Abstract
Høy MYC uttrykket er assosiert med nesten all kreft hos mennesker. JQ1, en kjemisk forbindelse som inhiberer MYC uttrykk er terapeutisk effektiv i prekliniske dyremodeller i midtlinje karsinom, og Burkitt lymfom (BL). Her viser vi at JQ1 ikke hemmer MYC uttrykk i en tilsvarende grad i alle tumorceller. Den BL-celler viste en ~90% reduksjon i MYC transkripsjon ved behandling med JQ1 imidlertid ingen tilsvarende reduksjon ble observert i flere ikke-BL-celler. Molekylært disse forskjellene vises på grunn av kravene til Brd4, den mest aktive versjonen av Positive transkripsjon Forlengelse Factor B (P-TEFb) innenfor Super Forlengelse Complex (SEC) og transkripsjonsfaktorer som Gdown1, og MED26 og også andre ukjente celle spesifikke faktorer. Vårt studium viser at reguleringen av høye nivåer av MYC ekspresjon i forskjellige kreftceller blir drevet av unike regulatoriske mekanismer, og at slike eksklusive regulatoriske signaturene i hvert kreftceller kan bli anvendt for målrettet legemiddel
relasjon:. Fowler T, Ghatak P, Prisen DH, Conaway R, Conaway J, Chiang CM, et al. (2014) Regulering av
MYC
Expression og differensial JQ1 følsomhet i kreftceller. PLoS ONE 9 (1): e87003. doi: 10,1371 /journal.pone.0087003
Redaktør: Arun Rishi, Wayne State University, USA
mottatt: 23 september 2013; Godkjent: 16 desember 2013; Publisert: 23 januar 2014
Copyright: © 2014 Fowler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av midler til CM. C (NIH CA103867, CPRIT RP110471, og Welch Foundation I-1805), og A.L.R (American Heart Association, 12GRNT12180023). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. J.E.B. har en minoritetsaksjeandel i Tensha Therapeutics. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Innledning
lymfomer er grovt klassifiseres i to kategorier:. Hodgkins og non-Hodgkin lymfom (NHL) [1]. De to vanligste formene for aggressive NHL er diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) og Burkitt lymfom (BL) [1], [2], [3]. Translokasjon av proto-onkogen
MYC
til en av immunglobulin genloci [
IG-MYC
trans; det meste av t (8; 14) Q24, Q32 type] resulterer i avvikende
MYC
uttrykk regnes som dominant genetisk hendelse i tilblivelsen av BL og ca 10% av DLBCL [4]. Foruten trans,
MYC
kan gjennomgå onkogene deregulering via høyt nivå genamplifisering samt mutasjoner i cis-regulatoriske elementer i flere krefttyper (for eksempel myelom, tykktarmskreft og neuroblastom) [5], [6] . Videre, mens de fleste BLS har deregulert c-
MYC plakater (heretter kalt
MYC
) uttrykk som en konsekvens av en
IG-MYC
trans, flertallet av ikke -BLs ikke bære
IG-myc
trans, men andre genetiske avvik som fører til deregulert
mYC
uttrykk. Selv om høyt uttrykk er begrenset til BLS, varierer MYC målet uttrykk på et lavere nivå over ikke-BL og mellom lymfomer og utgjør en negativ prognostisk markør i disse lymfomer.
MYC dimerizes med MAX for å binde sine mål sekvens (E -boks) og regulerer genekspresjon. MYC aktiverer ikke bare transkripsjon men undertrykker også målet genuttrykk enten via direkte biding (med Miz-en transkripsjonsfaktor) eller via regulering av mikro-RNA (Mirs) [7]. Imidlertid er funksjonen av MYC komplisert som to nylige studier viser at MYC ikke har et bestemt transkripsjonen signatur, men tjener til å forsterke utgangen fra eksisterende transkripsjonelle programmer i en gitt celle i stedet for å utføre sine egne transkripsjons- program [8], [9] .
