Abstract
Et kjennetegn ved svulstens mikromiljø er oksygen svingninger, noe som resulterer fra hyper-spredning og unormal metabolisme av tumorceller samt uorganisert neo-blodkar. Reoksygenering av tumorer kan indusere oksidativt stress, noe som fører til DNA-skade og genomiske ustabilitet. Selv om de cellulære responser til hypoksi er godt kjent, er lite kjent om dynamisk respons på Reoksygeneringen. For å undersøke de transkripsjonelle responser hos tumor tilpasning til reoksygenering, ble brystkreft MCF-7-celler dyrket under 0,5% oksygen i 24 timer fulgt av 24 timer av reoksygenering i normoxia. Cellene ble høstet på 0, 1, 4, 8, 12 og 24 timer i løpet av reoksygenering. Den transkripsjonelle profilen av MCF-7-celler ved reoksygenering ble undersøkt ved hjelp av Illumina Menneske-6 v3 BeadChips. Vi identifiserte 127 differensielt uttrykte gener, hvorav 53,1% var oppregulert og 46,9% ble nedregulert på Reoksygeneringen. Pathway analyse viste at den HIF-1-alfa-transkripsjonsfaktor nettverk og validert mål for C-MYC transkripsjonen aktivering ble betydelig anriket med disse differensielt uttrykte gener. Blant disse genene, ble en undergruppe av rente gener videre validert av kvantitativ revers-transkripsjon PCR. Spesielt menneske N-MYC nedregulert gen 1 (
NDRG1
) ble sterkt undertrykt på Reoksygeneringen. NDRG1 er forbundet med en rekke spennings og cellevekstregulerende betingelser. For å avgjøre om
NDRG1
spiller en rolle i Reoksygeneringen ble NDRG1 protein overexpressed i MCF-7 celler. Ved Reoksygeneringen, overekspresjon av
NDRG1
betydelig hemmet celle migrasjon. Våre resultater viste dynamikken i genuttrykk i MCF-7 celler ved Reoksygeneringen og viste at
NDRG1
er involvert i tumor tilpasning til Reoksygeneringen
Citation. Lai LC, Su YY, Chen KC , Tsai MH, Sher YP, Lu TP, et al. (2011) nedregulering av
NDRG1
Fremmer Migrasjon av kreftceller under Reoksygeneringen. PLoS ONE 6 (8): e24375. doi: 10,1371 /journal.pone.0024375
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 7 juli 2011; Godkjent: 05.08.2011; Publisert: 30 august 2011
Copyright: © 2011 Lai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet delvis med tilskudd fra Kina Medical University, Taiwan (gi ingen 97F008-119,. 99F008-308, https://english.cmu.edu.tw/) og Center of Genomic Medicine, National Taiwan University (gi no . 99R81400; https://www.cgm.ntu.edu.tw/chinese2007/eng_index.asp), og National Science Council (Grant No. 98-2320-B-002-044-My3, http: //web1. nsc.gov.tw/mp.aspx?mp=7). Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
svulstpopulasjonene må overvinne forskjellige microenvironmental barrierer før metastasizing til andre organer. Invasiv kreft, derfor kan bli sett på som en serie av tilpasninger i fenotype til sine microenvironments. Alle tumor-mikromiljøer er karakterisert ved næringsmangel, lav pH, og hypoksi [1]. Disse endringene var knyttet til perfusjon underskudd i solide tumorer, som kom fra hurtig tumorvekst og dypt uorganisert blodkar [2]. Det har blitt foreslått at svulsten mikromiljøet er et unikt miljø for tumorprogresjon, noe som krever genetiske tilpasninger i kreftceller for videre overlevelse og proliferasjon. Celle påkjenninger forårsaket av mikromiljøet, spesielt hypoksi [3], [4] og Reoksygeneringen [5], [6], kan føre til at disse genetiske endringer.
