Abstract
Kreft stammer fra celler som har fått mutasjoner i genene kritiske for å kontrollere celledeling, overlevelse og differensiering. Ofte svulster fortsetter å stole på disse såkalte driver mutasjoner, som gir begrunnelsen for målrettet kreftterapi. Hittil har store sekvense analyser viste hundrevis av mutasjoner i humane tumorer. Men uten deres funksjonelle validering det er fortsatt uklart hvilke mutasjoner tilsvarer driver, eller snarere bystander, mutasjoner og derfor hvorvidt det muterte genet representerer et mål for terapeutisk intervensjon. I menneskelige kolorektal tumorer har neurotrophic reseptoren TrkB blitt funnet mutert på to forskjellige steder i sitt kinase domene (TrkB
T695I og TrkB
D751N). Et annet område, i den ekstracellulære delen av TrkB, er mutert i en human lunge adenokarsinom cellelinje (TrkB
L138F). Endelig har vår egen analyse identifisert ett ekstra TrkB punktmutasjon proksimale til kinase domene (TrkB
P507L) i en human melanoma cellelinje. De funksjonelle konsekvenser av alle disse punktmutasjoner har imidlertid hittil vært unnvikende. Tidligere har vi vist at trkB er en potent suppressor av anoikis og at trkB-uttrykkende celler danne meget invasive og metastatiske tumorer i nakne mus. For å vurdere de funksjonelle konsekvensene av disse fire TrkB mutasjoner, bestemt vi deres potensial til å undertrykke anoikis og å danne svulster i nakne mus. Uventet, både tykktarm kreft-avledet mutanter, TrkB
T695I og TrkB
D751N, vises redusert aktivitet sammenlignet med villtype TrkB. Konsekvent, ved stimulering med den TrkB ligand BDNF, ble disse mutanter svekket i aktivere trkB og dens nedstrøms effektorer AKT og ERK. De to mutanter avledet fra humane tumorcellelinjer (trkB
L138F og trkB
P507L) var funksjonelt skilles fra villtype trkB i både
in-vitro
og
in-vivo
analyser. I konklusjonen, klarer vi å oppdage eventuelle gevinst-of-funksjon av fire kreft avledet TrkB punktmutasjoner
Citation. Geiger TR, Song JY, Rosado A, Peeper DS (2011) Funksjonell Karakterisering of Human Cancer avledet trkB mutasjoner. PLoS ONE 6 (2): e16871. doi: 10,1371 /journal.pone.0016871
Redaktør: Hang Nguyen, Emory University, USA Ameica
mottatt: 21 september 2010; Godkjent: 17 januar 2011; Publisert: 17 februar 2011
Copyright: © 2011 Geiger et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en EU FP6 tilskudd til TRG, AR og D.S.P. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en genetisk sykdom, med en rekke somatiske mutasjoner i proto-onkogener og tumorsuppressorgener bidrar til ondartet fenotype [1]. Disse genene som normalt styrer vitale prosesser, inkludert celleproliferasjon, differensiering overlevelse eller [2]. Deres mutasjon begaver tumorceller med en selektiv fordel, noe som resulterer i klonal ekspansjon og neoplasi. Selv om svulster vanligvis multiple genetiske avvik [1], kan inhibering av bare en eller noen få genprodukter være tilstrekkelig til stort sett å undertrykke tumorcelle-proliferasjon eller levedyktigheten [3]. Dette har blitt vist å forårsake tumor-regresjon i ulike kreftmusemodeller [4] – [6] og førte til begrepene «oncogen avhengighet» og «tumorsuppressorgen hypersensitivitet» [3]. Avhengigheten av tumorceller på visse onkogener og signalveier eksponerer en «akilleshælen» av kreft, som kan være mål for anticancerterapi [7]. Basert på dette konsept har flere nye terapeutiske midler blitt utviklet og anvendes i klinikken [8]. De omfatter imatinib mesylate (eller «Glivec» /»Glivec») for BCR-ABL-hemming i kronisk myelogen leukemi (KML) [9] og henholdsvis for KIT hemming i gastrointestinal stromal tumor (GIST) [10],. Tilsvarende, i brystkreftpasienter med ErbB2 (også kalt HER-2 /NEU) overekspresjon, det monoklonale antistoff trastuzumab [11] – [13], og den lille molekyl-inhibitor lapatinibs [14] er effektive. En kritisk rolle for onkogene mutasjoner er illustrert ved eksemplet med epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR /ERBB1) i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), hvor bare en undergruppe av pasienter responderer på EGFR-hemmer gefitinib. Sekvense analyser avslørte at responderende svulster havnen spesifikke mutasjoner i EGFR, og øker sin aktivering av EGF [15].
