Abstract
Beskyttet og spesifikk levering av nukleinsyrer til ondartede celler forblir en svært ønskelig tilnærming for kreftbehandling. Her presenterer vi data om de fysiske og kjemiske egenskaper, virkningsmekanisme og pilot terapeutisk effekt av en tenfibgen (TBG) -shell nanokapsel teknologi for svulst styrt levering av enkelttrådet DNA /RNA kimære oligomerer rettet mot CK2αα «til xenografttumorer hos mus . Under 50 nm størrelse TBG nanokapsel (S50-TBG) er et svakt negativt ladet, jevn partikkel av 15 – 20 nm størrelse som gir beskyttelse til nukleinsyren lasten. DNA /RNA kimære oligomer (RNAi-CK2) funksjoner for å redusere CK2αα «uttrykk nivåer via både siRNA og antisense mekanismer. Systemisk levering av S50-TBG-RNAi-CK2 rettet spesielt ondartede celler, inkludert kreftceller i bein, og ved lave doser reduserer størrelsen og CK2 relaterte signaler i ortotopiske primære og metastatiske xenograft prostata kreftsvulster. Konklusjonen er at S50-TBG nanoencapsulation teknologi sammen med kimære oligomer målretting CK2αα «tilbud betydelig løfte for systemisk behandling av prostata kreft
Citation. Trembley JH, Unger GM, Korman VL, Abedin MJ, Nacusi LP, Vogel RI, et al. (2014) Tenfibgen Ligand Nanoencapsulation Leverer Bi-Functional Anti-CK2 RNAi oliqomer til viktige områder for prostatakreft Targeting med humane xenografttumorer i Mus. PLoS ONE 9 (10): e109970. doi: 10,1371 /journal.pone.0109970
Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA
mottatt: 04.08.2014; Godkjent: 02.09.2014; Publisert: 15 oktober 2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dets støtte informasjon filer
Finansiering:. Merit gjennomgang forskningsmidler (1IO1B001731) tildelt av Department of Veterans Affairs www.va.gov (KA). Forskningsstipend CA150182 tildelt av National Cancer Institute, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services www.nih.gov (KA). Forskningsmidler CA158730 og DK067436-05 tildelt av National Cancer Institute og National Institute of Diabetes, Digestive Diseases og nyre sykdommer, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services www.nih.gov (BTK). Forskning gir HHS-N261-2008-00027 /N42CM-2008-00027C, CA99366, og CA119556 tildelt av National Cancer Institute, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services www.nih.gov (GMU). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ansvarsfraskrivelse: Synspunktene i denne artikkelen er de av forfatterne, og reflekterer ikke nødvendigvis den posisjon eller politikken til USAs Department of Veterans Affairs eller myndighetene i USA
Konkurrerende interesser:. GMU har eierinteresser ( inkludert patenter) i GeneSegues, ble Inc. Ingen potensielle interessekonflikter fremgår av de andre forfatterne. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
over hele spekteret av ondartet sykdom, effektiv behandling for avansert og /eller metastatisk kreft rester et kritisk mål i arbeidet med å redusere kreftrelatert dødelighet. Nukleinsyre-baserte kreftterapi fortsetter å holde vesentlig løftet for genspesifikke, effektiv, og lav toksisitet sykdom behandling som har den ytterligere potensial for å overvinne motstand terapeutisk hyppig observert i aggressiv sykdom. Både anti og siRNA-baserte legemiddelselskap har inngått kliniske studier med svært moderat suksess [1] – [4]. Viktige hensyn ved systemisk bruk av korte lineære nukleinsyrer som en terapeutisk enhet inkluderer at de er rettet spesifikt til kreftceller i en beskyttet måte, effektivt krysse cellemembraner og engasjere cellen maskiner. Mange