Regioner av hypoksi er en vanlig funksjon i solide tumorer. Oksygen er en begrensende faktor på grunn av ubalansen mellom O
2 levering og forbruk [7]. O
2-mangel skyldes utilstrekkelig vasculatures og oksygenmangel i påfølgende cellelag distal til årehulrommet; samtidig, er det en økning i O
2-forbruk på grunn av den høye metabolske rate av tumorceller. Mange studier har rapportert at hypoksiske svulster var mer ondartet og motstandsdyktig mot terapi, og dermed hadde en dårligere prognose [8]. Dette fenomenet har blitt vist i mange tumortyper, [9], [10].
Videre er oksygenkonsentrasjonen i et hypoksisk region er svært variabel. Ettersom tumor vasculatures er svært ineffektiv og ustabil, røde blodceller fluks til de hypoksiske områder, noe som resulterer i reperfusjon eller reoksygenering [11]. Reoksygeneringen ikke bare øker oksygentilførsel, men også induserer oksidativt stress i cellene. Dette oksidativt stress kan forårsake skade på cellulære makromolekyler og føre til økt genomisk ustabilitet [12]. Hvis kreftcellene overlever etter eksponering for hypoksi /Reoksygeneringen fornærmelser, kan de vise en økning i kreft [13], DNA over-forsterkning [14], resistens [15], og metastatisk potensiale [16].
Cellular tilpasning til hypoksi er godt dokumentert, men lite er kjent om adaptive mekanismer til Reoksygeneringen. Derfor brukte vi genom-wide uttrykk mikromatriser å undersøke dynamikken i transkripsjonen profilering under Reoksygeneringen i MCF-7 brystkreft celler. Våre microarray Resultatene viste at N-MYC nedregulert gen 1 (
NDRG1
) hadde maksimal respons etter Reoksygeneringen. Derfor fokuserte vi på å undersøke sin funksjonelle rolle i Reoksygeneringen. De funksjonelle analyser viste at cellemigrering av brystkreftceller under reoksygenering ble drevet ved nedregulering av
NDRG1
. Til slutt ble den regulatoriske modell av
NDRG1
bruker
i silico
analyse foreslått for videre etterforskning.
Resultater
Identifisering av gener som reagerer på Reoksygeneringen
MCF-7 humane brystcancerceller ble inkubert i henhold til hypoksi (0,5% O
2-konsentrasjon) i 24 timer og deretter skiftet til normoxia. Cellene ble høstet ved henholdsvis 0 (hypoksi kontroll), 1, 4, 8, 12 og 24 timer etter reoksygenering. Hver tidsserie ble uavhengig er utført i tre eksemplarer. Etter utpakking total RNA, ble Illumina Menneske 6 v3 BeadChips brukes til å undersøke dynamikken i transkripsjonen profilering på Reoksygeneringen. Bakgrunnsjustert signaler ble normalisert etter en quantile normalisering algoritmen. For å identifisere differensielt uttrykte gener, ble t-test anvendt for å undersøke uttrykket nivåer av hver gang punkt etter reoksygenering i forhold til den for tiden null. Genene responsive til Reoksygeneringen ble valgt ved å velge gener hvis gjennomsnitts
P
-verdi på et gitt tidspunkt var 10
-4. Totalt har vi identifisert 127 gener som karakternivåer merkelig betydelig fra tid null. Blant dem, 53,1% var oppregulert og 46,9% ble nedregulert på Reoksygeneringen. De fleste av disse genene (n = 112) ble identifisert ved bare ett tidspunkt, men 13 ble identifisert ved to tidspunkter, og to gener ble identifisert ved mer enn to tidspunkter.
Deretter prinsipal komponent analyse ( PCA) ble brukt for å undersøke reproduserbarhet mellom ulike replikater og de gangene spesifikke gener ble aktivert. Som vist i figur 1a, replikater av den samme tidspunkt samles sammen, noe som indikerer høy reproduserbarhet av våre data. Også forskjellige tidspunkter fordelt sekvensielt i henhold til den tidsforbruk under reoksygenering. Tidspunktene for 8 timer, 12 timer og 24 timer var gruppert sammen, hvilket indikerer lignende genuttrykksmønster på senere tidspunkter.