Disse og andre eksempler illustrerer at identifiseringen av onkogener kritisk som kreves for tumorcelle-proliferasjon og overlevelse kan føre til effektiv anticancer therapeutics. Derfor har flere forskningsgrupper vært å gjennomføre systematisk storskala sekvense analyser for å screene for gener som er mutert i kreft. Denne strategien har ført først til identifisering av den BRAF kinase som et kritisk onkogen i en stor andel av melanomer og flere andre krefttyper [16]. I 2003, gruppen av Vogel, Kinzler og Velculescu systematisk sekvensert kinase domener av alle tyrosin kinaser i en samling av menneskelige kolorektal kreft. De fant 7 ut av 138 som ble analysert gener som skal muteres i mer enn en tumor [17]. Den samme gruppen senere analysert mer enn 1000 forskjellige gener i brystkreft og tykktarmskreft [18], identifiserer opptil 189 nye og kjente kandidat kreftgener. Likeledes Stratton, Futreal og medarbeidere ved Sanger Institute sekvensert første 518 helaftens kinaser i lungesvulster og tumorcellelinjer [19] og deretter full kinome i ti ulike krefttyper [20]. Disse og andre analyser har identifisert hundrevis av nye somatiske mutasjoner over flere menneskelige maligne [21]. Men noen unntak til side, de funksjonelle konsekvensene av disse mutasjonene har vært stort sett unnvikende. For å velge de riktige målene for fremtidig kreftterapi, vil det være nødvendig å teste eksperimentelt hvilke av disse mutasjonene er onkogene og som muterte gener svulster er avhengige av.
Vi valgte å undersøke neurotrophic reseptoren TrkB (NTRK2), for som tre somatiske, ikke-synonyme punktmutasjoner er rapportert i ovennevnte [17] studier, [19], mens vårt eget analyse har vist en annen trkB punktmutasjon i en human melanoma-cellelinje. TrkB er en av tre medlemmer av TRK-reseptor-familien, som også omfatter trkA og trkC. TrkB bindes fortrinnsvis den neurotrofin hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF) og NT4 /5, mens trkA og trkC har høye affiniteter til nervevekstfaktor (NGF) og NT3, henholdsvis [22]. Den pan-TRK reseptor p75NTR modulerer ytterligere respons fra TRK reseptorer til neurotrophins [22]. TrkB har blitt funnet overuttrykt i mange humane aggressive krefttyper (for oversikt se [23]). Tidligere har vi vist at trkB er en potent suppressor av anoikis (apoptose indusert ved upassende eller fraværende celleadhesjon) i rotte epitelceller, og at trkB-overuttrykkende celler danne meget invasive og metastatiske tumorer i nakne mus [24]. Videre våre tidligere rapporterte struktur-funksjonsanalyse viste at alle disse funksjonene avhenger av trkB kinase-aktivitet i denne eksperimentelle system [25]. Mer nylig har vi demonstrert for TrkB-transform rotte epitelceller som økte MAPK aktivitet signaler via vri og sneglen å indusere Epitelial-Mesenchymale Transition (EMT) -lignende transformasjon, anoikis undertrykkelse og metastasering [26]. Som to av de identifiserte kreft-avledede trkB punktmutasjoner kartlegge innenfor kinasedomenet, muligens påvirke dets enzymatiske aktivitet, er det tenkelig at de opptrer oncogent og svarer til driver mutasjoner. Hensikten med denne studien var derfor å vurdere de funksjonelle konsekvensene av fire uavhengige menneskerettighets kreft-avledet TrkB punktmutasjoner.
