Abstract
decorin, et multifunksjonelt liten leucin rike ekstracellulære matrix proteoglykan, har vist seg å ha potent antitumoraktivitet. Det er imidlertid en viss usikkerhet om forskjellige kreftceller uttrykker decorin i tillegg til ikke-maligne stromale celler. I denne studien avklart vi decorin uttrykk av menneskelige blærekreftceller både
in vivo Hotell og
in vitro
. I tillegg er effekten av adenovirus-mediert decorin ekspresjon på humane blærecancerceller
in vitro
ble undersøkt. Vi først demonstrert ved hjelp av offentlig tilgjengelige GeneSapiens databank som decorin genuttrykk er til stede i både normale og ondartede menneskelige blæren vev. Men da vi søkte in situ hybridisering med digoxigeninmerket RNA-prober for decorin på menneske blære carcinoma vevsprøver avledet fra en stor radikal cystektomi pasient kohort (n = 199), vi entydig vist at invasive og ikke-invasive blære carcinoma celler helt mangler decorin mRNA. Kreftcellene var også negativ for decorin immunoreaktivitets. I stedet ble decorin uttrykk lokalisert utelukkende til de opprinnelige ikke-maligne stromale områder av blærevevet. I samsvar med de ovennevnte resultater, humane blærecancerceller
in vitro
var også negative for decorin uttrykk som vist ved RT-qPCR-analyser. Mangelen på decorin ekspresjon av blærecancerceller ble vist ikke å være på grunn av metylering av den proksimale promoter regionen av decorin genet. Når blærecancerceller ble transfektert med en decorin adenoviral vektor, ble deres spredning betydelig redusert. Avslutningsvis har vi vist at menneskeblærekreftceller er helt blottet for decorin uttrykk. Vi har også vist at adenovirus-mediert decorin genet transduksjon av humane blærecancercellelinjer markert inhiberer deres proliferasjon. Dermed decorin genet levering tilbyr nye potensielle terapeutiske verktøy i uroteliale maligniteter
Citation. Sainio A, Nyman M, Lund R, Vuorikoski S, Boström P, Laato M, et al. (2013) Mangel på decorin Expression av Human blærekreft celler inneholder nye verktøy i terapi av uroteliale maligniteter. PLoS ONE 8 (10): e76190. doi: 10,1371 /journal.pone.0076190
Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, Canada
mottatt: 13. juni 2013, Godkjent: 23 august 2013; Publisert: 11 oktober 2013
Copyright: © 2013 Sainio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk dette studien ble støttet av Medical Research Fund (EVO) fra Turku universitetssykehus, Kreft Foundations of South-Western Finland, Foundation of Ida Montin, Oskar Öflunds Stiftelse, Den finske Cultural Foundation /Varsinais-Suomi Regional Fund, Biocenter Finland, Academy of Finland, og Universitetet i Turku. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i dag forstår vi at ekstracellulære matrix (ECM) makromolekyler ikke bare danner en inert plass å fylle mikromiljøet rundt cellene, men fungere som en dynamisk struktur genererer signaler for å styre celle atferd [1]. Faktisk, ECM og dets komponenter, inkludert en liten leucine-rik proteoglykan decorin [2], er [3] nå kjent for å spille en sentral rolle i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser via deres evne til å regulere viktige cellulære hendelser som vedheft, migrasjon, spredning og apoptose [4].