måter å innlemme disse begrepene har vist nytte i musemodeller inklusive, f.eks PSMA målrettede aptamer-siRNA chimeras, Her2 målrettede enkelt kjede fragmentert antistoff-protamin fusjonsprotein mediert siRNA levering og transferrin reseptor-målrettet syklodekstrin-basert polymer mediert siRNA levering [1], [5], [6]. Vår tilnærming til effektivt å levere nukleinsyre-terapeutiske midler for tumorer anvender et sub-50 nm størrelse nanokapsel omfattende liganden tenfibgen (TBG), den karboksy-terminale fibrinogen globus domene av tenascin-C. TBG danner proteinet ligand skallet av nanokapsel og tillater reseptor-mediert målretting til kreftceller via tenascin-reseptorer, som er forhøyet i disse cellene [7] – [12]. TBG nanokapsler er spesielt tatt opp av tumorceller og tumor-avledet microvessels men ikke av normale celler eller fartøy [13] -. [15]
CK2 (tidligere kasein kinase II eller CKII) er en allestedsnærværende protein Ser /thr kinase med en heterotetrameric struktur bestående av to katalytiske subenheter (42 kDa α og /eller 38 kDa α «) og to regulatoriske subenheter (28 kDa β) i α
2β
2, αα’β
2 eller α
2β
2 konfigurasjoner. CK2 fosforylerer et stort antall substrater med forskjellige funksjoner relatert til cellevekst og proliferasjon, er konstitutivt aktiv, og er essensiell for overlevelsen [16] – [22]. Videre CK2 har blitt funnet å være oppregulert ved alle krefttyper undersøkt, hvor en av dens funksjoner er å undertrykke apoptose [18], [23] – [29]. Vi har tidligere etablert effekten av vår 20-mer nukleinsyresekvens for målretting både CK2α og CK2α «. Vi har brukt denne sekvens som en antisense oligonukleotid levert systemisk til mus som bærer ortotopiske PCA tumorer, som et siRNA last for S50-TBG nanokapsler levert til dyrkede prostatakreft (PCA) celler, og som en enkeltkjedet RNAi-CK2 last for S50-TBG nanokapsler levert systemisk til mus som bærer hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) xenografter [15], [30] – [32]. Her utvider vi på mekanismen og behandling nytte av både S50-TBG nanokapsel og RNAi-CK2 oligomer ved hjelp av menneskelige prostata kreft xenograft modeller initiert i mus i terapeutisk relevante nettsteder. Vi presenterer data som karakteriserer S50-TBG nanokapsel og sin systemisk levering som proof-of-concept for muligheten til å målrette viktige
in vivo
PCA tumorvekst nettsteder samt effekten av å bruke RNAi-mediert nedregulering av CK2 som en terapeutisk tilnærming.
Resultater
Tenfibgen nanokapsel design og stabilitet
for å nå målet om å redusere CK2 uttrykk spesielt i maligne prostataceller, et enkelttrådet DNA /RNA kimære molekyl (RNAi-CK2) rettet mot CK2αα «subenheten transkripsjoner ble kondensert og innkapslet i et skall av protein sammensatt av TBG. TBG nanokapsler er vanligvis 15-20 nm i størrelse, og skriv kreftceller via tenascin reseptorer hjelp av lipid flåte-mediert caveolar vei [13], [15]. Kjennetegn og morfologi av TBG-RNAi-CK2 nanokapsler så vel som strukturen og sekvensen av RNAi-CK2 er oppsummert i tabell 1 og figur 1a, b. Stabilitetsanalyse av nakne RNAi-CK2 kimære oligomer og S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapsler (Fig. 1c) viser at etter proteinase K fordøyelsen av nakne RNAi-CK2 oligomer (venstre panel) eller S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapsler (høyre panel), forblir oligomeren lasten intakt. Dessuten viser behandling av nanokapsler med DNase før Proteinase K fordøyelse at nukleinsyren lasten er fullstendig beskyttet av innkapslingen fremgangsmåte (Fig. 1c, høyre panel).