Resultater
Identifisering av menneskelige kreft avledet TrkB punkt mutanter og generasjon cellesystemer
To ikke-synonyme punktmutasjoner innenfor kinase domenet til
trkB
genet har blitt oppdaget i kolorektal tumorer: trkB
T695I og trkB
D751N [17] ( nummerering av alle aminosyresekvenser refererer til full-lengde human trkB protein, tilgangsnummer NP_006171.2). En annen trkB punktmutasjon, trkB
L138F, ble identifisert i lunge adenokarsinom-cellelinje NCI-H2009 [19]. Denne mutasjonen ligger innenfor leucin-rik domene av den ekstracellulære del av reseptoren, noe som har vist seg å være nødvendig for binding av trkB ligand hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF) og aktivering av trkB reseptoren [25], [27 ], [28]. Vi bekreftet tilstedeværelsen av denne mutasjonen ved sekvensering av genomisk DNA (gDNA) isolert fra NCI-H2009-celler (figur 1A, venstre panel). Tilstedeværelsen av en dobbel topp (tymidin og cytosin) indikerer at mutasjonen er heterozygot, i samsvar med den opprinnelige meldingen [19]. Det resulterer i erstatning av leucin med fenylalanin. For å søke etter flere kreftrelatert
TrkB
punktmutasjoner, sekvensert vi eksoner som utgjør
TrkB
kinase domene fra genomisk DNA fra 28 humane tumorcellelinjer, fra flere vev opprinnelse (data ikke vist ). Denne analysen viste en ekstra
trkB
punktmutasjon, i MDA-MB-435 melanom-cellelinje. (MDA-MB-435-cellelinjen synes å ha blitt klassifisert feil i det siste [29]. Mens det ble opprinnelig isolert fra en pasient med brystkreft [30], [31], indikerte fersk analyse som for øyeblikket er tilgjengelige cellelinjen er av melanom opprinnelse [32], [33]).
TrkB
mutasjon identifisert i MDA-MB-435 celler er C1520T, noe som resulterer i en substitusjon av prolin 507 med leucin (TrkB
P507L). I dette tilfellet, sekvensering av gDNA viste en enkelt topp bare (panel figur 1A til høyre), noe som tyder på at mutasjonen er homozygot. Den P507 Resten er plassert proksimalt til kinase domene i den intracellulære delen av reseptoren. Figur 1B viser en skjematisk oversikt over posisjonene til alle humane kreft-avledede trkB punktmutasjoner analysert i denne studien.
(A) Sekvensanalyse av gDNA fra NCI-H2009 celler som inneholder trkB
L138F mutasjon ( venstre panel) og fra MDA-MB-435 celler som trkB
P507L mutasjon (høyre panel). Stjerne (*) indikerer de respektive muterte baser. Svarte bokstaver betegne vill type rester, røde bokstaver betegne mutante rester. (B) Skjematisk oversikt over alt kreft-avledede trkB punktmutasjoner analysert i denne studien. LRM: leucine-Rich Motif, Ig: Immunoglobulin-lignende domene, TM: transmembrane domene. Tallene angir posisjoner av aminosyrerester. (C) ekspresjon nivåer av mutant eller villtype-trkB i RIE-1-celler, ble analysert på immunoblot (IB). Tubulin fungerer som lasting kontroll. Tallene representerer kvantifisering av TrkB signal, normalisert til alfa-tubulin, og i forhold til Vector kontroll. (D) celleoverflate biotinylering analysen viser at i det minste en betydelig del av alle trkB mutanter lokaliserer til cellemembranen. Totale celleoverflateproteiner ble biotinylert med Sulfo-NHS-LC-Biotin, lysert og trkB ble immunopresipitert (IP) med TRK-antistoff (C-14, C-13 for kontroll). Etter gelelektroforese ble biotinylert trkB visualisert med streptavidin-HRP og total trkB med TRK-antistoff (C-14). All villtype og mutant TrkB proteiner ble biotinylert (øverst til venstre panel). På høyre side spesifisiteten av analyse demonstreres: biotin signal ble bare detektert i full-lengde trkB (panel øverst til høyre, andre felt), men ikke for cytosol, avkortet TPR-trkB [25] (tredje felt, forventet i ~ 50 kD), og ikke i kontroll IP (felt 4) eller i fravær av Sulfo-NHS-LC-Biotin (felt 5). IP-en total full-lengde og avkortede trkB er vist i bunnplatene. Pilspisser indikerer full lengde TrkB, indikerer pil avkortet TPR-TrkB (like under Ig tunge kjeder).