Små leucine-rik proteoglykaner (SLRPs) danner et gen familie av fem underklasser som består av 18 medlemmer, hvorav decorin, prototypen medlem av familien, og dens nære slektning, biglycan [5] – [6]. Når det gjelder decorin, flere spleisevarianter (A1, A2, B-E) har blitt identifisert på mRNA-nivå [7]. Decorin er normalt sammensatt av en kjerne glykoprotein med en molekylvekt på omtrent 42 kDa, og et enkelt chondroitin /dermatansulfat-sidekjeden. I sin kjerne glykoprotein er det 10 leucine-rich gjentar (LRR), hver gjentagelse bestående av 24 aminosyrer, og som omfatter en α-heliks og et β-sving [2], [8]. Decorińs strukturelle trekk gjør det mulig å kommunisere med en rekke andre ECM-proteiner, cytokiner, vekstfaktorer og deres reseptorer så som epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), MET (mesenchymale-epitelial overgang) reseptoren, dvs. reseptoren for hepatocytt vekstfaktor insulin-lignende vekstfaktor-reseptor i (IGF-IR) og medlemmer av ErbB-reseptor familie [8] – [10]. Via disse samhandlingene decorin har allsidige handlinger i både helse og sykdom
Rollen decorin i kreft progresjon og terapeutisk potensial som en svulst undertrykke antimetastatic agent har vært fokus for mange studier [10] -. [11] . I utgangspunktet decorin ble knyttet til kreft da det ble oppdaget at decorin /p53 dobbelt knockout mus utviklet svulster raskere enn kontroller [10]. Resultatene indikerte at avbrytelse av decorin genet ikke fører til spontan utvikling av svulster, men mangel på decorin er ettergivende for tumorgenesen [10]. har blitt funnet ekspresjon av decorin i senere studier for å bli redusert i flere kreftformer, slik som kolon [12], prostata [13], og eggstokk-kreft [14]. Videre er det i brystkreft lav ekspresjon av decorin har vist seg å være forbundet med en kortere tid til progresjon og en dårligere overlevelsen [15]. På den annen side har levering av decorin gen eller protein er vist å føre til veksthemming av forskjellige krefttyper [16] – [18] gjennom forskjellige virkningsmekanismer som for eksempel via binding til vekstfaktor-reseptorer som er nevnt ovenfor, og modulering av deres aktivitet [11 ]. Nylig har vi vist at forskjellige typer av humane brystcancerceller fullstendig mangler decorin mRNA [19]. Vi har også vist at adhesjonen, proliferasjon og apoptose av MCF-7 humane brystcancerceller kan bli påvirket av decorin transduksjon [19].
I blærekreft, som er 9
th mest vanlige kreft verdensomspennende [20], har tidligere vært vist diagnose ekspresjonen av decorin til å bli redusert [21] – [24]. Som decorin fungerer som en naturlig antagonist for IGF-IR i tumorer, kan dens redusert ekspresjon bidra til økt IGF-IR-aktivitet, og dermed fører til utviklingen av IGF-IR-avhengige cancere gjennom forbedret cellulær motilitet og invasjon [23] – [24 ]. Det er også mulig at den antitumoreffekten av decorin på blærekreft medieres via decorin-assosierte tumorsuppressorgen mitostatin, hvis aktivitet er redusert ved avansert blærekreft å lette vekst og spredning av neoplastiske celler [25].
Selv flere studier har undersøkt decorin uttrykk i ulike krefttyper, inkludert blærekreft, det er en viss usikkerhet om ulike kreftceller uttrykker det eller ikke. I denne studien undersøkte vi uttrykket av decorin av menneskelige blærekreftceller både
in vivo Hotell og
in vitro
. Vi undersøkte også effekten av decorin genet transduksjon på spredning av menneskelige blærekreftceller
in vitro
.
Materialer og metoder
GeneSapiens database
brukte GeneSapiens database for å evaluere tidligere publiserte resultater om decorin uttrykk i normale og maligne menneskelig vev [26]. Denne databasen (https://www.genesapiens.org/) dekker de relative genuttrykksmønster for 17 330 gener på tvers av alle de 9783 kommenterte normale og patologiske menneskelige vevsprøver fra offentlig tilgjengelige Affymetrix microarray eksperimenter. I GeneSapiens database er det informasjon om 35 forskjellige epiteliale karsinom
in vivo
. For denne studien brukte vi decorin ekspresjon av 174 prøver som representerer human blærekreft og sammenlignes med data som er utledet fra 20 normale humane blære vevsprøver.
Tumorprøver
Ethical godkjenning for bruk av den kliniske materialet i denne studien ble gitt av etikkomiteen Hospital District of Egentliga Finland. Etikkomiteen fravikes behovet for skriftlig informert samtykke. Blærekreft vevsprøver ble avledet fra 199 radikale cystectomy pasienter operert i 1985-2005 i Turku universitetssykehus, Turku, Finland. De patologiske kjennetegn ved pasientene er presentert i tabell 1. Tissue mikromatriser (TMA) ble konstruert ved å skaffe 3 representative kjerner fra giver radikale cystektomi blokker. Vi brukte 5 mikrometer påfølgende seksjoner fra TMA blokker for hematoxylin og eosin (HE) farging, in situ hybridisering (ISH) og immunhistokjemi (IHC). Bruken av prøvene hadde godkjenning av den lokale etiske komiteen.
decorin in situ hybridisering
Vi utførte decorin ISH på alle TMA seksjoner ved sondering prøvene med menneskelig decorin anti og forstand enkelt-trådet RNA-riboprober som tidligere er beskrevet i detalj [27].