(a) Principal komponentanalyse (PCA) for O
2-responsive gener i MCF7-celler i løpet av 24 timer av reoksygenering etter hypoksi. Aksene er de første to hovedbestanddeler (PC), som kan forklare det meste av genekspresjon profilering. Tre uavhengige eksperimenter ble utført ved hvert tidspunkt. Ulike former representerer ulike paralleller; forskjellige farger representerer ulike tidspunkter. (B) Antall O
2-responsive gener i hvert tidspunkt under reoksygenering. Både oppregulert og ned-regulerte gener er plottet som en funksjon av tid. Svarte striper angir antall gener som ble identifisert for første gang, mens grå søyler angir antall gener som ble identifisert ved tidligere tidspunkter. (C) Relative uttrykk profiler av O
2-responsive gener etter skifte til Reoksygeneringen. De uttrykk verdiene for hvert tidspunkt ble normalisert til den for tiden null. Målestokken til venstre betegner 20 gener, og fargen linjen nederst angir graden av genuttrykk endring i forhold til tid null. (D) Kvantitativ RT-PCR validering av topp ti O
2-responsive gener til sine respektive tider med maksimal respons.
Dynamiske svarene av genuttrykk profilering på Reoksygeneringen
for å kvantitativt karakterisere O
2-responsive gener på hvert tidspunkt under akklimatisering til Reoksygeneringen, statistisk analyse (Student
t
-test) av hvert tidspunkt i forhold til tid 0 ble brukt for hvert gen. Antallet av gener som var signifikant forskjellig (
P
0,0001) fra den hypoksi-troll, ble plottet i figur 1b. Antallet O
2-responsive gener, inkludert både opp- og ned-regulert gener, var 0 på en time, 17 på 4 timer, 44 ved 8 timer, 49 på 12 timer, og 35 på 24 timer. På 8 h, hadde bare 7% av gener (3/44) blitt identifisert på 4 timer, mens 22% av genene (11/49) 12 h hadde blitt identifisert på 4 eller 8 timer. Dermed dette resultatet viste at transkripsjons respons ble aktivert mellom 8 og 12 timer etter Reoksygeneringen, og deretter redusert til 24 timer etter Reoksygeneringen.
For å forstå uttrykket profiler av disse O
2-responsive gener , deres ekspresjon verdiene ved hvert tidspunkt ble normalisert til den for tiden 0 (figur 1c). Heatmap viste at, generelt, intensiteten av opp- eller ned-reguleres gener øket som celler oppholdt seg lenger under reoksygenering. Deretter ble de 10 gener med de største uttrykk endringer ved Reoksygeneringen valgt å validere microarray resultater ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. Som vist i figur 1d, ekspresjons-verdiene for disse gener, med unntak av en, på tidspunktet punkter med maksimal respons var svært konsistent med microarray resultater.
Pathway analyse av gener som reagerer på reoksygenering
for å forstå hvilke veier var involvert i tilpasning til Reoksygeneringen, ble pathway analyse utført ved hjelp av NCI-Nature pathway Interaksjon Database [17]. Blant de 127 identifiserte gener, sti-analyse viste at, som forventet, var mest signifikant (
P
0,01) anriket pathway var den HIF-1-alfa-transkripsjonsfaktor nettverk, og den nest mest signifikante sti ble validert mål for C-MYC transkripsjonen aktivering (tabell 1). Videre, for å undersøke hvilken vei ble aktivert ved hvert tidspunkt, sti-analyser ble utført separat med O
2-responsive gener som er identifisert ved hvert tidspunkt. Resultatene viste at gener aktiveres 8 timer var involvert i validerte mål for C-MYC transkripsjonen aktivering (tabell 1). Gener aktivert på 12 timer var hovedsakelig involvert i HIF-1-alfa transkripsjonsfaktor nettverk, ceramid signalveien, og coregulation av androgen reseptor aktivitet.