Vi har vurdert om disse fire kreft avledet TrkB punktmutasjoner tilsvarer få-av-funksjon mutasjoner assosiert med økt onkogene potensial. Vi utførte denne analysen i rotte epitelceller første, fordi de er svært følsomme for trkB-mediert onkogene transformasjon, som markert ved en EMT-lignende morfologisk transformasjon, anoikis resistens og metastatisk tumordannelse i nakne mus [24] – [26]. For å oppnå dette har vi klonet villtype og mutant trkB inn i den retrovirale pBabe-puro ekspresjonsvektor og transdusert rotte intestinal epithelial (RIE-1) celler samt E1A-immortalisert rottenyre epitelceller (RK3E) celler. Begge cellelinjer er udødeliggjort, men likevel ikke-onkogent i atymiske mus. Som en negativ kontroll, uttrykte vi en kinase-inaktive mutant av trkB, trkB
K588M [34], som vi tidligere har vist seg å være ute av stand til oncogent transformerende RIE-1-celler [25], [26]. Vi bekreftet av western blot analyse som alle TrkB mutantene ble uttrykt til samme nivå som villtype TrkB (figur 1C for RIE-1 celler, figur S1A for RK3E celler). I samsvar med våre tidligere observasjoner [25], vi har oppdaget TrkB som flere arter på en SDS-polyakrylamidgel, mest sannsynlig reflekterer ulikt glykosylert arter [35]. Videre, ved å utføre en celleoverflate biotinylering assay sikret vi at i det minste en detekterbar andel av alle trkB mutanter riktig lokalisert til cellemembranen [36] (figur 1D). Vi genererte dermed en celle system som tillater oss å sammenligne aktivitetene og funksjonene til de ulike TrkB mutanter ved siden av hverandre.
Transformator potensialet av menneskelige kreft avledet TrkB punkt mutanter in vitro
Som de fleste kinaser trenger trkB et minimalt nivå av aktivering for å transformere epitelceller. Vi antok at hvis kreft-avledede trkB mutasjoner gi en vinning av funksjon, kan de transformere epitelceller, selv i fravær (eller med reduserte nivåer) av BDNF. Imidlertid, når vi testet de forskjellige trkB mutanter i fravær av ko-uttrykt ligand, ingen av dem induserte en spindelformet cellemorfologien (figur 2A for RIE-1-celler, figur S1B for RK3E celler) eller undertrykt anoikis (figur 2B, Figur S1C) i fravær av BDNF. Dette var i kontrast til det som ble observert for den konstitutivt aktive og ligand-uavhengig TPR-trkB mutant, noe som gjorde omforme RIE-1 og RK3E celler og undertrykket anoikis i fravær av eksogent BDNF, i samsvar med vår tidligere rapport [25].
(A) Morfologi av RIE-1 celler som uttrykker mutant eller villtype trkB, fotografert ved 50x forstørrelse. (B) Anoikis analyse, der cellene beskrevet i (A) ble sådd på ULC plater og skannes ved 1x forstørrelse 9 dager senere (7 dager for TPR-TrkB).
Neste, vi aktivert vill-type og mutante reseptorer stabilt ved ko-ekspresjon av human BDNF, både i RIE-1 (figur 3A) og RK3E celler (figur S1D). I samsvar med våre tidligere observasjoner [24] – [26], for celler som uttrykker villtype TrkB + BDNF dette resulterte i EMT-lignende morfologisk transformasjon (figur 3B, figur S1E), nedregulering av E-cadherin (Figur 3C og figur S1F) og anoikis undertrykkelse (Figur 3D, Figur S1G). Det samme ble sett for celler som uttrykker TrkB
L138F + BDNF og TrkB
P507L + BDNF. I motsetning ble TrkB
T695I- og TrkB
D751N-uttrykke celler svekket i sin respons på BDNF (figur 3B, C, D, figur S1E, F, G). Disse resultatene viser at uventet TrkB
T695I og TrkB
D751N er svekket i sin evne til å forvandle rotte epitelceller
in vitro
. Videre TrkB
L138F og TrkB
P507L er umulig å skille fra villtype TrkB i denne innstillingen.