tilhører MYC
en gruppe gener kalles primær responsgener (PRGs) hvorav mange havn pauset Pol II ved proksimale arrangøren området som ved aktivering kan raskt bytte til en forlengelse Pol II og funksjonelle transkripsjon [10]. Signalavhengig stimulering resulterer i forbedret acetylering ved histon-3-lysin 14 (H3K14Ac) og en av to H4 lysin par H4K5 /12 eller H4K8 /16, en hendelse som vises avgjørende for binding av bromodomain (BRD) proteiner som rekrutterer transkripsjonsfaktorer som er nødvendige for transkripsjon [11], [12]. Rekruttering av positive transkripsjon forlengelse faktor b (P-TEFb), og muligens den generelle initiering kofaktor Mellommann, spiller en viktig rolle i Brd4-regulert transkripsjon av mange gener inkludert
MYC
. Faktisk, etter rekruttering av Brd4, phosphorylates P-TEFb forlengelsen faktorer DSIF (Spt4 og Spt5), negativ forlengelse faktor (NELF), og Pol II resulterer i utslipp av pauset Pol II og påfølgende forlengelse av transkripsjon [10], [13] og nylig anmeldt i [14]. Kollektivt, disse og andre resultater tyder på at forlengelsen av transkripsjon er en kritisk regulatorisk punkt i dirigere
MYC
regulering [10].
I mange myc-drevne prosesser er nødvendig for homeostase og vekst, terapeutisk strategier rettet mot modulering av
MYC
uttrykk snarere enn regelrett undertrykking virke attraktivt. Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation først beskrevet thienodiazepine analoger som er potente hemmere av kromatin binding av bromodomains knyttet til BET familie [15]. Deretter ble en nær beslektet lite molekyl-inhibitor, JQ1, har vist seg å være terapeutisk effektiv i pre-kliniske dyremodeller [16], [17], [18]. Disse og beslektede små molekyler konkurranse okkupere acetyl-bindende lommer av BET bromodomains, noe som resulterer i utslipp av BET proteiner (spesielt Brd4) fra kromatin [19]. Til tross for disse lovende demonstrasjoner, betyr JQ1 ikke hemme
MYC
uttrykk til en lignende grad i alle kreftceller [19]. Derfor er det viktig å forstå hvorfor JQ1 er effektiv i bare visse
MYC
-avhengige kreftformer, og som kan bestemme den kliniske effekten av denne forbindelse til pasienter.
Det ble observert at selv om JQ1 behandling minsket Brd4 belegget til en tilsvarende grad i de celletyper testet, til evnen til å redusere JQ1
MYC
transkripsjon mellom cellene var forskjellige. I JQ1-sensitive celler, skjedde hemming på nivå med begynnende transkripsjon påvirker Pol II, «pauset» Pol II-Ser5-P, «forlengelse» Pol II-Ser2-P og P-TEFb belegg. Videre er det en forskjell i belegg på medlemmer av Super Forlengelse Complex (SEC), og faktorer assosiert med RNA Polymerase II, på
MYC
promoter regioner i de to celletyper. Kollektivt, våre data indikerer et høyt nivå av
er myc
opprettholdt i forskjellige kreftceller via forskjellige mekanismer på nivået av transkripsjon forlengelse med forskjellige komplimenter av transkripsjonsfaktorer, og er derfor utsatt for forskjellig JQ1 følsomhet.
Materialer og metoder
Cell Culture
Den modne mus B-celle lymfom BAL17 [20], menneske BL linjer Akata [21], Raji [22], og Ramos [23], og menneskelig epitel linje HeLa-S3 [24] ble dyrket i RPMI-medium med HEPES (Invitrogen) supplert med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 1 mM natriumpyruvat og 0,5 mM 2-merkaptoetanol-løsning (Invitrogen) og 10% føtalt Calf Sera (Atlanta Biologicals). RNA baserte analyser brukt 1-2 × 10
6 celler og 2 × 10
7 celler ble brukt for Chromatin Immunpresipitasjon (chip). JQ1, oppløst i DMSO, ble fortynnet i media ved 1 uM og inkubert med celler i 2 timer ved 37 ° C. Det ble ikke observert effekter på transkripsjon med DMSO kontroller (data ikke vist). Eksperimenter som er vist i fig S1 (Fil S1) som omfatter BCR stimulering besto av en 2 timers forbehandling med 1 uM JQ1, etterfulgt av 30 minutters eksponering til antistoff-fragmenter som er spesifikke for enten human eller mus BCR (Jackson Immunoresearch).