Immunhistokjemi
IHC analyser ble utført for decorin med et kanin polyklonalt antistoff (H-80, Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, fortynning 1:400) og for biglycan med en geitepolyklonalt antistoff (L-15, Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, fortynning 1:200) på alle TMA seksjoner som tidligere beskrevet [27]. Farging for Ki-67 ble utført som beskrevet under punktet for adenovirus-mediert decorin transduksjon.
RT-qPCR for decorin
Tre menneskelige kreft i urinblæren cellelinjer RT-4, 5637, og T24 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). Disse cellelinjer ble brukt for RT-qPCR-analyse for decorin. Alle cellelinjene ble holdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; Gibco, Paisley, Skottland) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Biochrom AG, Berlin, Tyskland), penicillin (100 IU /ml) og streptomycin (100 ug /ml) (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA), og dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2. Cellene ble trypsinert, slått sammen, og RNA ble ekstrahert ved hjelp NucleoSpin RNA II -kit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.
RNA-konsentrasjoner som kreftcellelinje ekstraksjoner ble bestemt ved hjelp av et Nanodrop spektrofotometer (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) og integriteten av RNA ble bekreftet med agarosegelelektroforese. En mikrogram av RNA ble DNase behandlet med RQ1 RNase-Free DNase (Promega, Madison, WI, USA) og revers transkribert til cDNA ved hjelp av M-MLV revers transkriptase og Oligo (dT) 15 primer (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. RT-qPCR ble utført som tidligere beskrevet [19].
DNA metylering status av decorin promoter
Total DNA ble ekstrahert fra urinblærecancercellelinjer (RT-4, 5637 og T24) ved hjelp QIAamp® genomisk DNA kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) etter produsentens protokoll. Metylert DNA ble anriket med to forskjellige analyser, først med den automatiserte MethylCap og deretter med den automatiserte MeDIP analysen ved hjelp av epigenetisk prøvepreparering robot SX-8G IP-Star ® (Diagenode). I korthet, den genomiske DNA ble fragmentert med første Covaris S2 sonikator. De metylerte DNA-fragmenter ble anriket med metyl Binding Protein domene (MBD) affinitet basert MethylCap assay eller 5-metylcytosin antistoffbaserte MeDIP immunpresipitering-analyse som beskrevet av produsenten (Diagenode). For å undersøke den metylering status av decorin genpromoter, ble metylerte DNA-fragmenter ble renset (MinElute PCR rensing kit, Qiagen) og underkastet kvantitativ PCR (SybrGreenER qPCR Supermix Universal, Invitrogen) ved å bruke 7900HT Fast RT-PCR-system (Applied Biosystems ). Hver prøve ble kjørt i fire paralleller og tre promoter-regioner som dekker ulike isoformer decorin (A1, A2, B-E) ble undersøkt. QPCR oligoer anvendt i RT-PCR-analyse var: DCN_A1_F 5′- CAG GTG TGG AAA GGA GGA GG 3 «; DCN_A1_R 5’GTG TCA GCC GGA TTG TGT TC -3 «; DCN_A2_F 5’AGT CCT CAC CTG AAC CCT GA -3 «; DCN_A2_R 5’GAA AGC AGC ATC TTG CCT GG -3 «; DCN_B-E _F 5’CTG CAT CCC ACT CAC CCA AA -3 «; DCN_B-E_R 5’TTC CTG ATG ACC GCG ACT TC -3 «. Kontroll loci forbundet med GAPDH og TSH2B gene promotere (Diagenode) ble anvendt som negative og positive kontroller for DNA-metylering, respektivt. Gjenvinningen% av det metylerte DNA ble beregnet med formelen: gjenvinning% input = 2? ((Ct inngang-log inngang fortynning) – CtMeDIP) * 100
Adenovirus-mediert decorin transduksjon