nedregulering av NDRG1 fremmer celle migrasjon henhold Reoksygeneringen
Siden
NDRG1
, som er regulert av MYC signalveien, hadde den største endringen i uttrykket etter Reoksygeneringen, og at disse Reoksygeneringen gener ble beriket i validerte mål for C-MYC transcriptional aktivering, vi ønsket å videre undersøke responsen
NDRG1
til Reoksygeneringen. Det var ikke klart om
NDRG1
kan påvirke metastatisk evne til kreftceller. Derfor ble Transwell analyser gjennomført for å undersøke migrasjons evnen til MCF-7-celler ved forskjellig O
2 konsentrasjoner. Som vist i figur 2, de transkripsjonsnivåer av
NDRG1
var signifikant redusert ved reoksygenering (figur 2a), mens migrering evnen til MCF-7 signifikant øket (figur 2b). En western blot bekreftet at C-MYC og N-MYC økt, og NDRG1 redusert under reoksygenering betingelser (figur 2c). Disse resultatene indikerer at
NDRG1
kan påvirke migreringen av transformerte celler via MYC signalveien.
(a) Relativ ekspresjonsnivåer av
NDRG1
under forskjellige O
2 forhold. MRNA nivåene av
NDRG1
målt ved hjelp av RT-PCR ble først normalisert ved 18s rRNA, og deretter sammenlignet med de i normoxia (*
P
0,01). (B) Relativ migrering evne til MCF-7 under forskjellige O
2-forhold. En transwell-analysen ble anvendt for å måle MCF-7 migrasjon. Migrasjon evne ble uttrykt som fold endringer i forhold til normoxia. (C) Western-blots av HIF1α, C-MYC, N-myc, og NDRG1 i hypoksi og reoksygenering. GAPDH var lasting kontroll.
Deretter siden
NDRG1
ble nedregulert på Reoksygeneringen, vi overexpressed
NDRG1
i MCF-7 celler for å undersøke dens fysiologiske funksjon. For å bekrefte overekspresjon, ble mRNA og proteinnivåer NDRG1 undersøkt av kvantitativ RT-PCR (figur 3a) og western blotting (figur 3b). Transkripsjon og proteinnivåer NDRG1 i NDGR1-transfekterte celler var betydelig høyere enn i celler transfektert med tom vektor kontroll. MCF-7 celler transfektert med
NDRG1
eller tom vektor ble så inokulert i transwells for en ny runde med celle migrasjon analyser i henhold Reoksygeneringen. Resultatene viste at overekspresjon av NDRG1 signifikant (
P
0,001). Hemmet cellemigrering i henhold reoksygenering (figur 3c)
(a) Kvantitativ RT-PCR-analyse av
NDRG1
overekspresjon i MCF-7. De mRNA nivåer av
NDRG1
ble normalisert etter 18s rRNA. EV: tom vektor. (B) Western blotting av overexpressed NDRG1. Protein fra helcellelysater ble blottet med NDRG1-spesifikt antistoff, og p-actin ble laste kontroll. (C) Relativ migrering evne til MCF-7-celler etter overekspresjon NDRG1. Migrasjon evne ble uttrykt som fold endringer i forhold til MCF-7 etter Reoksygeneringen.
Prediksjon av MYC-assosiert transkripsjonsfaktorer og hypoksi-relaterte microRNAs i regulering
NDRG1
for å forstå mekanismene som regulerer
NDRG1
uttrykk, brukte vi bioinformatikk verktøy og en litteraturstudie for å forutsi bindende motiver av mYC-assosiert transkripsjonsfaktorer i formidler av
NDRG1 Hotell og bindingen områder av hypoksi-relaterte microRNAs (mirnas) i 3’UTR. Bruke MatInspector og kriterier i Materialer og metoder, ble 170 bindende motiver av transkripsjonsfaktorer identifisert i formidler av
NDRG1
. Blant disse transkripsjonsfaktorer, ble MYC-assosiert transkripsjonsfaktorer som ble rapportert tidligere valgte. Disse transkripsjonsfaktorer inkludert E2F-MYC aktivator, MYC forbundet sink fingre, og E-boks bindende faktorer. Deres bindende motiv, plassering, og sekvensen logo er oppført i tabell S1. Disse resultatene er oppført
NDRG1
kan være regulert av disse transkripsjonsfaktorene, selv om flere forsøk er garantert.
