aldring og både kortere og lengre telomerlengde har vært forbundet med fare for en rekke kroniske sykdommer [10], [11], selv om denne heterogeniteten kan forklares delvis av pasient-kontroll vs. prospektiv studiedesign. I tillegg er telomerlengde sterkt mediert av genetiske faktorer med en beregnet arve varierende fra 44% til 80% [12], [13]. Flere studier har identifisert en rekke polymorfismer som var assosiert med telomerlengde [8], [14] -. [17], men en helhetlig forståelse av det genetiske bidraget til telomerlengde har fortsatt ikke dukket opp
Vi har nylig gjennomført et genom-wide forening studie (GWAS) av lungekreft blant ikke-røykere kvinner i Asia og viste at rs2736100 polymorfisme i
TERT-CLPTM1L
locus på kromosom 5p15.33 var sterkt og signifikant assosiert med risiko av adenokarsinom av lungen (P trend = 10
-20) og blir kopiert av andre GWAS studier [18] – [20]. Videre er det ytterligere bevis som tyder på at dette locus er knyttet til andre kreftformer, inkludert kreft i blære, prostata, cervixuteri, bukspyttkjertel, bryst, ovarier, testiklene, hjernen og hud [21] – [26]. Disse funnene tyder på at
TERT-CLPTM1L
5p15.33 region kunne spille en rolle i utviklingen av et bredt spekter av kreftformer med ulike årsaker.
Vi har tidligere rapportert at lengre telomerlengde var assosiert med risiko for lungekreft i Alpha-Tocopherol, betakaroten Cancer Prevention (ATBC) prospektiv kohort [4], som består av røyking menn i Finland. For å følge opp denne rapporten i en utpreget annerledes befolkning og for ytterligere å utforske vår genetiske funn, gjennomførte vi en nøstet pasient-kontroll studie av lungekreft tilfellene og kontroller i den potensielle Shanghai kvinner Health Study kohorten (SWHs).
Materialer og metoder
forsøkspersonene
de detaljerte metoder for SWHs har blitt beskrevet tidligere [27]. Kort fortalt ble 74,942 kinesiske kvinner i alderen 40 og 70 år og bosatt i sju bysamfunn av Shanghai rekruttert til kohortstudie 1997-2000 med en oppslutning på 92,7%. Av deltagerne, 56 831 (75,8%) gitt en blodprøve, som ble samlet inn ved registrering i kohorten. Studien ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene i alle samarbeidende institusjoner. Hver studiefaget gitt en samtykkeerklæring ved innmelding og gjennomført en standardisert spørreskjema, inkludert informasjon om demografiske kjennetegn, medisinsk historie, familiehistorie med kreft, bruk av tobakk, bolig historie, inkludert bruk av matolje og drivstoff, og eksponering for tobakksrøyk i miljøet fra sin ektemann eller fra kolleger på arbeidsplassen. Oppfølging for kreftforekomst og dødelighet ble gjennomført hjemmebesøk samt kobling til populasjonsbasert Shanghai Kreftregisteret. For kvinner som ble diagnostisert med kreft, var medisinske diagrammer gjennomgått og karakteristikker av svulsten ble registrert. For de oppfølgingsundersøkelser, oppfølgings priser for tre forskjellige intervjuer var 99,8% (2000-2002), 98,7% (2002-2004), og 96,7% (2004-2007) av kohort medlemmer eller deres pårørende.
Vi brukte en nestet case-control design for dette prosjektet. Sakene består av hendelsen lunge krefttilfeller. Kontrollene ble valgt ut fra de SWHs deltagerne som var i live og fri for kreft på den tiden av saken diagnose, og ble individuelt tilpasset saker på fødselsdato (± 2 år) og dato for blodprøvetakning (± 3 mnd). I alt ble 215 lungekreft tilfeller og 215 matchede kontroller inkludert i studien.