For de transduksjon eksperimenter, en rekombinant replikering-mangel adenovirusvektor DCN-pxc1c-en var. brukt som tidligere beskrevet [19]. Denne vektoren havner den humane decorin (DCN) cDNA under kontroll av cytomegalovirus (CMV) promoter. For fremstilling av vektoren, ble full lengde humant decorin cDNA [28] inn i pGEM plasmider klonet og satt inn i plasmid pendel pxcJL-1. Virusene ble utarbeidet av kotransfektering HEK293-celler med ryggen bein plasmid pBHG10. Som en kontroll vektor RAdlacZ, som havner på E. coli β-galaktosidase-genet (lacZ) under kontroll av CMV-IE-promoter ble anvendt. Denne vektor ble kjøpt fra Virus Vector Facility, Senter for Bioteknologi, Universitetet i Turku, Turku, Finland. Humane blærecancercellelinjer RT4 og T24 ble anvendt for transduksjon i henhold til en protokoll som tidligere beskrevet [19] med mindre modifikasjoner. Kort sagt ble kreftceller opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 IU /ml), og streptomycin (100 ug /ml) og dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2. Cellene ble sådd ut på en 8-brønn kammer lysbilde (Thermo Scientific, Rochester, NY, USA), 30 000 celler per brønn. Den neste dag ble cellene transdusert med 10, 100 og 1000 pfu /celle av DCN-pxc1c-1 eller RAdlacZ i DMEM inneholdende 10% FBS. 24 timer etter transduksjon, ble mediet fjernet og erstattet med friskt en. Cellene ble deretter dyrket inntil neste dag, hvoretter de ble fiksert med 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS). Til slutt ble spredning indeks over decorin omformet cellelinjer bestemmes med en Ki-67 kanin monoklonalt antistoff (30-9, Ventana Medical Systems /Roche Diagnostics, Tucson, Arizona, fortynning 1:200) [19]. Ki-67-positive celler ble tellet i ti forskjellige synsfelt (forstørrelse 10x) i decorin og lacZ-transfekterte cellekulturer samt ubehandlede kontrollkulturer. I tillegg ble antallet av Ki-67 positive celler /100 celler per felt i ti forskjellige felter telles for å utelukke muligheten for at den endrede celletallet i forskjellige kulturer ville ha forårsaket en forvrengning i resultatene sprednings. Effekten av decorin transduksjon på celletall ble også målt ved anvendelse av et hemocytometer. I korthet ble cellene sådd ut på en 12-brønns plate (Thermo Scientific, Rochester, NY, USA), 170 000 celler per brønn. Transfeksjon ble utført som beskrevet ovenfor, og cellene ble tellet 24 timer etter bytte av medium med ny en. Celle nummer i hver behandling (Ad-DCN, Ad-LacZ Kontroll og negativ kontroll) ble regnet som tre gjentak.
Statistisk analyse
Uparet studentens
t
test ble anvendt i statistiske analyser.
p
verdier. 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
Relativ decorin genuttrykk i human blærekreft basert på GeneSapiens i silico transcriptomics data
GeneSapiens database avdekket at decorin uttrykkes på merkede nivåer i nesten alle ulike typer av humant epitel karsinom vevsprøver
in vivo plakater (data ikke vist) [26]. Dette var også tilfellet for human blærekreft, selv om det i ondartet blærevevet decorin ekspresjon ble redusert sammenlignet med normalt vev blære (figur 1).
Box plot-analyse av relative decorin genekspresjon i vevsprøver for normalt og ondartet humant urinblæren ved hjelp GeneSapiens
i silico
database (https://www.genesapiens.org/). De kontinuerlige linjer i boksplottet bildene representerer median uttrykk nivået decorin i blæren vev. Legg merke til at relativ decorin ekspresjon er markert i både normale og ondartede blære vevsprøver, og at den relative ekspresjon av decorin er redusert i blærekreft i forhold til det normale blærevevet. Avkortet barer i boksen blot bildene viser standardavvik av resultater inngår i databanken.