Til slutt, er uttrykket nivåer av mirnas kjent for å endre i henhold til hypoksi. For å undersøke muligheten for å
NDRG1
å være underlagt miRNA regulering under forskjellige O
2 forhold, ble bindingsseter av hypoksi-relaterte mirnas søkte i 3’UTR av
NDRG1
. Søkekriteriene tillatt en mismatch, slingre, sletting, eller gap mellom den andre og syvende nukleotider av miRNAs. Som vist i Tabell S2, seks bindingsseter for frøet regioner av fire hypoksi-relaterte mirnas-MIR-25, MIR-93, MIR-106a, og MIR-210-ble identifisert i den 3 «UTR av
NDRG1
, noe som tyder på at
NDRG1
kunne være regulert av disse fire miRNAs. Dette resultatet kan brukes til å designe eksperimenter som undersøker post-transcriptional regulering av
NDRG1
av mirnas.
Diskusjoner
Flere studier har rapportert at kreftceller displayet økt resistens og metastatisk potensial etter eksponering for hypoksi /reoksygenering fornærmelser [13], [15]. Selv om mobilnettet tilpasninger til hypoksi er godt dokumentert, er lite kjent om adaptive mekanismer til Reoksygeneringen. Her, undersøkte vi dynamikken i genom-wide-genekspresjon i løpet av reoksygenering, og fant at de differensielt uttrykte gener var involvert i HIF-1-alfa-transkripsjonsfaktor nettverk og C-MYC transkripsjonen aktivering.
I denne studien , prinsipal komponent analyse av de oksygen responsive gener som viste høy reproduserbarhet over tid. Basert på antallet O
2-responsive gener på forskjellige tidspunkter, vises den aktive periode av transkripsjon i respons til reoksygenering å være mellom 8 og 12 timer. Videre pathway analyse viste at O
2-responsive gener på 12 timer var involvert i HIF-1-alfa transkripsjonsfaktor nettverk, ceramid signalveien, og coregulation av androgen reseptor aktivitet. Det er ikke overraskende at HIF-1-alfa transkripsjonsfaktor nettverket var involvert i Reoksygeneringen, fordi det har blitt rapportert i en lignende situasjon, dvs. bestråling. Etter radioterapi, fører tumor reoksygenering til atom akkumulering av HIF-1 som reaksjon på reaktive oksygenforbindelser [18]. En av gener, nemlig
NDRG1
i HIF-1-alfa transkripsjonsfaktor nettverk trekke vår oppmerksomhet fordi det hadde den største endringen i uttrykket etter Reoksygeneringen.
NDRG1
uttrykkes ubikvitært i vevene stimulert i henhold til et bredt spekter av belastninger og cellevekstregulerende tilstander, så som hypoksi [19], [20], DNA-skade [21], cellulær differensiering [22], [23], [24], spredning og vekst arrest [23]. Det har blitt rapportert at
NDRG1
er sterkt oppregulert etter hypoksiske forhold. En onkogen og tumor-fremmende rolle
NDRG1
er også blitt rapportert, fordi det ble overuttrykt i forskjellige humane kreftformer, inkludert lunge, hjerne, hud, nyre og bryst-kreft [25], [26]. Men
NDRG1
fungert som en metastatisk suppressor i prostata og tykktarm kreft [24], [27]. De motstridende roller
NDRG1
i kreft forble avklares, selv om de kan forklares med sine mange cellulære lokaliseringer og komplekse regulering av ulike fysiologiske og patologiske faktorer. Nylig, Toffoli et al. indikerte at
NDRG1
kan induseres under intermitterende hypoksi å fremme cellemigrasjon [28]. Flere studier har også antydet at
NDRG1
er indusert av hypoksi og forbundet med spredning, men reguleringsmekanisme for
NDRG1
forblir unnvikende og dens funksjon i henhold Reoksygeneringen er fortsatt uklart.
NDRG1
hadde maksimal transkripsjonen svar på Reoksygeneringen i denne studien, som vi følte garantert videre undersøkelser. Vi observerte at uttrykket av
NDRG1
hadde en invers sammenheng med cellevandring på Reoksygeneringen. Disse resultatene implisere NDRG1 som en metastase suppressor, i samsvar med funnene i Maruyama et al. [8]. Avviket mellom våre resultater og de av Toffoli et al. [28] kan skyldes forskjellige typer celler og eksperimentelle innstillinger.