telomere analysen
DNA ble ekstrahert fra buffy strøk ved hjelp av fenol-kloroform metoden. En monokrom multipleks kvantitativ PCR-analyse ble anvendt for å bestemme telomere målingene [28]. Alle analyser ble utført ved laboratoriet til Dr. Richard Cawthon hjelp av Bio-Rad CFX384 Real-Time PCR Detection System. Maskerte gjentatte prøver ble ispedd innenfor og på tvers analyse grupper for å vurdere analysen reproduserbarhet. Saker og deres matchede kontroller ble analysert fortløpende innenfor grupper. Den samlede variasjonskoeffisienten (CV) av gjentatte prøver var 11% og intra korrelasjonskoeffisienten (ICC) var 87%. I korte trekk, reagensene i 10 ul PCR var 10 mmol /liter Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol /L KCI, 3 mmol /l MgCl2, 0,2 mmol /l hver dNTP, 1 mmol /l DTT, 1 mol /L betain, 0,75 x SYBR grønn i, og AmpliTaq Gold-DNA-polymerase, 0,625 U. De fire primere var (5 «til 3»): telg (ved 100 nmol /L), ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT; Telc (900 nmol /L), TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA; albugcr2 (700 nmol /L), CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGCCATGCTTTTCAGCTCTGCAAGTC; og albdgcr2 (ved 500 nmol /L), GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGAGCATTAAGCTCTTTGGCAACGTAGGTTTC.
Fra 5 til 10 ng humant genomisk DNA ble tilsatt per reaksjon brønnen. Tre ganger seriefortynninger av en referanse genomisk DNA-prøve ble brukt for å generere to standard-kurver for hver PCR-plate (fem konsentrasjoner med en topp på 40 ng /reaksjon og en lav på 0,49 ng /reaksjon). Termiske sykluser besto av en syklus på 15 minutter ved 95 ° C; 2 sykluser med 2 s ved 98 ° C, 30 s ved 49 ° C; 36 sykluser med 2 s ved 98 ° C, 30 s ved 59 ° C, 15 s ved 74 ° C med signal oppkjøpet, 30 s ved 84 ° C, og 15 s ved 85 ° C med signal oppkjøpet. Den 74 ° C leser gitt sykkel terskler (CTS) for telomerer; 85 ° C leser gitt CTS for løssalgs genet (albumin). Etter kjøringen var fullført, ble Bio-Rad CFX Manager Software anvendt for å bestemme T (telomere) og S (enkeltkopi-gen) verdier for hver eksperimentell prøve av standardkurve metoden.
Alle prøvene ble analysert i tre eksemplarer. Forholdet mellom de telomer-PCR signalene til enkeltkopi-gen (i vårt tilfelle, β-globin) PCR-signal (det vil si T /S-forholdet) er proporsjonal med den gjennomsnittlige telomerlengde av alle celler i en prøve. T /S verdiene er relative gjennomsnitts telomere lengder, uttrykt i forhold til T /S verdien av referansestandarden DNA-prøve, som ved definisjon er 1,00. Standard DNA-prøve benyttet for våre studier har en faktisk gjennomsnitts telomer-lengde på ca. 3300 basepar [28]. For en gitt eksperimentell prøve, er den T-verdi antall nanogram for referanse DNA som samsvarer med den eksperimentelle prøven i kopiantallet av den telomere malen, og den S-verdien er antall nanogram for referanse DNA som samsvarer med den eksperimentelle prøven for kopiantallet av den enkelt kopigen mal. T /S, derfor, er en relativ og dimensjonsløs verdi. Prøver med et T /S 1.0 har en midlere telomerlengde større enn den for standard DNA; prøver med et T /S 1,0 har en midlere telomerlengde kortere enn den for standard DNA. Multiplex kvantitativ PCR eliminerer en viktig kilde til variasjon til stede i monoplex kvantitativ PCR. I monoplex kvantitativ PCR, variasjon i mengden av DNA pipettert inn i de T og S-reaksjons brønner resulterer i variasjon i T /S, mens i multipleks kvantitativ PCR både T og S er målt i hver reaksjon brønn, slik at pipettering variasjonen mellom brønnene ikke gjør påvirke T /S.
Genotyping
Genotyping ble utført ved bruk av en optimalisert TaqMan analysen (ABI, Foster City, CA), ved National Cancer Institute Cancer Genomics forskning (CGR) som tidligere beskrevet [ ,,,0],19].