(A) RIE-1 celler uttrykker mutant eller villtype TrkB ble omformet med BDNF og analysert på immunoblot (IB). Arrowhead viser plasseringen av BDNF. Tubulin fungerer som lasting kontroll. (B) morfologisk transformasjon av RIE-1 celler samtidig uttrykte mutant eller villtype trkB og BDNF, fotografert ved 50x forstørrelse. (C) Den epiteliale markør E-cadherin er nedregulert i trkB-indusert, morfologisk transformerte celler, som målt ved immunoblotanalyse (IB) analyse. β-actin fungerer som lasting kontroll. (D) Anoikis undertrykkelse av mutant eller villtype trkB + BDNF i celler som beskrevet i (A). Celler ble skannet på 1x forstørrelse 9 dager etter såing på ULC plater.
respons av humane kreft avledet TrkB mutanter til BDNF
Vi har tidligere vist at TrkB-mediert onkogene transformasjon av RIE-1 celler kritisk avhenger av trkB-kinase-aktivitet [25], [26]. På jakt etter en biokjemisk forklaring for de uforutsette resultater er beskrevet ovenfor, bestemt vi om kreft-avledet TrkB mutanter avvike fra villtype TrkB i sin respons til BDNF. For å måle trkB aktivering, anvendte vi RIE-1-celler som uttrykker villtype eller mutant trkB, men ingen ligand, og stimuleres cellene med et fysiologisk relevante området av rekombinant BDNF. I tråd med tidligere studier [25], [26], dette induserte autofosforylering av villtype-trkB (figur 4A og 4B), og førte til aktivering av to store nedstrøms signalveier [22]: den PI3K pathway (noe som resulterer i fosforylering av AKT /PKB, figur 4C) og MAPK-reaksjonsveien (som resulterer i fosforylering av MAPK /ERK, figur 4D). Eksponering til 1 ng /ml BDNF var tilstrekkelig til å utløse villtype trkB autofosforylering og aktivere MAPK veien, mens høyere konsentrasjoner av BDNF var nødvendig for å aktivere AKT (figur 4B, C, D og data ikke vist). TrkB
L138F og TrkB
P507L svart på BDNF på samme måte som villtype TrkB. I samsvar med deres manglende evne til å undertrykke anoikis ble TrkB
T695I bare delvis aktivert av BDNF, mens TrkB
D751N var helt svarer til BDNF, identisk med kinase-inaktive TrkB
K588M (figur 4). Disse resultater viser at trkB
T695I og trkB
D751N skjerm redusert respons til BDNF stimulering i rotte epitelceller, mens trkB
L138F og trkB
P507L oppfører indistinguishably fra villtype-trkB.
(A) RIE-1-celler som uttrykker villtype eller mutant trkB ble stimulert med 10 ng /ml rekombinant BDNF og analysert for fosfo-tyrosin (pY) og total TRK-innhold ved immunutfelling (IP) og påfølgende immunoblot (IB) analyse . (B) RIE-1-celler som uttrykker villtype eller mutant trkB ble stimulert med 1 ng /ml rekombinant BDNF og analysert for fosfo (p) og total TRK. (C) RIE-1-celler som uttrykker villtype eller mutant trkB ble stimulert med 10 ng /ml rekombinant BDNF og analysert for fosfo (p) AKT og total AKT. PI3K-inhibitor LY294002 ble anvendt for å bekrefte identiteten til den pakt signal indikeres av en pilspiss. Stjerne (*) angir en ikke-spesifikk band. Prøvene er lagt i baner to og tre tjene som kontroller, og ble hentet fra en gjengivelse eksperiment utført under identiske forhold. (D) RIE-1-celler som uttrykker villtype eller mutant trkB ble stimulert med 1 ng /ml rekombinant BDNF og analysert for fosfo (p) ERK og total ERK. For alle paneler, tallene under indikere kvantifisering av fosfo-spesifikke signaler, normalisert til de totale signaler, og i forhold til de av vill-type trkB.