RNA-real Time PCR-analyse
utført som tidligere beskrevet [25]. Ct-verdiene ble beregnet, og signalet angis som forholdet mellom målet over ACTB mRNA via lineære ligninger som er spesifikke for hvert primerpar. MYC primere er oppført i S3 (File S1) med mindre vist nedenfor.
mRNA Grunning-mus
MYC Grunning ikke er nevnt i figur S3 (File S1)
In1 /Ex1 5′-AGAGCTCCTCGAGCTGTTTG
5′-CGTCTACATTCAAGACGCAGA
ACTB 5′-AGGCATGGAGTCCTGTGGTATC
5′-AGCCACAGGTCCTAAGGCCAG.
Fos 5′-GGATTTGACTGGAGGTCTG
5’TGGGCTCAGGGTCGTTGA
mRNA Grunning Menneskelig
mYC Grunning ikke er nevnt i figur S3 (File S1)
In1 /Ex2 5′-GCACCAAGACCCCTTTAACTC
5′-TCCTGTTGGTGAAGCTAACGEx2 /In2 5′-AGCGACTCTGGTAAGCGAAG
5′-GTGGCCCGTTAAATAAGCTG
ACTB 5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT
5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG
Fos 5′-CTCCGGTGGTCACCTGTACT
5′-GTCAGAGGAAGGCTCATTGC
Western blotting
Nuclear ekstrakter fra 2 × 10
6 celler ble utsatt for 10% (Myc) eller 6% (Brd4) SDS-PAGE etterfulgt av Western blotting. Primære antistoffer (kanin-anti-C-terminale Brd4-C-IgG og kanin anti-Brd4-S484 /488-Phos) [26], [27], kanin anti-CREB IgG (cellesignalisering) og sekundære (geite-anti-kanin pepperrot peroksidase bundet IgG, Invitrogen) antistoffer ved 1:1500. Blottene ble visualisert med Novex ECL chemo-selvlysende substrat Regent Kit (Invitrogen) og densitometry utføres med ChemiDoc MP Imaging System (Biorad).
Strand-spesifikk påvisning
380 ng av RNA med 1fiM endelig primer konsentrasjon ble ansatt for hver RT reaksjon ved hjelp av Invitrogen sin Klonet AMV First Strand syntese kit. Strand-spesifikke primere; for (+) flertrådet revers primere tilsvarende den TSS området (+17 for mus og +11 for human) og for (-) tråd forover primere som korresponderer med enden av genet (+3948 for mus og +4791 for human, sekvenser i Figur S3, i File S1). Standard real-time PCR-amplifisering av det ble anvendt med de angitte primere og deres ledsagere, som er vist i figur S2 (Fil S1), og de resulterende Ct-verdier ble omdannet til relativ ng og normalisert til startkonsentrasjonen av kromosomalt RNA.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
En standard ChIP analysen ble utført og har blitt beskrevet tidligere [25]. PCR primere og ordningen er vist i figur S3, i File S1. Ct-verdier ble gjennomsnitt og signalet representert i% av innspill DNA via lineære ligninger som er spesifikke for hver primer par.
chip Antistoffer
Kanin polyklonale anti-mus RNA Pol II (N-20, sc -899, Santa Cruz), RNA Pol II-Ser5P monoklonalt (sc-47701, Santa Cruz), RNA Pol II-Ser2P H5 muse ascites (Covance), H3K36me3 Rabbit polyklonale (ab9050, Abcam), anti-Cyclin T kanin polyklonale (H-245, SC-10750, Santa Cruz), kanin-anti-C-terminal BRD4 IgG [27], MED26 mus anti-MED26 /CRSP7 (Ab50619, Abcam), Gdown1 sau anti-IgG Gdown1 [28], anti- AFF4 antistoff [29] og anti-ELL2 antistoff [29].
Sekvense Analyse
Figur S2 (File S1) viser sekvense data fra University of California Santa Cruz Genome Browser (UCSC GB) spor «wgEncodeUtaChIPseqBaseOverlapSignalHelas3Pol2» (HeLa S3) og GEO datasett GSM920942 (Raji), tilordnet menneskelige genom bygge hg18. The University of California Santa Cruz Genome nettleser sette normalisert til den høyeste toppen på TSS.