(a) tegneserie fremstilling av nanokapsel design. (B) Overføring elektronmikroskop av S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapsler for
in vivo
studier. Forstørrelse 230.000 ×. Scale bar 100 nm. (C) Venstre panel: Naked RNAi-CK2 oligomer ble kuttet med proteinase K i 24 til 96 timer. INP, ufordøyd inngang oligomer. Høyre panel: Naked og S50-TBG innkapslet RNAi-CK2 oligomerer ble fordøyd med DNase fulgt av proteinase K som angitt ovenfor panelet. Lanes 1 2, nakne RNAi-CK2; 3 4, naken RNAi-CK2 med TBG-sukker nanokapsler inkludert i fordøyelsen; 5-7,
in vitro
bruk formulering av S50-TBG-RNAi-CK2; 8 – 10,
in vivo
bruk formulering av S50-TBG-RNAi-CK2
Potensielle virkningsmekanismer for RNAi-CK2 DNA /RNA kimære oligomer
enkelttrådet DNA /RNA oligomer last RNAi-CK2 kan fungere for å redusere CK2 uttrykk gjennom antisense- og /eller siRNA baserte mekanismer. For å løse dette, må vi først undersøkt om vår RNAi-CK2 oligomer konstruksjon som består av 14 standard fosfodiester DNA-rester ved 5 «enden, 6 2»
O
metyl RNA rester på 3 «enden, og en terminal propyl linker (merket RNAi-CK2-6R i fig. 2a) kan tjene som en stimulans for RNase H1 aktivitet. Til sammenligning, er inkludert vi den samme sekvens som består utelukkende av fosfortioat (PS), modifisert DNA-rester (AS-CK2-PS), så vel som en oligomer utforming med 8 standard DNA-rester ved 5»-enden, 12 2 «
O
-metyl-RNA-rester ved 3′-enden, og en terminal propyl-linker (RNAi-CK2-12R). Dataene i Figur 2a viser at RNAi-CK2 oligomer med 14 DNA-rester (RNAi-CK2-6R) fungerer som en effektiv stimulans for RNase H1 aktivitet. Gjennom resten av manuskriptet er RNAi-CK2-6R referert til som RNAi-CK2 og er et terapeutisk legemiddel innkapslet i TBG nanokapsler.
(a) RNase H1 substrat utprøving av forskjellige former DNA /RNA-sammensetning av RNAi-CK2 oligomerer. 5 «ende-merket med (*) RNA-proben ble hybridisert med RNAi-CK2-6R, RNAi-CK2-12R eller AS-CK2-PS komplementære oligomerer, så inkubert i forskjellige tidsrom med RNase H1. Bokstavene på venstre side av gel og innfelte representerer sekvens stiger for 5 «end-merket RNA underlaget. Dimensjonering stiger er angitt som AL (alkalisk lysering), C (minus RNase T1), og T1 (RNase T1 cleavage). RNase H1 oppslutningstider er 0, 30, 60 og 120 s (banene 1-4, henholdsvis). Identiteten av test oligomeren er angitt ovenfor banene. Det innfelte viser en lysere eksponering av RNAi-CK2-12R RNase H1 reaksjonsprodukter. Oligomers supplert med merket RNA probe er vist med pilspisser indikerer store kutteseter. For de RNAi-CK2-6R og RNAi-CK2-12R oligomertynnfilmer sekvenser, betegner små bokstaver 2 «
O
metyl RNA Rester og store bokstaver er konvensjonelle fosfodiester knyttet DNA-rester. AS-CK2-PS er et phosphorothioate knyttet DNA oligomer. (B) Påvisning av Ago2 /RISC spaltningsprodukter produsert av RNAi-CK2 transfeksjon inn PC3-LN4 celler. 5 «RNA-ligase-mediert RACE ble utført for CK2α og CK2α» transkripsjoner som skissert i nettet metoder. Lanes 1 5, siControl transfekterte celler; 2 6, siCK2 transfekterte celler; 3 7, RNAi-CK2 transfekterte celler; 4 8, ingen cDNA vann kontroller; M, DNA størrelsesmarkører. De predikerte RACE produkter (CK2α, 242 bp, CK2α «, 236 bp) er angitt til venstre, og genet spesifikke primere som brukes er angitt ovenfor banene. (C) Kartlegging av RACE-spaltingssetet ble oppnådd ved sekvensering av produktene oppnådd i (b). MRNA-sekvensen vises med små bokstaver, det transfekterte oligomer er avbildet under mRNA, og kutteseter er indikert med en pilspiss.