For å forstå mer fullt mulige reguleringsmekanismer for
NDRG1
henhold Reoksygeneringen,
i silico
sekvensanalyse ble utført for å forutsi DNA bindende motiver av transkripsjonsfaktorer i formidler av
NDRG1
. Blant de MYC-forbundet bindende motiver identifisert, sink finger proteiner, E2F-MYC aktivator /cellesyklus regulatorer, og E-boks bindende faktorer kan påvirke genuttrykk [29], [30], [31], [32]. Disse kandidat transkripsjonsfaktorer kan bli ytterligere validert ved å konstruere ulike arrangører som bruker luciferasepreparater analyser. Videre er uttrykket nivåer av flere mirnas vist seg å endre seg i hypoksi [33], [34], [35]. Spesielt er MIR-210 indusert ved hypoksi via en HIF1-avhengig mekanisme, og ekspresjon av MIR-210 hadde en sterk sammenheng med uttrykk for
NDRG1 product: [34]. Derfor hypotese vi at uttrykket av
NDRG1
ble også regulert av miRNAs. Faktisk ble bindingsstedene for frøet regioner av fire hypoksi-relaterte mirnas (MIR-106a, MIR-93, MIR-25, og MIR-210) identifisert i 3’UTR av
NDRG1
. Derfor har vi foreslått en fungerende modell basert på bioinformatiske prediksjon og litteratur undersøkelsen (figur 4). Denne modellen gir et rammeverk for fremtidige biologiske eksperimenter
TSS. Transkripsjon start stedet. Hvit boks: transkripsjonsfaktor bindingssete på + strand; svart boks: transkripsjonsfaktor bindingssete på – strand; grå boks: miRNA bindingssetet
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneskelig brystkreft cellelinje MCF-7 ble hentet fra Bioresource Collection og Research Center (. Hsiuchu, Taiwan). MCF-7-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) inneholdende 1,5 g /l natriumbikarbonat supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (Hyclone, Gibco) og med 1% antibiotikaløsning (Invitrogen Livet Technologies, Carlsbad, California). For hypoksiske kulturer, ble celler inkubert i en hypoksi kammer (Invivo
2-200, Ruskinn Technology, Leeds, UK) i 24 timer med en gassblanding inneholdende 5% CO
2, 95% N
2 ved 37 ° C. Oksygenkonsentrasjonen i den hypoksi kammeret ble holdt ved 0,5%. Etter 24 timer med hypoksisk vekst, ble cellene inkubert i en godt fuktet inkubator med 5% CO
2 og 95% romluft ved 37 ° C. Seks prøver ble oppsamlet ved henholdsvis 0, 1, 4, 8, 12 og 24 timer etter reoksygenering. Cellene ble vasket med kald PBS, flash-frosset i flytende N
2, og lagret ved -80 ° C for senere RNA-isolering. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
RNA-ekstraksjon
Total RNA ble ekstrahert med TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) og ble renset ved RNeasy Micro opprydding kit (Qiagen, Valencia, CA ) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA konsentrasjon og kvalitet ble bestemt ved hjelp av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) og en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), som beregner en RNA integritet nummer (RIN). Total-RNA (500 ng) med A
260 /A
280 = 1.7 til 2.1 og RIN . 7.0 ble anvendt for å syntetisere den første streng cDNA via revers transkripsjon
Illumina human whole-genom ekspresjon beadchips
det totale RNA ble primet med T7-Oligo (dT) primer og amplifisert ved Illumina TotalPre RNA Amplification Kit (Ambion Inc., Austin, Texas) for å syntetisere cDNA som inneholder en T7-promotersekvens. Etter den første tråd cDNA-syntese, var andre tråd cDNA syntetisert ved å omdanne den enkjedete cDNA i et dobbelt-trådet DNA (dsDNA) templat for transkripsjon. Reaksjonen ansatt DNA polymerase og RNase H samtidig svekke RNA og syntetisere andre tråden cDNA. Den dobbelt-trådet cDNA gjennomgikk så en renseprosess for å fjerne overskudd av RNA, primere, enzymer, og salter som ville hemme in vitro transkripsjon. Deretter ble in vitro transkripsjon utført ved bruk av den dobbeltkjedet cDNA som et templat, og T7 RNA-polymerase for å syntetisere multiple kopier av biotinylert cRNA. Etter amplifikasjon ble cRNA blandet med et likt volum av hybridiseringsbuffer og hybridisert til Illumina Human-6 V3 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) ved 58 ° C i 16 timer. Etter hybridisering ble BeadChip vasket og farget med streptavidin-Cy3 fargestoff. Intensiteten av vulsten er fluorescens ble påvist ved den Illumina BeadArray Reader, og resultatene ble analysert ved anvendelse BeadStudio v3.1 programvare. Alle data er MIAME kompatibel og at rådata har blitt deponert i en MIAME kompatibel database. Microarray data i denne studien har blitt sendt til GEO (Gene Expression Omnibus) database (tiltredelse antall GSE30019).