Resultater
Differensial JQ1 Følsomhet
Vi utførte dose- og tidsavhengig testing av Brd4 inhibering med JQ1 og bemerket effekt på
MYC
transkripsjon i en rekke celler, inkludert HeLa-S3-celler, hvis MYC-ekspresjon ble rapportert [19] for å være resistente mot JQ1 behandling. Vist på fig. 1A, testede cellelinjer som uttrykker
MYC
på høye nivåer, kan sammenlignes med nivåer som detekteres ved toppen av primær naive hvilende B-celle-induksjon (data ikke vist). Steady state mRNA nivåer av
MYC
i en ikke-BL murine B-celle lymfom linje (BAL17) at over uttrykker
MYC
på nivåer som ligner på BL celler og HeLa-celler viste ingen signifikant følsomhet for JQ1 (fig. 1A). Både HeLa og BAL17 cellene fortsatte denne motstand ved konsentrasjoner opptil 5 uM (data ikke vist), mens
MYC
RNA i BL-celler ble jevnt redusert med ~90% når de ble behandlet med 1 pM av JQ1 i en periode på to timer (fig. 1A). BL celler er rapportert å uttrykke 2- til 5 ganger mer
MYC
-spesifikke RNA enn B-cellelinjer uten trans [30]. Selv om Western blotting d indikerer Raji BL linjen uttrykker mer MYC-protein, i samsvar med mRNA-data (Fig. 1A), redusert JQ1 behandling MYC protein ekspresjon i Raji, men ikke HeLa og BAL17 (data ikke vist). Sammen disse resultatene viste at JQ1 motstand skjedde i både ikke-lymfom og lymfom cellelinjer som representerer både murine og menneskelige arter.
BAL17 (Murine B-celle), Human HeLa, and Human BL Raji celler og enten ubehandlet eller behandlet med 1 uM av JQ1 i 2 timer. (A) mRNA-analyse ble utført i tre eksemplarer, rapportert i forhold til ACTB mRNA-ekspresjon og er vist som gjennomsnittet og standardavvik for tre eksperimenter. (B) Påvisning av primær transkripsjon ved PCR amplifikasjon bruk av prim over interne ekson /intron grensene til
MYC
ble utført tre ganger og rapportert i forhold til ACTB mRNA uttrykk. (C) Strand-spesifikk transkripsjon ble oppdaget av strand spesifikk revers transkripsjon forsterkning som beskrevet i Materiale og metode etterfulgt av standard PCR metoder. Disse eksperimentene ble utført to ganger.
Ettersom mRNA produksjon ikke nødvendigvis korrelerer med primærtranskriptet produksjon [25], [31], testet vi effekten av JQ1 på primær transkripsjon. Analyse av primær avskrift, utført med primere mot ekson /intron grensene til
MYC plakater (skjematisk i Supplemental Fig. 3 og /eller oppført i materialer og metoder), viste at primær transkripsjon følsomhet for JQ1 var parallell til den av mRNA (fig. 1B). Dermed lenge, og antagelig full-lengde, primære transkripsjoner var enten resistente (BAL17 eller HeLa) eller sensitiv (Raji) til JQ1. Derfor er forskjellen i JQ1 responser korrelert med primære transkripsjon og fant ikke sted ved nivået for post-transkripsjonell modifikasjon, slik som spleising og mRNA eller proteinstabilitet.
Avvikende transkripsjon er vanlig for mange promotorer i organismer og spiller en viktig rolle i genregulering [32]. Faktisk har anti transkripsjon fra
MYC
locus blitt observert i flere cellelinjer [33]. Fordi vi bare målte total steady state-RNA (fig. 1A), enten differensial JQ1 følsomhet skyldes forskjeller i mulig transkripsjonen som stammer fra 3′-enden ble testet. Selv om antisense transkripsjon både BAL17 og HeLa-celler var liten i forhold til å oppfatte transkripsjon, det var i stor grad upåvirket av JQ1 (Fig. 1C, venstre og midtre paneler). Den brede forskjell i nivåene av fornuft og antisense transkripsjoner observert blant ulike cellelinjer er foreløpig uforklarlig, men kan gjenspeile en kombinasjon av transkripsjons og post-transkripsjon effekter. Uansett, som følelse transkripsjon, anti transkripsjon stammer fra
MYC
locus i Raji celler ble hemmet av JQ1 (Fig. 1C, panel til høyre). Derfor, selv om mer anti transkripsjon ble notert i Raji celler, forskjellen i JQ1 sensitivitet var ikke sannsynlig på grunn av forskjeller i antisense transkripsjoner.