Statistical Analysis
Fordi T /S Nøkkeltall hentet fra telomer-lengden data ikke var normalfordelt, dataene var log transformert. Den Wilcoxon signed-rank test ble anvendt for å teste den forskjell av telomerlengde blant tilfeller versus kontroller. De klippepunkter for tertiles av telomer-lengden ble avledet fra distribusjons i kontrollene. Odds ratio (ORS) og 95% konfidensintervall (95% CIS) ble estimert ved hjelp av betinget logis regresjonsmodeller. Telomer-lengden ble modellert som både en kontinuerlig og kategorisk variabel. Tester for trender ble beregnet ved bruk av log transformert telomerlengde som en kontinuerlig variabel. Alder ble brukt i alle betingede modeller og står for potensiell rest forvirrende, og røykestatus var inkludert i alle modeller som inkluderer ever-røykere. Variabler som resulterte i en 10% eller større forandring i den β-koeffisient av telomerlengde variabel i grunnmodellen ble ansett confounders og inkludert i de endelige, multivariable modeller. Alle P-verdier er 2-sidig. Vi har også gjennomført en sekundær analyse ved hjelp av brøk polynomer å undersøke en mulig ikke-lineær sammenheng mellom telomerlengde og risiko for lungekreft. Den optimale graden av glatting ble valgt ved hjelp av en modell utvalg prosedyre foreslått av Royston og Sauerbrei [29]. For å avgjøre om foreningen kan bli drevet delvis av forhøyet telomer-lengden mellom tilfeller med udiagnostisert lungekreft på tidspunktet for blodprøvetakning, og for å avgjøre om foreningen vedvarte i mer enn 5 år, stratifisert vi analysene av tid fra blodprøvetaking til sak diagnose (0- = 2 2-5, og 5 år) eller referansedato at kontrollen ble valgt. Vi analyserte påvirkning av rs2736100 genotype på log-transformerte telomerlengde ved lineær regresjon, tildele ordnings verdier 1, 2 og 3 for TT, GT, og GG genotyper, henholdsvis, og justerer for alder.
Resultater
baseline karakteristikker av forsøkspersonene er vist i tabell 1. i en alder av saker og kontroller ble sammenlignbare og 93% av tilfellene og 95% av kontrollene ble aldri-røykere. Telomer-lengden ble omvendt korrelert med alder i begge tilfeller (Spearman korrelasjon r = -0,39 P 0,0001) og kontroller (Spearman korrelasjon r = -0,41 P 0,0001). Ingen signifikant korrelasjon ble funnet mellom bety telomerlengde og demografiske parametere vist i tabell 1. I tillegg fordelingen av telomer-lengden var statistisk signifikant lenger blant tilfeller enn kontrollene [p = 0,032].
risiko for lungekreft ved tertiles av telomer-lengden er vist i Tabell 2. Pasientene i den midterste og høyeste tertiles hadde høyere risiko enn gjorde de i den laveste tertile (OR 1,4, 95% KI 0,8 til 2,5 for middel tertile, 2.2, 1.2 -4,0 for den høyeste tertile, P trend = 0,003, Tabell 2, justert for alder og stadig røyke). Videre justering for passiv røyking og familiehistorie med lungekreft hadde en ubetydelig effekt på resultatet (OR 1,4, 95% KI 0,8 til 2,4 og 2,2, 1,2 til 4,0 for i midten og høyeste tertiles henholdsvis P trend = 0,004). Fjerning av stadig røyking saker og kontroller ga lignende resultater (OR 1,7, 95% KI 0,9 til 2,9 for middel tertile, 2.5, 1.3 til 4.7 for den høyeste tertile, P trend = 0,003). Modeller, inkludert brøk polynomer ikke passet dataene bedre enn de enklere lineære modellen (likelihood ratio test p = 0,44). Sistnevnte ble således holdt tilbake på bakken av parsimoni. De observerte foreninger var lik på tvers av ulike oppfølgings ganger (tabell 2) (dvs. tiden fra dato for blodprøvetaking til diagnosedato), og en test av heterogenitet for foreninger over hele lag av oppfølgingstiden var ikke signifikant (p = 0,15 ). Men på grunn av det lave antallet pasienter i noen strata og upresise risikoestimater, er replikering i studier med større utvalg størrelser for å evaluere potensialet heterogenitet. I tillegg var det ingen bevis for at sammenhengen mellom telomerlengde og risiko for lungekreft varieres ved alder av blodgivning (test for heterogenitet: P = 0,96).