Data mining og statistisk analyse
Etter skanning, intensitetsdata for Illumina av menneskene 6 v3 BeadChips ble analysert av kommersiell programvare Partek® (Partek, St. Charles, MO) for mRNA uttrykk analyse. Bakgrunnsjustert signaler ble normalisert etter en quantile normalisering algoritmen, som normalisert sonde intensiteter basert på intensitetsfordelingen blant alle lysbilder. Etter normalisering, Principal Component Analysis (PCA), noe som reduserer høy-dimensjonale data i et 2D-graf, ble anvendt for å vurdere likheten av genekspresjonsprofiler. For å identifisere differensielt uttrykte gener, t-tester som undersøker uttrykket nivåer av hver gang punkt etter reoksygenering i forhold til den for tiden null ble benyttet. Gener som
P
-verdi av tre gjentak på ett eller flere tidspunkter var 10
-4 ble identifisert og definert som O
2-responsive gener. The Genesis program [36] ble brukt til å generere en visuell representasjon av ekspresjonsprofiler. Videre NCI-Nature Pathway Interaksjon Database [17] ble brukt til å identifisere de biologiske funksjonene til de forskjellig uttrykte gener.
Overuttrykte
NDRG1
i MCF-7
menneskelig
NDRG1
genet ble satt inn mellom
EcoRI
og
BamHI
sidene til de eukaryote uttrykk vektor pcDNA3.1 + (Invitrogen, Carlsbad, CA). MCF-7 /NDRG1 celler ble skapt av transfeksjon av MCF-7 celler med pcDNA3.1 + koding av
NDRG1
genet ved hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California). MCF-7 /NDRG1-celler ble så valgt ved 200 ug /ml Zeocine i to uker. MRNA uttrykk for
NDRG1
ble undersøkt av kvantitativ real-time PCR, og NDRG1 protein uttrykk ble undersøkt av western blotting.
Kvantitativ revers-transkripsjon PCR
Total RNA var hentet ved hjelp TRIzol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon av totalt RNA ble utført med en høy kapasitet cDNA RT Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved anvendelse av tilfeldige primere og 1 ug total RNA som templat. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 25 ° C i 10 min, 37 ° C i 2 timer og 85 ° C i 5 sek. Sanntids PCR ble påvist ved SYBR grønn (Sigma) og ble utført ved anvendelse av ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reaksjonene ble utført ved bruk av følgende program: 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og 1 minutt av gløding og forlengelse ved 60 ° C. For hver cDNA-prøve, en intern kontroll, 18S rRNA, ble også målt ved hjelp av SYBR grønn sonden for å sikre sammenlignbare mengder av cDNA i alle brønnene. Relativ ekspresjon av NDRG1 sammenlignet med 18S rRNA i hver prøve ble beregnet (△ Ct) og relative ekspresjon av NDRG1 hos prøvene ble bestemt ved å beregne forskjellen i △ Ct mellom samples (△△ Ct). Alle målinger ble gjort i tre eksemplarer (5 ng av total RNA per brønn).