For å undersøke involvering av siRNA baserte mekanismer, RNA renset fra TBG-RNAi -CK2 transfekterte PC3-LN4 [33]-celler dyrket på tenascin-C /fibronektin (TnFn) ble analysert ved bruk av en modifisert 5′-RNA-ligase-mediert RACE teknikk for å kartlegge eventuelle mulige spaltningsseter som følge av Ago2 /RISC-basert behandling av DNA /RNA kimære oligomer. Renset RNA fra celler transfektert med siRNA til CK2 (samme sekvens som target RNAi-CK2), eller et ikke-målsøkende kontrollsekvens ble anvendt som ytterligere kontroller. Som vist i figur 2b, ble spaltningsproduktene av CK2α og a «transkripter påvises både i RNAi-CK2 og siCK2 transfekterte celler. Kartlegging av spaltningssetene ved sekvensering av RACE produkter bekreftet spaltningen sted i begge transkriptene ved den forutsagte 10
th nukleotid fra 5′-enden av oligomeren [34] (fig. 2c). Sammen utgjør disse resultatene indikerer at RNAi-CK2 kan nedregulerer CK2α og CK2α «transkripsjoner av RNase H og Ago2 mekanismer.
Effekter av TBG-RNAi-CK2 om ondartede og godartede dyrkede celler
Vi har konsekvent observert at s50-TBG nanokapsler levere sin last til perinukleær regionen foregående atom oppføring, uavhengig av kreftcelletype. For ikke-nukleinsyre-arter, slik som kontrastmidler, blir lasten vanligvis eksporteres fra kjerner til cytoplasma, hvor det akkumuleres i cytoplasmatiske organeller og blir deretter eksportert. For ytterligere å karakterisere menneskehandel og last utgivelsen av S50-TBG nanokapsler, ondartede PC3-LN4 celler ble dyrket på TnFn belagt tre-dimensjonale nanofiber stillaser (TnFn-3D) for å lette dannelsen av lipid flåter nødvendige for S50-TBG nanokapsel studier [15] . Figur 3a illustrerer transport til kjernen, last frigivelse, og eksport av FeO-dekstran i løpet av en 24 timers periode etter behandling av cellene med S50-TBG-FeO-dekstran nanokapsler. I en tilsvarende studie ble en sammenligning av S50-TBG-FeO-dekstran opptak 8 timer etter tilsetning av nanokapsler til celler utføres i PC3-LN4 og benign prostatahyperplasi (BPH-1) celler. Resultatene viser ivrig opptak av TBG-Feo nanokapsler av ondartede men ikke godartede celler (fig. 3b).
(a) Opptak over 24 timer med S50-TBG nanokapsler med FeO-dekstran last i PC3-LN4 celler sådd ut på TnFn-3D. Cellene ble farget med DAB-forbedret prøyssiske blå for jern og kontra med Fast Red. Scale bar 100 mikrometer. (B) Malign cellespesifikke opptak av S50-TBG nanokapsler. S50-TBG-FeO-dekstran opptaket ble bestemt av jern flekker på 8 timer i PC3-LN4 og BPH-1 celler dyrket på TnFn- eller laminin-belagt nanofiber stillas, henholdsvis. Scale bar 100 mikrometer. (C) Cellular spredning effekter av S50-TBG-RNAi-CK2 behandling i godartede og ondartede prostata celler. PC3-LN4 og c4-2 dyrket på TnFn-3D og BPH-1 celler dyrket på laminin-3D i 96-brønners plater ble behandlet med S50-TBG-RNAi-CK2 eller kontrollere TBG nanokapsler som inneholder RNAi-RFP-6R rettet mot Red Fluorescence protein som angitt.