Vi har tidligere rapportert at rs2736100 på kromosom 5p15.33 var sterkt assosiert med risiko for adenokarsinom i lungene hos aldri-røykere i denne kohorten. Vi studerte derfor forholdet mellom genetiske data og telomer-lengden i denne populasjonen. Den midlere telomerlengde i assosiasjon med rs2736100 (
CLPTM1L-TERT
) er vist i tabell 3. rs2736100 G allele, som vi tidligere har vist seg å være forbundet med risiko for lungekreft i denne kohort [19], ble signifikant assosiert med lengre telomerer lengde (P trend = 0,03) (Tabell 3).
Diskusjoner
i denne prospektive kohort studie av stort sett aldri-røykere kvinner i Kina, fant vi at lengre telomerlengde målt i perifere hvite blodceller var signifikant og positivt forbundet med økt risiko for lungekreft og denne forbindelsen var uforandret ved lengden av tiden fra blodprøvetaking til tilfelle diagnose. Videre er rs2736100 G allele, som vi tidligere har vist seg å være forbundet med risiko for lungekreft i denne kohort [19], ble også signifikant assosiert med lengre telomerlengde.
Vårt funn at lengre telomerlengde er tilknyttet kreftrisiko lunge er i tråd med vår forrige rapport i den potensielle ATBC Cancer Prevention kohort [4] i mannlige røykere. Begge de to studiene er prospektive av design og er de eneste kohortstudier med telomerlengde og lungekreft publisert hittil, til vår beste kunnskap. I motsetning til dette har enkelte case-control studier rapporterte forbindelser mellom kortere telomerlengde og risikoen for lungekreft [30] – [32] hvor telomerlengde ble målt i hvite blodlegemer som er samlet på tidspunktet for eller etter diagnostisering av kreft. Det er interessant at en rapport fra det samme kohort funnet en U-formet forbindelse mellom telomerlengde og tykktarmskreft, noe som tyder på at forholdet mellom telomerlengde målt i perifere blodleukocytter og risikoen for ulike typer kreft kan fremvise forskjellige typer av dose- respons-forhold.
inkonsekvens mellom funnene i case-kontroll og kohortstudier kan skyldes en rekke årsaker. For det første kan telomerlengde i perifere hvite blodceller forandres ved nærvær av ondartet sykdom. Derfor kan den observerte sammenheng mellom forkortet telomerlengde og sykdom i tilfelle kontrollstudier være et resultat av revers kausalitet skjevhet [16], [33]. Dernest, cellegift eller strålebehandling før blodprøvetaking kan føre til DNA-skader og kan påvirke telomerlengde [34], [35]. Flere av de case-control studier av kreft ikke rapportere status for behandling av tilfellene. Pooley et al. sammenlignet resultatene av telomer-lengden fra prøver av både retrospektive case-control studier og prospektive kohortstudier av brystkreft og tykktarmskreftpasienter og fant at kortere telomerlengde var assosiert med økt risiko i kasus-kontrollstudier, men ikke i de prospektive kohortstudier [16 ], [33]. Blodprøver fra pasienter i vår studie ble samlet ett til ti år før diagnose, og effektene vi rapporterer vedvarte i den lengste perioden med oppfølging (dvs. mer enn 5 til 10 år). For det tredje, nøyaktighet og presisjon i målingen av telomerlengde er kritisk ved beregning av risikoen for kreft [36] og variasjoner i disse kan bidra til inkonsekvente resultater. For eksempel, plate og plassering av prøven på en plate hadde en betydelig innflytelse på telomerlengde målinger, selv om de er sterkt korrelert mellom platene innenfor et gitt individ [36]. Den monokrom multipleks kvantitativ PCR metoden som brukes i denne rapporten, som ble utviklet av Dr. Richard Cawthon [28], gir bedre konsistens i forhold til andre metoder [8]. I vår studie, Dr. Cawthon laboratorium gjennomført analysene med en variasjonskoeffisient (CV) på 11%. Også, som forsterkes vi presisjon i målingen av telomerlengde ved å sette DNA fra kasser og deres matchede kontroller ved siden av hverandre på en gitt plate.