onkogent potensialet av humane cancer-avledede trkB mutanter uttrykt i rotte epitelceller
Deretter testet vi onkogene potensialet i trkB mutanter
in vivo
, i mus xenograft eksperimenter. Vi inokulert subkutant Balb /c nakne mus med villtype eller mutante trkB-uttrykkende celler. I fravær av BDNF, bare villtype TRKB-, trkB
L138F- og trkB
P507L-uttrykkende RIE-1 celler (figur 5A, B, fig S2A, B) og RK3E celler (figur S2E, F ) dannet store svulster med korte ventetider, men ingen av trkB
T695I- eller trkB
D751N-uttrykke celler gjorde. I likhet med dette, også i nærvær av ko-uttrykte BDNF, trkB
L138F og trkB
P507L forårsaket svulster på lignende måte til villtype-trkB i RIE-1 og RK3E celler (figur 5C, D, fig S2C, D og Figur S2G, H). I denne innstillingen, RIE-en TrkB
T695I + BDNF-uttrykke celler også dannet svulster, men med en statistisk signifikant forsinkelse i forhold til RIE-en TrkB
wt + BDNF-uttrykke celler (figur 5C, S2C). Av notatet, når 1 * 10
5 celler ble vaksinert, også RIE-en TrkB
D751N + BDNF-uttrykkende celler dannet svulster, men med en betydelig lengre ventetid enn de som fremkalles av RIE-en TrkB
wt + BDNF-uttrykkende celler (data ikke vist). I RK3E celler, ble ekspresjon av trkB
D751N ikke føre til tumordannelse, selv med høyt celletall og i nærvær av BDNF, mens RK3E trkB
T695I + BDNF-uttrykkende celler dannet svulster med en betydelig lengre latenstid sammenlignet å RK3E trkB
wt + BDNF-uttrykke celler (Figur S2G). Til tross for noen forskjeller mellom de to cellelinjer, totalt sett, disse funnene tyder på at TrkB
T695I og TrkB
D751N er svekket i trans rotte epitelceller også
in vivo
. Videre verken trkB
L138F eller trkB
P507L viser øket onkogene aktivitet sammenlignet med villtype-trkB.
(A) 1 * 10
6 RIE-1-celler som uttrykker trkB (vill type eller mutant) ble injisert subkutant inn i begge flanker av nakne mus. n = 5 for vekt og P507L, n = 4 for T695I og D751N. (B) 1 * 10
6 RIE-1-celler som uttrykker trkB (villtype eller mutant) ble injisert subkutant inn i begge flanker av nakne mus. n = 4 til begge cellelinjer. (C) 1 * 10
4 RIE-1-celler ko-uttrykker BDNF og trkB (villtype eller mutant) ble injisert subkutant i nakne mus. n = 6 for vekt og P507L, n = 3 for T695I og D751N. (D) 1 * 10
5 RIE-1-celler ko-uttrykker BDNF og trkB (villtype eller mutant) ble injisert subkutant i nakne mus. n = 4 til begge cellelinjer. I alle eksperimentene ble musene avlivet når tumorbyrde nådd 2 cm
2 og Kaplan-Meier-overlevelseskurve er vist. Statistisk signifikans ble bestemt med en log-rank test.
BDNF respons av menneskelig tykktarmskreft-avledet TrkB
T695I og TrkB
D751N uttrykt i tykktarm kreft celler
en mulig forklaring på det svekkede aktiviteten til trkB
T695I og trkB
D751N i analysene beskrevet ovenfor er at vi utførte dem i en aphysiological cellulær kontekst. Faktisk kan kablingen av intracellulære signalnettverk og uttrykket mønster av trkB regulatoriske faktorer som ikke være identisk på tvers av celletyper. Ideelt sett bør man vurdere funksjon av trkB mutanter i sin opprinnelige sammenheng, det vil si i tumorcellene i hvilken de opprinnelig ble identifisert. Det er imidlertid ingen cellelinjer tilgjengelig som uttrykker TrkB
T695I eller TrkB
D751N endogent. Videre til vår kunnskap er det ingen primære humane kolon epitelial cellelinje tilgjengelig. Tar sikte på å benytte en fysiologisk relevant cellesystem, omformet vi COLO 205 og Caco-2 humane tarm karcinomceller med trkB
T695I eller trkB
D751N og oppnådde polyklonale populasjoner som stabilt uttrykker enten reseptoren. Vi stimulert disse cellene med rekombinant BDNF senere måling trkB autofosforylering og aktivering av nedstrøms effektorer. I likhet med det som ble observert i RIE-1-celler, både i COLO 205 og Caco-2-celler, trkB
T695I og trkB
D751N var mindre klink fosforylert enn villtype-trkB ved stimulering med BDNF (figur 6). ERK ble fosforylert ved trkB stimulering bare i Caco-2 celler, men ikke i COLO 205-celler (figur 6C, D). Dette er sannsynligvis fordi COLO 205 celler havn en BRAF
V600E mutasjon (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic), som er konstitutivt aktiv og stimulerer MAPK signal [16]. Ved stimulering av Caco-2 celler med BDNF, verken TrkB
T695I heller TrkB
D751N indusert ERK-fosforylering (figur 6D). Sammen viser disse resultatene at den trkB
T695I og trkB
D751N mutanter er mindre aktive, ikke bare i rotte epitel-celler, men også i to humane tykktarm carcinoma-cellelinjer.