Lokalisering av decorin mRNA og immunoreaktivitets i maligne menneskelig blæren vevsprøver
ISH analyser med DIG -merkede RNA prober for decorin tydelig vist at invasiv blære-carcinomceller var helt blottet for decorin mRNA i alle blærekreft vevsprøver (figur 2). Det samme funn var også tilfelle for prøvene som representerer ikke-invasiv in situ human blærekreft (figur 3). I invasive og in situ blære karsinom, ble alle detektert decorin mRNA funnet å være lokalisert utelukkende til opprinnelige, ikke-maligne stromal områder (figur 2 og 3). IHC analyser av prøvene bekreftet at decorin immunoreaktivitets bodde i de samme områdene med decorin mRNA (Figur 2 og 3). I motsetning til dette, IHC analyse av prøvene for en annen liten leucin-rik proteoglycan, nemlig biglycan, avslørte at decorin negative områder i blærekreft vev var positive for biglycan immunoreaktivitet (figur 4). Dette funnet var sant for in situ blærekreft vevsprøver også (data ikke vist).
Analyser ble utført på hele studiepopulasjonen og representative bilder vises. Stjernene viser områder befolket utelukkende av blæren kreftceller. Paneler A, D, G er representative bilder av seriesnitt av samme vevsprøve som representerer invasiv human blærekreft. A. HE farging. D. ISH for decorin. Positiv reaksjon DIG i ISH som angir lokaliseringen decorin mRNA kan sees i purpur. G. IHC for decorin. Brun farge indikerer decorin positive ikke-ondartede stromal celleområder. Deler av normal (B, E, H) og blære vevsområder (asterisker) ondartet (C, F, I) er vist forstørret under. Legg merke til at invasive humane blære karsinom celler er fullstendig blottet for både decorin mRNA og decorin immunreaktivitet og som decorin ekspresjon ligger utelukkende i de områder av originalen, ikke-ondartet vev stroma. I figurene A, D og G, skala bar 50 mikrometer, og i B, C, E, F, H, og jeg, skala bar 20 mikrometer.
Analyser ble utført på hele studiet befolkning og representative bilder vises. Stjernene viser områder befolket utelukkende av blæren kreftceller. Paneler A, D, G er representative bilder av seriesnitt av samme vevsprøve som representerer in situ human blærekreft. Piler peker til grensene av in situ karsinom og stjernene indikerer områder befolket av blæren kreftceller bare. A. HE farging. D. ISH for decorin. Positiv reaksjon DIG i ISH som angir lokaliseringen decorin mRNA kan sees i purpur. G. IHC for decorin. Brun farge indikerer decorin positive ikke-ondartede stromal celleområder. Deler av normal (B, E, H) og blære vevsområder (asterisker) ondartet (C, F, I) er vist forstørret under. Legg merke til at in situ-humane blære karsinom celler er fullstendig blottet for både decorin mRNA og decorin immunreaktivitet og som decorin ekspresjon ligger utelukkende i de områder av originalen, ikke-ondartet vev stroma. I figurene A, D og G, skala bar 50 mikrometer, og i B, C, E, F, H, og jeg, skala bar 20 mikrometer.
Pilene viser eksempler på maligne blære celler . A. Representant bilde av HE farging av blærekreft vev. IHC for decorin (B) og biglycan (C) av den samme prøven som i A. Scale bar i A-C, 20 mikrometer.
decorin uttrykk i humane blærekreft cellelinjer
i vitro
ovenfor
in vivo
resultatene viste at ondartede celler i både invasive og ikke-invasive human blærekreft vevsprøver ikke uttrykke decorin. Derfor, ved hjelp av RT-qPCR vi neste undersøkt om cellelinjer som representerer ulike grader av menneskelig blærekreft express decorin. Resultatene viste at ingen av urinblærecancercellelinjer, inkludert RT-4 (opprinnelig klasse I urothelial kreft), 5637 (klasse II) og T24 (grad III) uttrykt decorin. For å belyse, om mangelen på decorin ekspresjon var på grunn av DNA metylering av decorin genpromoter, vi brukte to forskjellige analyser, MeDIP og MethylCap, etterfulgt av kvantitativ RT-PCR for å undersøke metylering status for de ulike decorin genpromoter isoformene hentet fra kreftcellelinjer. Basert på disse analysene var vi ikke i stand til å oppdage DNA metylering i decorin genet arrangøren i noen av blærekreftcellelinjer undersøkt (figur 5). Kontrollen promoteren til genet TSH2B ble metylert og GAPDH ble metylert ikke som forventet.