JQ1 fører til redusert Brd4 Occupancy i Resistent og sensitive celler
Vi har observert at Brd4 rekrutteringen ble redusert med JQ1 i begge celletyper-derfor, forskjellen i JQ1 følsomhet mellom forskjellige celler var ikke på grunn av permeabilitet. Vi observerte også at Brd4 rekruttering til transkripsjon start hotellet (TSS) var omtrent 2,5 ganger mer i Raji (+11) celler i forhold til BAL17 (17) (fig. 2A). HeLa utstilt Brd4 rekruttering og JQ1 følsomhet lik BAL17 (data ikke vist). Videre ble en betydelig mengde Brd4 belegg bemerket over hele kroppen av
MYC
i alle cellene testet, selv om det var et høyere nivå av kodende region belegg i BAL17 celler. Selv vanligvis forbindes med 5′-end forsterkere og arrangører, har Brd4 vist seg å okkupere kodende regionen til PRGs som c-
fos Hotell og
MYC product: [26].
Celler var enten ubehandlet eller behandlet med 1 pM av JQ1 i 2 timer. (A) Chromatin Immunoutfelling (chip) over
MYC
med anti-C-terminal Brd4 antistoff. Hvert eksperiment ble utført to ganger, analysert i triplikat via sanntids-PCR og rapportert som gjennomsnittet og standardavvik for de to forsøk. En representasjon av promoteren område i
MYC
er anordnet for orientering. (B) Western blotting til å oppdage (helt til venstre) Brd4 (~180 KD) og (i midten) Brd4-S484 /488-Phos (P-Brd4, ~220 KD) ble utført tre ganger. En uspesifikk bandet oppdaget med phopsho-Brd4 antistoff er merket med en stjerne. Typiske resultater er vist med densitometry analyse i forhold til CREB uttrykk, som brukes som en normalisering kontroll (helt til høyre).
Arrangøren rekruttering av Brd4 krever fosforylering på S484 og S488 og sletting av denne regionen resultater i redusert CycT og Pol II belegg og transkripsjon [26]. I samsvar med chip-analyse, Western blotting viste et høyere nivå av total Brd4 i Raji-nukleære ekstrakter sammenlignet med HeLa og BAL17, selv om Brd4-S484P /S488P i Raji-celler som var noe mindre i forhold til BAL17 og HeLa (Fig. 2B). Interessant, P-BRD4 band i HeLa celler migrert raskere enn både Raji eller BAL17 P-Brd4 band, som kanskje gjenspeiler en liten forskjell i grad eller stedet fosforylering. Imidlertid kan forskjellen i fosforylert Brd4 (aktiv form) mellom ulike celler ikke forklare forskjellene i JQ1 følsomhet.
Brd4 samhandler med faktorer som enten rekrutt Pol II til stedet for transkripsjon eller kjøre transkripsjonskomplekset fra pause for å forlengelsen modus (anmeldt i [10]). I tillegg ble en reduksjon av funksjonell Brd4 resulterer i sterkt redusert Pol II belegg vist seg å innebære et tap av P-TEFb [26]. Selv om nivået og mønster av P-TEFb belegg i både ubehandlet JQ1 sensitive og resistente celletyper var like, JQ1 behandling /Brd4 inhibering redusert P-TEFb belegg bare i Raji-celler (Fig. 3). Disse resultatene indikerer nivåene av BRD4 avhengighet for å opprettholde P-TEFb belegg varierer i forskjellige cellelinjer (Fig. 3).
BAL17 og Raji-celler var enten ubehandlet eller behandlet med 1 pM av JQ1 i 2 timer. Rekruttering av P-TEFb ble oppdaget av chip analyser. Hvert eksperiment ble analysert i tre eksemplarer via real-time PCR, utført to ganger, og er rapportert som gjennomsnitt og standardavvik for de to forsøkene.
RNA Pol II Rekruttering
neste bestemmes hvis forskjellen i JQ1 selektivitet var på grunn av en forskjell i transkripsjon generelt apparat rekruttering, representert ved RNA polymerase II (Pol II). Mens total Pol II ble sterkt redusert over hele kroppen av
MYC
i Raji celler ved JQ1 behandling, ble det ikke endret i JQ1 motstandsdyktig BAL17 linjen (fig. 4A). Begge celletyper viste Pol II belegg ved P
0 promoter, som har vist seg å korrelere med et meget høyt nivå av transkripsjon [34]. Mange aktivt transkriberte gener (inkludert
MYC
) utstillings pauset Pol II ved sine proksimale arrangører [35]. I samsvar med dette begrepet, observerte vi et høyt nivå av promoter-assosiert Pol II i begge celletyper, selv om to-ganger mer Pol II ble notert ved den proksimale promoter (omtrent tilsvarende P
0 promoter region) i BAL17 ( -354) sammenlignet med Raji (-279). Interessant, som bemerket med Brd4 og P-TEFb (fig. 3 og 4), total Pol II ble redusert ved et sted umiddelbart nedstrøms (0,6 kb) av TSS og kraftig økt etterpå (fig. 4A).