I prinsippet kan enten lang eller kort telomerer heve kreftrisiko, avhengig cellen historie av somatiske mutasjoner og cellenes mikromiljø. Når cellesyklus kontrollpunkt, cellulær senescence, og apoptose gene nettverk er intakte, korte telomerer i delende celler er forventet å være beskyttende mot kreft, ettersom ytterligere telomerer forkortes forårsaket av celledeling snart utløser enten cellulær senescens eller apoptose, hindrer celle fra å utvikle til en kreftcelle. Motsatt kan lange telomerer øke kreftrisiko, fordi de ekstra runder med celledeling som gis av de lange telomerer gi cellen (og dets datterceller) muligheten til å akkumulere genetiske treff (somatiske mutasjoner) som blokkerer veier til alderdom og apoptose og fremme tumorigenesis. Alternativt, blant cellene der de veier til mobilnettet senescence og apoptose er allerede blokkert, de med kortere telomerer er tilbøyelige til å ende-til-ende-kromosom fusjoner og påfølgende kromosom ustabilitet, en bidragsyter til kreftutvikling [37], [38]. En tidligere studie antydet at en balanse mellom forlengelse av telomerase og telomerer forkortes er viktig å produsere en stabilisert «optimal» lengde som er avgjørende for celleproliferasjon, senescence, og kontroll [39].
Funnet av en forening mellom
TERT
SNP rs2736100 og telomer-lengden er spennende. Rafnar et al. fant at to SNPs på
TERT
genet, rs401681C og rs2736098A alleler, ble begge signifikant assosiert med kortere telomerer lengde i aldri-røykende kvinnene mellom 85 og 95 år gamle i kaukasiere. Men disse assosiasjonene gikk i motsatt retning når begrenset til yngre aldri-røykende kvinnene selv om foreningene ikke var signifikante [23]. Mirabello et al. fant ingen sammenheng mellom rs2736100 og telomerlengde i kaukasiere [40]. Vi merker oss at rs2736100 og lungekreft foreningen var sterkere blant aldri-røykende kvinnene i Østasiater enn i kaukasiere [19], [41]. Videre risikoen var også høyere sammenlignet med en GWAS av lungekreft i japansk og koreanere, som var for det meste røykere og menn [42]. Som sådan, er det mulig at forholdet mellom rs2736100 og telomerlengde selv kan variere fra etnisitet, kjønn og /eller røykeatferd. Interessant, i en foreløpig analyse som ble begrenset av små tall, fant vi noen bevis på at effekten av lengre telomerer lengde og større risiko for lungekreft var begrenset til de individene som bærer risikoen (GT /GG) genotype av rs2736100 (data ikke vist). På samme tid, er vårt studium forholdsvis liten, og resultatene må evalueres i flere populasjoner, ved hjelp av telomerlengde målt ved hjelp av den samme fremgangsmåte som brukes her. Videre er funksjonell arbeidet for å identifisere den varianten som direkte står for den underliggende foreningen samt å studere mekanismen som denne genetiske varianten formidler telomer-lengden.
I sammendraget, vår prospektiv kohort studie fant at lengre telomerer lengde målt i perifere hvite blodlegemer DNA ble sterkt assosiert med risiko for lungekreft hos kinesiske kvinner, og er den nest kohortstudie for å rapportere en sammenheng mellom lengre telomerer lengde og høyere risiko for lungekreft. Imidlertid er disse funnene basert på relativt beskjedne størrelse prøvene og krever replikering i flere kohorter og befolkninger.