Mangel på decorin ekspresjon i humane blærecancercellelinjer er ikke på grunn av DNA-metylering av decorin genpromoter. Metylering status for decorin isoformer (DCN A1, A2, B-E) i blærekreftcellelinjer ble studert med to forskjellige automatiserte analyser, MethylCap og MeDIP. I figuren er kvantitative RT-PCR-resultater for MethylCap analyse som viser% av DNA-metylering anrikning i forhold til inngangs DNA. I tillegg til decorin gen-promotorer, er resultatene vist for en positiv kontroll TSH2B og negativ kontroll GAPDH.
Virkning av adenovirus-mediert transduksjon decorin på proliferasjonen av humane blærecancercellelinjene
in vitro
Både ISH resultater og RT-qPCR analyser viste tydelig at menneskelig blære kreftceller ikke er i stand til å uttrykke decorin enten
in vivo
eller
in vitro
. Neste vi undersøkt effekten av målrettet decorin transduksjon på spredning av menneskelige blærekreftceller
in vitro
. Vi brukte humane blærecancercellelinjer RT4 og T24 og en decorin adenoviral vektor for dette formål. Cellene ble transdusert med en titer på 10 til 1000 pfu /celle av adenoviral vektor og en viruskonsentrasjon på 1000 pfu /celle ble valgt for videre eksperimenter. Resultatene viste at adenovirus-mediert transduksjon decorin redusert spredning indeks på kreftceller med statistisk signifikans (figur 6). Også den celletallet etter decorin transduksjon ble signifikant redusert (data ikke vist).
decorin genet transduksjon reduserer spredning indeksen for T24 blærekreftceller. A. Blære kreft celler transduced med decorin adenovirusvektor (Ad-DCN). B. Transduksjon av cellene med LacZ vektor (Ad-LacZ Control). C. Ikke-omsatte kreftceller (negativ kontroll). Brun farge angir Ki-67 positive celler (eksempler er angitt ved piler). Målestokken i A-C, 50 um. Avkortet barer på toppen av søylene i D indikerer standardavvik. *** P 0,001, Student
t
test
Diskusjoner
Selv om decorińs rolle i å hemme tumorvekst er anerkjent i dag [18], opprinnelsen til. decorin ekspresjon i kreftformer har vært delvis løst [12], [13], [23], [29]. Spesielt har det vært en viss usikkerhet om ulike kreftceller uttrykker decorin i tillegg til ikke-maligne stromale celler. Nylig har vi vist at i ulike former av human brystkreft, er decorin ikke uttrykkes av cancerceller [19]. Når det gjelder blærevevet, har ekspresjonen av decorin vist seg å være fremtredende i subepiteliale lag av murine urinblæren [30]. Det er også blitt vist med IHC-analyse, at decorin immunreaktivitet blir markert redusert i den tumor-stroma av både lave og høye klasse blæretumorer [23]. I denne studien har vi undersøkt decorin uttrykk av menneskelige blærekreftceller både
in vivo Hotell og
in vitro
. Først vurderte vi tidligere data om decorin genuttrykk i forskjellige krefttyper med spesiell referanse til blærekreft utnytte offentlig tilgjengelig GeneSapiens databank [26]. I likhet med tidligere studier [21] – [22], decorin ekspresjon ble funnet å være redusert i ondartede humane blære vevsprøver sammenlignet med normale vev blære. Deretter lokaliserte vi decorin mRNA og decorin immunoreaktivitets i vår egen omfattende radikal cystektomi pasient kohort av menneskelige blærekreft vevsprøver ved hjelp av ISH med DIG-merkede decorin prober og polyklonale decorin antistoff hhv. Som vi har vist i menneskelig brystkreft [19], disse analysene klart demonstrert at også i menneskelig blærekreft alle områder og holmer befolket av ondartede celler var helt blottet for decorin mRNA og immunoreaktivitets. I stedet uttrykk for decorin bodde utelukkende i de områdene av originale, ikke-ondartet blære stroma. Dermed blir GeneSapiens resultater om decorin ekspresjon i humane blærecancerprøver gjenspeiler kvaliteten av det opprinnelige vev prøver inkludert i databasen, det vil si, i tillegg til kreftceller prøvene inneholde forskjellige mengder av stromale vev.
in vivo
resultatene viste at menneskelig blære kreft celler ikke uttrykker decorin. Det samme funnet ble påvist å være også for human blære kreft cellelinjer. Fordi metylering av decorin genet har tidligere vist seg å regulere decorin uttrykk i tykktarmskreft [29], bestemte vi oss for å undersøke om dette epigenetisk mekanisme påvirker decorin uttrykk i menneskelige blæren kreftceller også. Men våre resultater udiskutabelt vist at metylering av decorin genet arrangøren ikke spiller en rolle i menneskelig blærekreft. Dermed mekanismene blokkerer decorin uttrykk av menneskelige blærekreftceller gjenstår å bli belyst.