3H-tymidin ble tilsatt etter 48 timer, og cellene analysert ved 72 timer etter tilsetning nanokapsel. Resultatene er uttrykt i forhold til behandling med S50-TBG-sukker nanokapsler. S50-TBG nanokapsel last og cellelinjer som benyttes er angitt under linjene. Gjennomsnitt ± SE er presentert (n = 3 for alle). * P 0,005 forhold til S50-TBG-sukker og -RFP; # P 0,01 i forhold til TBG-sukker; $ P = 0,006 i forhold til TBG-RFP. (D) S50-TBG-RNAi-CK2 behandling redusert CK2α og CK2α «mRNA steady-state uttrykk nivåer i PC3-LN4 celler. mRNA isolert fra PC3-LN4 celler dyrket på TnFn 24 og 48 timer etter s50-TBG-RNAi-CK2 eller Sukker-behandling som angitt ble analysert ved revers transkriptase real-time kvantitativ PCR for CK2α og CK2α «uttrykk. HPRT-transkript ble anvendt for å normalisere ekspresjonsnivåer. Betyr, SE og p-verdier presenteres (24 h CK2α n = 5, CK2α «n = 6; 48 h CK2α n = 2, CK2α» n = 2).
Vi undersøkte effekten av S50-TBG-RNAi-CK2 på spredning av dyrkede prostata celler ved hjelp av svært tumorigene PC3-LN4 og c4-2 cellelinjer i forhold til BPH-en. Behandling av PC3-LN4 og c4-2 celler dyrket på TnFn-3D med S50-TBG-RNAi-CK2 for 3 dager resulterte i et betydelig tap av celleproliferasjon målt etter [
3H] -tymidin inkorporering, mens TBG-RNAi -CK2 behandling av BPH-1-celler dyrkes på en laminin matrise ikke redusere proliferasjonen (fig. 3c). Ved hjelp av kvantitativ revers transkriptase real-time PCR, CK2α og CK2α «mRNA-nivåer ble funnet signifikant redusert i TnFn dyrkede PC3-LN4 celler 24 og 48 timer etter behandling med S50-TBG-RNAi-CK2 (fig. 3d), og reduksjonen var tilsvarende det som er observert etter behandling med TBG-siCK2 [31].
Biofordeling av TBG nanokapsler
for å demonstrere at s50-TBG nanokapsler binde ondartede og ikke normal vev celler, og at de ikke akkumulerer ikke-spesifikt i det retikuloendoteliale system, ble frosne deler av PC3-LN4 ortotopisk xenograft tumor så vel som ikke-tumorbærende mus lever, nyre og milt kastes nanokapsel bindingsanalyser. I disse assays ble vevssnitt inkubert med S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapsler inneholdende syrisk hamster-IgG inngår i proteinskallet. Etter vasketrinn, ble delene behandlet for indirekte immundeteksjon av hamster-IgG. Dataene i figur 4a og figur S1 demonstrere binding av S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapsler til tumorvev, men ikke til lever, nyre eller milt. Ytterligere bevis på ligand-induserte nanokapsel vevsspesifisitet er vist i figur 4b og figur S2 hvori asialoorosomucoid (Asor) nanokapsler med syriske hamster-IgG som inngår i skallet ble brukt til å utføre nanokapsel bindingsanalyser. Asor er liganden for asialoglycoportein-reseptoren uttrykt i hepatocytter, og dataene viser at Asor nanokapsel binder spesifikt til lever og ikke tumorvev.