(A) COLO 205-celler og (B) Caco-2-celler som uttrykker villtype eller mutant trkB ble stimulert med 10 ng /ml rekombinant BDNF og analysert for fosfo-tyrosin (pY) innhold ved immunutfelling (IP) og påfølgende immunoblot (IB) analyse. (C) Cellelysater av COLO 205-celler fra (A) og, (D) lysater av Caco-2-celler fra (B) ble analysert for fosfo (p) og total TRK og (p) ERK. Den MEK hemmer U0126 ble brukt for å bekrefte identiteten til Perk signaler. β-actin fungerer som lasting kontroll.
knockdown av endogen TrkB
L138F og TrkB
P507L i humane tumorcellelinjer
Det faktum at TrkB
L138F og trkB
P507L er endogent uttrykt i tumorcellelinjer ga oss mulighet til å undersøke om de er nødvendige for deres onkogene fenotype. Vi utarmet TrkB
L138F og TrkB
P507L fra NCI-H2009 og MDA-MB-435 celler, henholdsvis av RNA interferens med to uavhengige, ikke-overlappende kort hårnål (SH) RNA konstruksjoner. Vi oppnådde ca 75% nedregulering av TrkB i NCI-H2009-celler (figur 7A). Men påvirket dette verken celle morfologi (Figur 7B toppanelet) eller anoikis motstand (figur 7B nedre panelet). Likeledes ~80% nedregulering av trkB i MDA-MB-435 celler (figur 7C) hadde ingen virkning på celle-morfologi (figur 7D øvre panel) og anoikis motstand (figur 7D nedre panel). I samsvar med disse observasjonene E-cadherin nivåer ble ikke endret på TrkB knockdown i enten cellelinje (figur 7E). Videre ble det observert ingen virkning på celleformering (data ikke vist). Til tross for at trkB ikke var fullt utladet i begge cellelinje, tyder disse resultatene på at (mutant) trkB i NCI-H2009 og MDA-MB-435-celler er ikke en viktig drivkraft for deres transformert fenotype.
(A) QRT-PCR viser knockdown av trkB mRNA nivåer med to ikke-overlappende korte hårnåler (sh). Gjennomsnittsverdier av tre uavhengige målinger er vist, Feilstolpene representerer standardavvik. (B) knockdown av TrkB verken påvirker morfologi adherently voksende NCI-H2009 celler, fotografert ved 50x forstørrelse (øverst panel), og heller anoikis motstand av NCI-H2009 celler i suspensjon (nedre panel). ULC plater ble skannet på 1x forstørrelse 6 dager etter såing. (C) QRT-PCR viser knockdown av TrkB mRNA nivåer med to ikke-overlappende korte hårnåler. Gjennomsnittsverdier av tre uavhengige målinger er vist, Feilstolpene representerer standardavvik. (D) knockdown av TrkB verken påvirker morfologi adherently voksende MDA-MB-435 celler, fotografert ved 50x forstørrelse, eller anoikis motstand av MDA-MB-435 celler i suspensjon (nedre panel). ULC plater ble skannet på 1x forstørrelse 6 dager etter såing. (E) knockdown av trkB i NCI-H2009 og MDA-MB-435-celler ikke påvirker E-cadherin proteinnivåer, som bestemt ved immunoblot (IB) analyse. Lange og korte eksponeringer av samme blot vises. β-actin fungerer som lasting kontroll
Diskusjoner
Tre somatiske, ikke-synonyme punktmutasjoner av TrkB har blitt rapportert i sekvenseringsstudier tidlige store i kreft hos mennesker. to i kolorektale svulster, trkB
T695I og trkB
D751N [17], og en i en lunge adenokarsinom cellelinje, trkB
L138F [19]. Det ble identifisert en ytterligere trkB punktmutasjon, trkB