Celler var enten ubehandlet eller behandlet med 1 pM av JQ1 i 2 timer. (A) Pol II ble påvist ved antistoffer mot N-terminalen i Pol II (B) Pol II Serin 5-P (C) Pol II serin 2-P. Kromatin Chip ble utført i duplikat. Hvert eksperiment ble analysert i triplikat via sanntids-PCR, utført to ganger, og er rapportert som gjennomsnittet og standardavvik for de to forsøk.
På grunn fosforylering av den karboksy-terminale domene (CTD) av RNA-Pol II er forbundet med regulering av transkripsjon initiering og forlengelse ved mange promotere [36], [37], analyserte vi disse hendelsene i de to celletyper i fravær og nærvær av JQ1. Mens RNA Pol II fosfor-Ser5 (Pol II S5P) nivåer i BAL17 celler holdt seg stabil etter JQ1 behandling, Pol II S5P nivåer i Raji celler var følsomme for JQ1 (Fig. 4B). Men overraskende, Pol II S5P nivåene var ildfast ved P
0 og TSS områder (Fig. 4B, panel høyre), men følsom i siste halvdel av genet med en liten endring starter nedstrøms av
MYC
P3 promoter (2244) og blir stadig mer følsom lenger ned på kroppen av genet. Hvorvidt betydelig mengde Pol II-Ser5P 3 «belegg som vises her er direkte grunn til 3» Brd4 belegg eller en overdoser av transkripsjons komplekser «sikkerhetskopiering» noe som resulterer i redusert tøyelighet og påfølgende pauser på 3 «endestasjonen er ukjent.
Mens Ser5 fosforylering er assosiert med en kompetent, men pauset Pol II, Ser2 fosforylering av Pol II CTD (Pol II S2P) representerer elongating Pol II [37]. I fravær av JQ1, Pol II S2P belegg i begge celletyper oppstått over hele kroppen av genet med topper ved promotorområdene, og 3′-enden. Overraskende, mens promoter og TSS-assosierte Pol II S2P nivåene i Raji-celler som var følsomme for JQ1, nedstrøms regioner erte p
3 viste ingen JQ1 følsomhet til forbi det 3′-UTR (5472) (fig. 4C), noe som tyder at flertallet av fullt forlengelse RNA polymerase II i disse JQ1 sensitive celler var motstandsdyktige overfor JQ1. Vi observerte også en JQ1 avhengig økning i Pol II-Ser2P i BAL17 linje og mens økningen var svak på arrangøren og TSS regioner, det var veldig klar på 3 «endestasjonen.
Forskjeller i H3K36me3
en mulig måte å avgrense mellom oppstrøms og nedstrøms virkninger på Pol II-Ser2 belegget er for å bestemme mønsteret av tri-metylering av histon-3 residuet lysin 36, H3K36me3, noe som er en indikasjon på en nylig passerer forlengelse transkripsjon kompleks [37]. I BAL17-celler, JQ1 behandling forbedret H3K36me3 signalene på tvers av genet (fig. 5). Men i Raji celler, redusert JQ1 behandling H3K36me3 fra P
0 til TSS før P
3 region. Men utover P3, ble H3K36me3 refraktære til JQ1 (fig. 5) som observert med Pol II S2P (fig. 4C), som tyder på at når RNA-Pol II var i forlengelse modus, det var ufølsom for JQ1. Sammen våre data viste at
MYC
næret transkripsjons komplekser med variabel Brd4 avhengighet i forskjellige celletyper, og at Brd4 inhibering resulterte i en differensial reaksjon på nivå med overgangen fra pause til å forlengelse.
Celler var enten ubehandlet eller behandlet med 1 pM av JQ1 i 2 timer. Chip analyser ble utført i duplikat. Hvert eksperiment ble analysert i tre eksemplarer via real-time PCR, utført to ganger, og er rapportert som gjennomsnitt og standardavvik for de to forsøkene.