(a) Binding av S50-TBG-RNAi-CK2 til tumor men ikke lever, milt og nyre. Vevssnitt ble utsatt for immunfluorescens analyse for syriske hamsteren IgG etter inkubasjon med S50-TBG-RNAi-CK2. Scale bar 100 mikrometer. (B) Binding av Asor-DyDOTA til leveren, men ikke tumor, milt og nyre. Vev ble utsatt for immunfluorescens analyse for syriske hamsteren IgG etter inkubasjon med Asor-DyDOTA. Scale bar 100 mikrometer. (C) Analyse av tibia ben for tilstedeværelse av tumor og opptak av TBG-DyDOTA nanokapsel 24 timer etter i.p. injeksjon. Øvre paneler, svulst som inneholder tibia: H E flekken, B = bein, GP = vekst plate, M-S = marg-sinus, T = svulst; immunfluorescens påvisning av syrisk hamster IgG (grønn); direkte påvisning av Dy (rød); flette av grønt og rødt. Midtfelt, svulst som inneholder tibia: immunfluorescens påvisning av isotypekontrollantistoff for CK8 (grønn); immunfluorescens påvisning av CK8 (grønn); direkte påvisning av Dy (rød); flette av grønt og rødt. Lavere paneler, mock injisert tibia: immunfluorescens påvisning av isotypekontrollantistoff for CK8 (grønn); immunfluorescens påvisning av CK8 (grønn); direkte påvisning av Dy (rød); flette av grønt og rødt. DNA counterstain vises i blått. Scale barer 100 mikrometer. (D) Analyse av lever, milt og blod for inflammatorisk respons. Immun-kompetente mus ble injisert i.v. med 10 mg /kg av S50-TBG-RNAi-CK2 eller S50-TBG-sukker eller med likt volum kjøretøy og vev ble oppsamlet etter 24 timer. Lever, milt og thymus masse er presentert i forhold til musekroppsvekt (venstre akse). Interferon-γ ble målt i blod serum (høyre akse).
Å gi validering for S50-TBG nanokapsel homing til ondartede celler i mus, vi innledet prostatakreft xenografter i benet ved direkte injeksjon av PC3- LN4 celler i tibia. Kontralateral tibia i hver mus ble mock injisert. Når tumorvekst var tydelig, ble musene injisert med S50-TBG nanokapsler inneholdende dysprosium-DOTA-dekstran som lasten (S50-TBG-DyDOTA) og samlet opp etter 24 timer etter behandling. Tumor tilstedeværelse i ben ble verifisert ved H Vehicle n = 5). * P 0,05. (B) Andel mus med fjernmetastatiske svulster følgende s50-TBG-RNAi-CK2 behandlinger på 33 og 330 ng /kg sammenlignet med kjøretøy. Sammenligning bruker Fishers Exact Test p = 0,046. (C) Immunanalyse for CK2α og CK2α «respons i primære svulster. De øvre panelene representerer 10 mikrogram av atommatrise lysat med normalisering til Lamin B1. De nederste panelene representerer 20 mikrogram av cytosoliske lysat med normalisering til laktat dehydrogenase (LDH). (D) Protein og signale respons uttrykk analyse i representative lymfeknutesvulster. Lymfeknute tumor frosne snitt ble analysert ved indirekte immunofluorescens co-farging for AKT-1-fosfo-S129 (grønn) og NF-kB p65 (rød). DNA counterstain vises (blå). Scale bar 100 mikrometer (e) CK2α RISC spaltningsprodukter er til stede i S50-TBG-RNAi-CK2 behandlede svulster. Total RNA ble isolert fra tumorvev og anvendt for 5»-RACE ligering mediert å bestemme om RISC-formidlet kløyving av CK2α transkriptet funnet sted. Lanes 1 2, dag-10 kjøretøy behandlet flanke svulster; Lane 3, dag-fem S50-TBG-RNAi-CK2 behandlet flanke tumor; Lane 4, dag-6 S50-TBG-RNAi-CK2 behandlet flanke tumor; Lane 5, dag-10 S50-TBG-RNAi-CK2 behandlet flanke tumor; Lane 6, dag-10 S50-TBG-siCK2 behandlet flanke tumor; Lane 7, dag-6 S50-TBG-RNAi-CK2 behandlet orthotopic tumor; Lane 8, ingen cDNA vann kontroll; M, DNA størrelsesmarkører. Den anslåtte 242 bp RACE produktet er oppført på venstre, størrelsen på bp av DNA-standarder som vises på høyre side og behandling administrert angitt ovenfor banene.