Western blotting
Hele celle ekstrakter ble utarbeidet etter RIPA lysebuffer supplert med 1% Nonidet P-40 (NP 40) og Mini proteasehemmer Cocktail Tabletter (Roche, Mannheim, Tyskland). Cellerester ble oppsamlet ved sentrifugering ved 8000 x g ved 4 ° C i 20 minutter. Proteinkonsentrasjon ble målt ved fremgangsmåten bicinchoninic syre (BCA-analyse), og 20-50 ug protein ble applisert på en 10% denaturerende natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel. Etter elektroforese, ble protein elektro overført til PVDF membraner over natten ved 55 mA. Membranene ble blokkert med Tris-buffret saltvann Tween-20 (TBST) med 5% ikke-fett tørrmelk ved romtemperatur i en time. Påvisning av spesifikke proteiner ble gjort ved å måle membraner med primære antistoffer i TBS med 0,1% Tween-20 i 1,5 timer ved romtemperatur. Disse antistoff inkluderte NDRG1 (Abcam, 1:500), HIF1α (Millipore, 1:1000), C-MYC (Millipore, 1:1000), N-myc (Millipore, 1:250), og lastekontroll GAPDH (GeneTex, 1:10000) eller β-aktin (1:5000). Etter inkubasjon med pepperrot-peroksidase-konjugert IgG sekundære antistoffer (1:5000), ble immunreaktiviteten visualisert ved forsterket kjemiluminescens med Luminol Reagens (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA).
Cellemigrering assay
Migrasjon analysene ble utført ved hjelp av 24-brønnen Transwell migrasjon kamre (Corning, Corning, New York, USA) med 8 mikrometer porestørrelse polyetylen membraner. Cellene ble først sultet 24 timer og ble høstet ved Accutase (PAA Laboratories, Linz, Østerrike). Forkamrene ble inokulert med 5 x 10
4 celler /brønn i 0,1 ml serumfritt DMEM celleløsning, og det nedre kammer ble fylt med 0,6 ml DMEM inneholdende 10% FBS som kjemotiltrekkende. Celler ble tillatt å migrere i 24 timer ved 37 ° C. For å måle de migrerte celler, 2 ug /ml Calcein-AM (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) /celledissosiasjon Solution (Trevigen) ble tilsatt inn i det nedre kammer. Etter inkubering ved 37 ° C i 60 minutter, ble innsatser fjernet og platene ble avlest ved 485 nm for eksitasjon og 520 nm for emisjon. Celleantall ble beregnet ved sammenligning av absorbans til standardkurven. MCF-7 celler transfektert med tom vektor ble brukt som kontroll for hvert forsøk.
I silico
analyse av
NDRG1
For å identifisere potensielle bindings motiver av mYC-assosiert transkripsjonsfaktorer i formidler av
NDRG1
, den MatInspector programmet ble benyttet [37]. To forhåndsdefinerte grupper av transkripsjonsfaktorer, inkludert generell kjernepromotorelementer og virveldyr, ble analysert i matrisen biblioteket versjon 8.3 ved bruk av følgende parametere: (1) matrise familier ble matchet i stedet for de enkelte sekvenser; (2) kjerne likhet var minst 0,75; (3) matrise likhet var optimalisert. Kjernen regionen ble definert som fire sammenhengende nukleotider med høyest verne score [38]. Kjernen og matrisen likheten ble beregnet ved å sammenligne spørringen sekvensen med den mest konservert nukleotid i matrisen. Etter å identifisere potensielle transkripsjonsfaktorkandidater ble MYC-assosiert transkripsjonsfaktorer videre valgt basert på en litteraturstudie.
For å identifisere bindingsstedene for hypoksi-relaterte mirnas,
NDRG1
3 « UTR sekvensen ble lastet ned fra UCSC genom nettleser (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway; GRCh37 /hg19 montering), og ble justert til hypoksi-relaterte miRNAs. Kriteriene for å søke bindingssteder av frøet regionen var slik at en mismatch, slingre, sletting, eller gap mellom den andre og syvende nukleotider av hypoksi-relaterte mirnas.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