Tilbehør transkripsjon Forlengelse Factors
P- TEFb fungerer ofte som en subenhet av Super Forlengelse komplekser (SEC), som består av P-TEFb og en blanding av en av tre ell familiemedlemmer, en av to familiemedlemmer EAF, en av to AF4 familiemedlemmer (AFF1 og AFF4), og enten ENL eller AF9 [29], [38]. Som SEC familien av Pol II forlengelsesfaktorer er angitt å inneholde de katalytisk aktive versjoner av P-TEFb aktive i høyt nivå transkripsjon og for å regulere en kontrollpost stadium av transkripsjon i forbindelse med forlengelses [29], [39], [40] så vi på SEC rekruttering på
MYC
i ulike celletyper. AFF4 er rapportert å tjene som en sentral bindings plattform for forlengelsesfaktorer i mange SEC formasjoner, og til å målrette
MYC
og regulere dets ekspresjon i kreftceller [39]. Nivået på AFF4 belegg i BAL17 celler var lav og ildfast å JQ1 (Fig. 6A, topp panel), men økte i nærvær av JQ1. I motsetning til dette, AFF4 rekruttering i Raji-celler som var mye større og følsomme for JQ1. Selv om AFF4 promoteren belegg i Raji-celler, spesielt rundt 2244 stedet, var variabel i fravær av JQ1, det ble signifikant redusert i nærvær av JQ1. Dessuten, i samsvar med Pol II S2P og H3K36me3 resultater, ble JQ1 følsomhet tapt forbi P
3 promoter region (2244), igjen tyder på at den elongating transkripsjon komplekset var motstandsdyktige overfor JQ1 (fig. 6A, nedre panel) .
Celler var enten ubehandlet eller behandlet med 1 pM av JQ1 i 2 timer. (A) AFF4 ble detektert av Chip på tvers av lengden av
MYC
genet i både BAL17 og Raji-celler. (B) Påvisning av AFF4, ELL2 og MED26 i promotorområdene av ubehandlet humane HeLa og Raji celler. Chip analyser ble utført i duplikat. Hvert eksperiment ble analysert i tre eksemplarer via real-time PCR, utført to ganger, og er rapportert som gjennomsnitt og standardavvik for de to forsøkene.
Vi har senere sett på plass til en annen SEC komponent, ELL2, som er blitt rapportert å spille en rolle i overgangen fra midlertidig stoppet Pol II av dennes forlengelse [40]. Vi testet også belegg av Mediator komponent (MED26) samt Gdown1. Selv om første knyttet til iverksettelse, en rolle for megler i rekrutterings Pol II transkripsjonsforlengelses faktorer og fosforylering av Pol II CTD regulere Pol II pauser og forlengelse har dukket opp [41]. Den Mediator komplekset sterkest assosiert med Pol II omfatter MED26, som har vist seg å øke aktivering av transkripsjon in vitro i større grad enn andre former av Mellommann komplekse og spiller en nøkkelrolle i SEC rekruttering og MYC transkripsjon [41]. Gdown1 er en Pol ll-bindende protein vist å være nødvendig for en Mediator-avhengig respons til aktivering av transkripsjon [42]. Mer hensiktsmessig til denne studien har Gdown1 nylig blitt vist å øke stabiliteten til midlertidig stoppet Pol II og regulere P-TEFb aktivitet [28].
Fordi de tilgjengelige antistoffer mot ELL2, Med26 og Gdown1 ble arter (human) spesifikk, ansatt vi HeLa og Raji celler for disse eksperimentene. På grunn av forskjellene fokusert rundt den P3-regionen fokuserte vi på den generelle promotorområdet (P
0, TSS, og p
3) for å teste forskjeller mellom disse cellelinjene. Som observert for BAL17-celler, HeLa-celler oppviste lav AFF4 rekruttering i dette området i forhold til Raji-celler (Fig. 6B). I samsvar med AFF4 rekrutterings resultater, økt ELL2 belegg nær P
3 ble sett i Raji celler sammenlignet med HeLa-celler. MED26 belegget viste et mønster som ligner på den andre SEC komponenter med en økning, skjønt mer beskjedne, ved p
3-promoteren i Raji-celler (Fig. 6B). Til slutt, observerte vi at Gdown1 fulgt et mønster som ligner på den for SEC og Mediator med en økning rundt P
3-promoteren i Raji-celler (Fig. 6B).