For å evaluere CK2 målet respons, kvantitativ real -Tid revers-transkriptase PCR-analyse ble utført på tumor RNA. Dataene viste CK2α mRNA likevektsnivåer ble redusert med 11 til 14% og CK2α «ved 3-6% i forhold til kjøretøykontroller. Den begrenset reduksjon i CK2 mRNA-nivåer er sannsynlig på grunn av tidspunktet for prøvetakingen, dvs. 11 dager etter den andre behandlingen. Svulstvev ble lysert og fraksjonert i atommatrise og cytosol for immunoblot analyser. Representative resultater for tumorer fra hver gruppe er vist i figur 5c. Tettheten av båndene for CK2α og CK2α «proteinene ble beregnet for alle tumorer og i kjernefysiske matrise fraksjonsgjennomsnitts CK2α proteinnivåer på 1,06 ± 0,19 til 33 ng /kg og 0,68 ± 0,06 til 330 ng /kg, og gjennomsnittlig CK2α» protein nivåer 0,83 ± 0,17 og 0,43 ± 0,03 for 33 og 330 ng /kg, henholdsvis, ble observert i forhold til kontroller (fig. 5c, øvre paneler). På det høyeste dosenivå, både CK2α og CK2α «ble protein uttrykk nivåer tilsvarende redusert (CK2α 0,51 ± 0,12; CK2α» 0,39 ± 0,11). I cytosolic rommet i tillegg (Fig. 5c, nedre paneler)
lymfeknute tumorer ble analysert ved hjelp av indirekte immundeteksjon for CK2 relatert signale responsen i AKT og NF-kB veier. Sterkt redusert fosforylering av CK2 spesifikke AKT-1 S129 [37] Nettstedet ble observert etter behandling med enten 33 ng /kg eller 330 ng /kg S50-TBG-RNA-CK2 (Fig. 5d, øvre paneler). Tilsvarende er en dramatisk tap av NF-kB p65 total protein ble også oppdaget, spesielt på 330 ng /kg TBG-RNAi-CK2 (Fig. 5d, midtfelt).
RNA fra S50-TBG-RNAi- CK2 behandlede tumorer på dag 5, 6 og 10 fra et uavhengig forsøk ble analysert ved anvendelse av den modifiserte 5 «RACE teknikk for å kartlegge mulige spaltningsseter. RNA fra en S50-TBG-siCK2 behandlede tumor samt fra kontrolltumorer ble inkludert som sammenligningspreparater. Dag 5 og 6 svulster representerer 2 behandlinger av S50-TBG-RNAi-CK2 gitt på dag 1 og 4. Dag 10 svulster representerer 3 behandlinger av enten S50-TBG-RNAi-CK2 eller -siCK2 på dag 1, 4 og 7. dataene indikerer at CK2α RISC spaltningsproduktene blir detektert på dag 6 og 10 (fig. 5e). I motsetning til dyrkede celler ble CK2α «cleavage produktet ikke registreres. RACE produkter ble sekvensert for begge S50-TBG-RNAi-CK2 og -siCK2 behandlede tumorer, og spaltningssetet detektert var det samme som vist i fig. 2c. Redusert CK2α mRNA uttrykk på 10 til 20% i dag-6 og dag-10 svulster ble bekreftet.
Diskusjoner
Vi har tidligere foreslått løftet og tilpasning av denne svulsten-rettet nukleinsyre basert terapi rettet mot CK2 i både prostatakreft og i hode og hals plateepitelkarsinom [14], [15], [30], [38], [39]. Her har vi gitt data om beskyttelse av en oligomer last TBG nanoencapsulation, ondartet cellebinding eller opptak av TBG nanokapsler i dyrkede celler og i relevante prostata kreftformer hos mus, mulig og observert virkningsmekanismer for et enkelttrådet DNA /RNA kimære RNAi oligomer, og proof-of-concept pilot mus xenograft behandlingsdata.