Studier utnytte decorin transduksjon har tidligere vært gjennomført f.eks med brystcancerceller, og resultatene er vist både redusert primær tumorvekst og forebyggelse av metastase [17], [31]. Videre har systemisk levering av decorin proteinkjerne til brystkarsinomceller xenotransplantater blitt rapportert til å modulere ekspresjon av flere hundre stromale gener som skaper en ugunstig tumor mikromiljø for tumorprogresjon og metastase [32]. I tillegg har undertrykkelse av tumourigenicity ved hjelp av decorin transduksjon også blitt demonstrert med colon og plateepitel carcinom tumorxenografter [16]. Nylig har vi vist at adenovirus-mediert transduksjon av decorin til decorin negative brystkreftceller (MCF-7) redusert proliferasjon og øke apoptose av celler [19]. I denne studien ble humane blærecancercellelinjer RT4 (Gradus I) og T24 (Gradus III) transdusert med en decorin adenoviral vektor som resulterte i en identisk reduksjon i celleformering, identisk med MCF-7 celler. De foran nevnte resultater sammen med den observerte mangel på decorin ekspresjon av kreftceller gir en interessant mulighet for å undersøke effekten av decorin på blærekreft celle oppførsel som et terapeutisk verktøy. Dette kan gjøres
in vivo
f.eks med intravesikal terapi, der cancerous blære hulen skylles med decorin adenovirus som inneholder væske [33] – [34]
Så langt vi kjenner til, er den første til å nøyaktig lokalisere decorin mRNA ved denne undersøkelsen. cellenivå i human blærekreft
in vivo
. Som vi screenet prøvene for immunoreaktivitets for en annen, svært lik SLRP til decorin, nemlig biglycan, fant vi at tumor områder negative for decorin var positive for biglycan immunoreaktivitets. Dette tyder på at selv om decorin og biglycan representerer svært lignende molekyler som også deler samme funksjoner inkludert deres evne til å binde TGF-β [35] sitt uttrykk i vev er ikke identisk. Tidligere har differensial decorin og biglycan uttrykksmønstre blitt funnet f.eks i å utvikle skjelett- og ikke-skjelettlidelser vev [36], under hornhinnen utvikling [37] og patologiske situasjoner som fibrose av delvis blære utsalgsstedet hindringer [38]. Videre biglycan også gradvis vist seg å virke som et nøkkel-molekyl i reguleringen av immunsystemet [38]. Basert på våre resultater, er biglycan uttrykk påvist i humane blærekreftceller som mangler decorin uttrykk. Den endelige rolle biglycan uttrykk i progresjon eller begrensning av tumorgenesen vil kreve videre studier.
Konklusjoner
I konklusjonen i denne studien har vi vist at menneskelig blære kreft celler ikke uttrykker decorin enten
in vivo
eller
in vitro
, og at decorin uttrykk i ondartet menneskelig blæren vev ligger bare i de områdene av originale, ikke-ondartet stroma. Vi har også vist at mangel på decorin ekspresjon av humane blærecancerceller er ikke på grunn av metylering av de proksimale promoter-regionene av decorin genet. Videre har vi vist at transduksjon av dyrkede humane blærecancerceller med en decorin adenoviral vektor fører til en signifikant inhibering i proliferasjonen av cellene
in vitro
. Til sammen våre resultater tyder på at mangelen på decorin uttrykk ved blærekreftceller tilbyr en mulighet for å bruke decorin basert terapi i menneskelige urothelial maligniteter.
Takk
Vi takker Bogata Fezazi og finsk microarray og sekvense~~POS=TRUNC ved Turku Centre for bioteknologi, Turku, Finland for teknisk support. Eksperten teknisk assistanse av Sinikka Kollanus er takknemlig erkjent. Forfatterne uttrykke sin takknemlighet også til Jaakko Liippo for å hjelpe med å fotografere.