P507L, i MDA-MB-435 humane melanom-cellelinje. Selv om noen av disse mutanter er blitt foreslått som kandidater kreftdrivende gener [17], uventet, vår analyse i rotte epitel-celler og i humane tumorcellelinjer mislyktes i å tilveiebringe støtte for en forsterkning-av-funksjon virkning for noen av de fire trkB punktmutasjoner. Faktisk var de to kolorektale tumoravledet trkB punktmutasjoner i forbindelse med til og med redusert kinase-aktivitet og onkogent potensiale, sammenlignet med villtype-trkB. Som en advarende notat, må man huske på at vi ikke teste med kolorektal kreft-avledet TrkB mutanter i sin opprinnelige sammenheng, nemlig svulster som endogent uttrykker TrkB
T695I eller TrkB
D751N, mens cellelinjer avledet disse er utilgjengelig. Likevel, eksponering for BDNF av både rotte epitel og menneskelige tykktarmskreftceller som uttrykker disse mutantene resulterte i redusert reseptor aktivering av TrkB
T695I og nesten ingen aktivering av TrkB
D751N. Dette tyder sterkt på at disse mutanter har nedsatt enzymatisk aktivitet i sammenheng med BDNF stimulering. Det reiser også muligheten for at TrkB
T695I og TrkB
D751N kan opptre i en dominant negativ måte, og at villtype TrkB kan også ha svulst undertrykkende aktivitet (eller en dobbel funksjon) i tykktarmskreft, men videre studier vil være nødvendig for å løse disse viktige spørsmålene. Vi kan ikke utelukke at responsen TrkB
T695I og TrkB
D751N til andre TrkB ligander kan være forskjellig fra det å BDNF. Vi kan heller ikke formelt utelukke at TrkB
T695I og TrkB
D751N kan ha blitt valgt for i den opprinnelige svulster, bidrar til tumordannelse med funksjoner som er forskjellige fra de vi testet
in vitro
. Disse problemene ikke motstå, vi føler det er riktig å si at disse mutasjonene ikke oppfyller vanlige kriteriene for mutasjons aktivering av reseptorkinasene.
Teoretisk alle mutasjoner bosatt i cytoplasma delen av reseptoren kan påvirke bindingen av adapter proteiner eller substrater av trkB, uavhengig av virkningen på kinaseaktiviteten. Tilstedeværelsen og funksjon av disse bindingspartnere vil avhenge av cellulær kontekst og kan være forskjellig i forskjellige cellelinjer. Selv om det prototypiske mekanisme for onkogen funksjon av tyrosinkinaser er konstitutiv eller forsterket kinaseaktivitet med endret nedstrøms signalisering [37], reseptor-tyrosinkinaser kan ha også kinase-uavhengige funksjoner som bidrar til kreft. Dette er vist for villtype-EGFR, som uavhengig av dets kinaseaktivitet, interagerer med og derved stabiliserer natrium /glukose-ko-transportør 1 (SLGT1) [38]. Nedregulering, men ikke enzymatisk inhibering av EGFR fører til reduserte SLGT1 nivåer, redusert glukoseopptak og autofagi av tumorceller [38]. Om en tilsvarende funksjon er også forbundet med trkB er ikke kjent. En fersk studie antyder at kinase-mangel TrkB-T1 spleisevariant, på kunstig overekspresjon, kan stimulere metastasering av bukspyttkjertelen adenokarcinomceller [39]. Mer forskning er nødvendig for å belyse kinase-uavhengige funksjoner av trkB og deres bidrag til malign sykdom, særlig for å ta opp noen rolle av det endogene protein i kreftceller.
Vi har identifisert og karakterisert også en ny trkB punktmutasjon , trkB
P507L, som vi isolert fra MDA-MB-435 tumorcellelinje.