diskusjon
Due til viktigheten av
MYC
i tilblivelsen av blodkreft maligniteter, intens innsats har vært rettet for de siste to tiårene mot å forstå sin regulering. Likevel, gitt at
MYC
overekspresjon er forårsaket av en mengde genetiske skader, mangler fortsatt en ensartet regelverk sin transkripsjonsregulering. Nylige fremskritt på dette området omfatter oppdagelsen av et lite molekyl hemmer, JQ1 som reduserer
MYC
uttrykk og er terapeutisk effektive i prekliniske dyremodeller av midtlinjen karsinom og i BL celler. Men JQ1 ikke hemme
MYC
uttrykk til en lignende grad i alle kreftceller, ytterligere understreking at
MYC
transkripsjon er kanskje under ulike kontroller i ulike kreftcelletyper. I samsvar med denne oppfatningen, oppdaget vi at JQ1 hemmer
MYC
uttrykk i alt BL-deriverte celler testet, men hemmer ikke
MYC
uttrykk i enkelte andre kreftcellelinjer, som observert tidligere (19) . Fordi
MYC
deregulering kan skje via ulike modi, hypotese vi at i forskjellige Lymfekreft fenotyper, høyt nivå
MYC
uttrykk kan komme under kontroll av forskjellig transkripsjonen og epigenetiske reguleringsmekanismer, som kan være følsomme eller resistente mot JQ1 /Brd4 hemming. I denne studien utforsket vi disse mekanismene for å etablere
MYC
transkripsjonen og epigenetiske signaturer forbundet med bestemte celletyper med håp om at disse signaturene vil bedre definere lymfom subtyper og gi nye terapeutiske veier å utforske for klinisk aggressiv B-celle lymfomer .
Selv om BL-celler er en heterogen masse med forskjeller i lengden på Ig /MYC translokasjon som angivelig oversette til variable nivåer av
MYC
overekspresjon [43], BL celler i våre hender (fig . 1 og figur S1, i File S1), og andre [19], er jevnt utsatt for hemming av
MYC
uttrykk via Brd4 hemming av JQ1. Denne hemming synes å være uavhengig av om disse er EBV positive eller negative BL linjer (vår studie og ref 19). Brd4 er primært knyttet til 5′-end arrangører og forsterkere [44], [45], [46], og mens vi ser en mer fremtredende nivå Brd4 på TSS i Raji celler (fig. 2), vi også observere Brd4 belegg over hele kroppen av
MYC
genet i JQ1 resistente celler (fig. 2). En funksjon av Brd4 er P-TEFb rekruttering og P-TEFb belegg gjør parallell Brd4-hemmer sensitive
MYC
transkripsjon, til tross for at det er liten forskjell i P-TEFb belegg i ubehandlede celler av enten resistent eller sensitive celler. Derfor ser det ut til at det i cellene motstandsdyktig mot JQ1, en Brd4-uavhengig mekanisme driver å rekruttere eller beholde P-TEFb og produsere høye nivåer av
MYC
transkripsjon.
Fordi SEC komponenter AFF4 og ELL2 spille en rolle i
MYC
regulering og transkripsjonen forlengelse, vi en hypotese om at en økning i disse co-faktorer kan slappe Brd4 krav. Overraskende, deres økte nærværet faktisk korrelert med økt krav til Brd4 (Fig. 6). Posisjonen til økt SEC komponentene sammen med MED26 og Gdown1 rundt P3 arrangøren antyder høy transkripsjonen aktivitet eller et regulatorisk sjekkpunkt i denne regionen som ikke finnes i celler som er resistente mot JQ1 (oppsummert i figur 7). Det har blitt bemerket at i BL celler, på grunn av
MYC-IG
trans blir ellers mindre P3 promoter ofte aktiv og korrelerer med høyere MYC uttrykk [43]. Sammen med den siste demonstrasjonen at translocated
MYC
locus havner super enhancers som er følsomme for JQ1 [45], øker dette muligheten for at mekanismen for transkripsjonsregulering av
MYC
involverer sin opprinnelige /non-translocated enhancer er annerledes (fig. 7B, Figur S2, i File S1).
(A) oppsummering av nivåer av faktor belegg spenner over
MYC
arrangøren P
0,