i pilotbehandlingsstudie, observerte vi effekten ved bruk av S50-TBG-RNAi-CK2 i en
in vivo
PCa modell ved forholdsvis lav dosering på 330 ng /kg, noe som representerer bare to behandlinger. På dette dosenivået, effekter på primærtumor vekt og metastatisk tumordannelse og volum var tydelige og konkordant med nedsatt CK2 uttrykk og signalering. Våre to-dose fører sammenligne gunstig til en annen rapport av lavdose
in vivo
genet Slå hvor ikke-målrettede lipid-basert siRNA levering redusert target protein uttrykk etter en enkelt dose på 3 mg /kg [40] . I forhold til andre tumormålrettet siRNA leveringssystemer, oppnådde vår akutt behandling studien reduserte mål-protein ekspresjon og tumorvekten til mye lavere dosenivåer [5], [6]. Vi brukte et kjøretøy kontroll i denne studien å gi proof-of-concept som TBG-RNAi-CK2 kunne produsere en hensiktsmessig terapeutisk respons i xenograft prostata kreftsvulster. Deretter gjennomførte vi en egen studie designet for å identifisere en oligomer innkapslet i TBG som kan tjene en kontroll for den innkapslede terapeutiske RNAi. Denne undersøkelsen ble utført ved bruk av flanke tumorer for å legge til rette for direkte måling av tumorvolumet. Sammenligning av RNAi oligomerer i forhold til kjøretøykontroll førte til identifisering av en egnet kontroll i PCA og sammenlignings Resultatene viste at både RNAi og kjøretøykontroller ga analoge resultater (dvs. svulst volumendringer fullt lapper). Dermed er resultatene vist i fig. 5c gi proof-of-concept som TBG-RNAi-CK2 er i stand til å indusere tumor celledød
in vivo
som kan henføres til den CK2 målet. Videre, PC3-LN4 celler som ble brukt i disse studiene er en modell for PTEN-null, androgenreseptoren (AR) ikke-uttrykkende, og androgen-uavhengig metastatisk PCa. Mens AR signale anses viktig for PCa celleoverlevelse, uavhengig av kastrering resistent fenotype [41], [42], de PC3-LN4 xenografttumorer brukt for disse studiene servert å gi proof-of-concept data.
anvendelse av enkelt-trådede oligomerer for RNAi-aktivitet i dyrkede celler og hos mus er tidligere dokumentert [43], [44]. Videre ble det vist at erstatning av DNA-rester til 5′-enden av føringsstrengen (dvs. soneposisjoner frø 2-8) frembringer et RNAi-molekyl med genet Slå aktivitet og minimale off-target-effekter; mens RNA-rester i 3′-enden av føringsstrengen er avgjørende [45]. Bruk av vår DNA /RNA kimære enkelt-trådet RNAi-CK2 oligomer kombinerer effektiviteten av å levere bare førings tråd med den potensielle reduksjon av off-target-effekter på grunn av fravær av en passasjer tråd. Vi demonstrert av
in vitro
eksperimenter som både antisense- og siRNA støydempere mekanismer ble indusert av RNAi-CK2; videre, etter bruk av S50-TBG-RNAi-CK2 å behandle xenografttumorer, viste vi at RISC spaltet CK2α mRNA ble gjenfunnet 2 til 3 dager etter behandling. Vi oppdaget ikke CK2α «cleavage produktet i behandlede tumorer, selv om CK2α» protein nivåer redusert. Dette tyder på at de RNAi-CK2 oligomerer som inneholder en mismatch til menneskelig CK2α «mRNA og 2 uoverensstemmelser til mus stromal celle CK2α» mRNA kan først og fremst å indusere RNase H- snarere enn RISC-mediert spalting av denne transkripsjon
in vivo
. Denne oppfatningen støttes av vesentlig redusert overflod av CK2α «cleavage produktet observert med enten siRNA-CK2 eller RNAi-CK2 i cellekulturstudier. Alternativt kan RNAi-CK2 blokkere oversettelse av CK2α eller CK2α «transkripsjoner til protein. For Fig.
