Abstract
Galiellalactone er en potent og spesifikk inhibitor av STAT3 signalering som er blitt vist å ha veksthemmende effekt på prostatakreftceller som uttrykker aktiv STAT3. I denne studie forsøkte vi å undersøke effekten av galiellalactone på prostatakreft stamcelle-lignende celler. Vi har utforsket ekspresjon av aldehyddehydrogenase (ALDH) som en markør for kreft stamcelle-lignende celler i forskjellige humane prostatacancercellelinjer og effekten av galiellalactone på ALDH uttrykker (ALDH +) prostata kreftceller. ALDH + subpopulasjoner ble oppdaget og isolert fra de menneskelige prostata kreft cellelinjer DU145 og langsiktig IL-6 stimulert LNCaP celler ved hjelp ALDEFLUOR® analyse og flowcytometri. I motsetning til ALDH- celler, ALDH + prostata kreft celler viste kreft stamcellelignende egenskaper som økt selvfornyende og kolonidannende kapasitet og tumorigenicity. I tillegg ALDH + celler viste en økt uttrykk av mulige prostatakreft stamcellemarkører (CD44 og inte α2β1). Videre ALDH + -celler uttrykte fosforylert STAT3. Galiellalactone behandling reduserte andelen av ALDH + prostata kreftceller og induserte apoptose av ALDH + -celler. Genuttrykket av
ALDH1A1
ble nedregulert in vivo i galiellalactone behandlet DU145 xenografter. Disse funnene understreker at rettet mot STAT3 sti i prostata kreft celler, inkludert prostatakreft stamcelleliknende celler, er et lovende terapeutisk tilnærming, og at galiellalactone er en interessant sammensatt for utvikling av fremtidige prostata kreft narkotika.
Citation : Hellsten R, Johansson M, Dahlman A, Sterner O, Bjartell A (2011) Galiellalactone Hemmer Stem Cell-Like ALDH-Positive prostata kreft celler. PLoS ONE 6 (7): e22118. doi: 10,1371 /journal.pone.0022118
Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 22 desember 2010; Godkjent: 17 juni 2011; Publisert: 11.07.2011
Copyright: © 2011 Hellsten et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den svenske Kreftforeningen, Den Vetenskapsrådet, MAS Cancer Foundation, Holger Knud Christensens Donation, Percy Falck Foundation og Gunnar Nilsson Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostatakreft er den vanligste diagnosen svulst blant menn, og det er et stort behov for nye behandlingsformer mot kastrering resistent prostatakreft [1]. I henhold til kreftstamcelle teori, bare en liten del av kreftceller er i stand til tumorvekst og tilbakefall [2], [3]. Prostata cancer stamceller synes å være resistente mot konvensjonell cancerterapi, og kan derfor være involvert i avanserte prostatakreft og forårsake tilbakefall og metastase [4], [5]. Prostatatumorer består av bare 0,1% stamceller, men unnlater å utrydde denne celle sub-populasjon kan forårsake regenerering av tumor og medikamentresistens og for å forebygge tilbakefall er det viktig å målrette alle celletyper i tumoren [5], [6 ], [7], [8]. Nye målrettet behandling som er rettet mot prostata kreft stamcelleliknende celler er svært berettiget.
I jakten på spesifikke markører for kreft stamceller, har aldehyd dehydrogenase (ALDH) vist lovende som en markør i forskjellige krefttyper, inkludert blære kreft [9], lungekreft [10], hode og nakke plateepitelkarsinom [11], brystkreft [12] og prostata kreft [13], [14]. En høy ekspresjon av ALDH i prostata cancer stamceller har vist seg å være positivt korrelert med Gleason score og inverst korrelert med pasientoverlevelse i prostatakreftpasienter [13]. Høy ALDH-aktivitet har med hell blitt brukt til å identifisere tumor initiere prostatakreftceller og metastaser [14].
Signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) er en viktig transkripsjonsfaktor i mange krefttyper, og det har vist seg å være involvert i legemiddelresistens og for å ha anti-apoptotiske virkninger i prostatakreftceller. Konstitutivt aktiv STAT3 bidrar til Oncogenesis gjennom oppregulering av gener som koder for anti-apoptotiske proteiner, cellesyklus regulatorer og angiogenese stimulatorer, som fører til økt overlevelse og ukontrollert vekst av kreftceller [15]. STAT3 uttrykk er foreslått å være korrelert til ondartet potensial og metastatisk atferd i prostata kreft [16], [17]. Videre har genekspresjon analyse av prostatakreft stamceller avslørte et pro-inflammatorisk fenotype, og at JAK /STAT3-signalveien er aktive i denne cellepopulasjonen [18]. Flere studier markere STAT3 som et gyldig mål for utvikling av nye legemidler for prostatakreft og andre kreftformer [19], [20], [21]. Vi har vist, både
in vivo Hotell og
in vitro
at STAT3 inhibitor galiellalactone besitter veksthemmende effekt på prostatakreftceller uttrykker aktiv, fosforylert STAT3 [22]. Galiellalactone er en metabolitt som produseres av soppen
Galiella rufa
og det har blitt syntetisk fremstilt som tidligere beskrevet [23]. Galiellalactone er en svært potent og selektiv inhibitor av IL-6 signalering gjennom STAT3, og antas å inhibere STAT3 signalering ved å blokkere bindingen av aktivert STAT3 til DNA [24].
I denne studien vi forsøkte å utforske uttrykk for ALDH som en markør for kreftstamcelleliknende celler i ulike menneskelige prostata kreft cellelinjer og effektene av STAT3 inhibitor galiellalactone på ALDH uttrykker prostatakreftceller.
Materialer og metoder
cellekultur
de menneskelige prostata kreft cellelinjer DU145, LNCaP (fra American Type Culture Collection, [ATCC]) og langsiktig interleukin-6 (IL-6) stimulert LNCaP celler (LNCaP-IL6 celler) [25] ble anvendt. Cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. LNCaP-IL6-celler ble opprettholdt i det ovennevnte medium supplert med IL-6 (5 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Alle celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% O
2 og 5% CO
2. Celler ble brukt ved lave passasjer og ikke dyrket i mer enn to-tre måneder. Celler ble rutinemessig testet for mycoplasma og funnet fri for mycoplasma. Cell identitet ble ikke godkjent av forfatterne. Galiellalactone ble utarbeidet av syntese som tidligere beskrevet [23].
ALDEFLUOR analysen og celle sortering
prostata kreftceller (DU145, LNCaP og LNCaP-IL6) ble utsatt for ALDEFLUOR® analysen (StemCell Technologies , Aldagen, Inc., Durham, NC) etterfulgt av strømningscytometri for å påvise celler med høy aktivitet av ALDH (ALDH +). Det aktive reagens Bodipy®-aminoacetaldehyd ble tilsatt til cellene som ble konvertert av ALDH til den fluorescerende Bodipy®-aminoacetat. Den ALDH inhibitor diethylaminobenzaldehyde (DEAB) ble brukt som en negativ kontroll. DU145 og LNCaP-IL6-celler ble behandlet med 0-50 uM galiellalactone i 24 timer og andelen av ALDH + ble analysert med ALDEFLUOR® analysen. DU145 og LNCaP-IL6-celler ble underkastet cellesortering basert på den ALDH-aktivitet ved hjelp av ALDEFLUOR® analysen. ALDH + og ALDH- celler ble sortert ved hjelp av BD FACSAria cellesorterer (BD Biosciences, San Jose, California). Ikke-levedyktige celler ble utelukket ved bruk av 7-amino-actinomycin D farging. ALDH + og ALDH- subpopulasjoner fra DU145 og LNCaP-IL6 celler ble gjenbelagt etter sortering og analysert med ALDEFLUOR® analysen etter en uke i kultur for å undersøke deres selvfornyende kapasitet.
Cytospin og immunhistokjemi
ALDH + og ALDH- celler sortert fra DU145 og LNCaP-IL6 celler ble direkte utsatt for Cytospin eller replated og behandlet med galiellalactone, trypsinert og vasket i PBS før utsatt for cytospin. Cellesuspensjonen ble plassert i en cytospin trakt festet til et objektglass og sentrifugert ved 800 rpm i 2 minutter. Platene ble lufttørket, fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og permeabilisert med 1% Triton-X i Tris-buffer, pH 7,6 i 1 time. Skinnene ble utsatt for immunhistokjemi hjelp Dako Autostainer Plus og ser ™ + kit (Dako). Antistoffene som ble brukt var CD44 (BD Pharmingen), inte α2β1 (Abcam), CD133, (c-PARP), p-STAT3 og p-NF-kB p65 (Cell Signaling Technology).
apoptotiske celler
Ordnet ALDH + og ALDH- celler fra DU145 og LNCaP-IL6 celler ble behandlet med 25 mikrometer galiellalactone for 24 timer, utsatt for Cytospin og farget for apoptotiske markør c-PARP. Et minimum av 500 celler ble tellet fra to separate forsøk, og antallet av merkede c-PARP-celler ble beregnet i forhold til totalt antall celler. Antallet av apoptotiske celler ble uttrykt som en fraksjon av det totale antall celler.
WST-1-celleproliferasjonsanalyse
WST-1 proliferasjonsanalyse ble utført for å studere effekten av galiellalactone på proliferasjon og levedyktigheten til ALDH + og ALDH- celler sortert fra DU145 og LNCaP-IL6 celler. ALDH + og ALDH- celler ble dyrket i 96-brønners plater med en tetthet på 2 000 celler /brønn i 200 ul medium. Celler ble tillatt å sette i 24 timer. Cellene ble behandlet med 0-50 uM galiellalactone i 24 timer. Prøvene ble gjort i triplikat. 20 ul WST-1-løsning (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) ble tilsatt per brønn og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Absorbansen for hver brønn ble målt ved anvendelse av et scanning multi-brønn-spektrofotometer, ELISA-leser med en bølgelengde på 450 nm og referansebølgelengde på 690 nm. Resultatene er presentert som prosent av ubehandlede kontrollceller.
Kloning effektivitet analyse
ALDH + og ALDH- celler sortert fra DU145 og LNCaP-IL6 celler ble dyrket i 24-brønners plater ved en tetthet av 200 celler per brønn. Den kolonidannelse ble målt etter en uke. Kloner ble visualisert med krystallfiolett farging og telles. Kloningen effektivitet ble beregnet som prosent av belagte celler.
prostata tumor xenograft modell
Seks til åtte uker gamle hann nakne mus NMR1 ble holdt på en 12 timers lys-mørke-syklus med adgang til mat og vann
ad libitum
. Eksperimentelle prosedyrer ble godkjent og utført i henhold til retningslinjer fastsatt av Malmö-Lund Etisk Komité for bruk og behandling av forsøksdyr. Nude mus med subkutan DU145 prostatakreft celletransplantater (1 × 10
6 DU145-celler) ble utsatt for daglig i.p. injeksjoner av galiellalactone (1 mg /kg) eller bærer i tre uker [22]. Etter 21 dager ble musene avlivet ved injeksjon ketamin (50 mg /kg) etterfulgt av cervikal dislokasjon og de xenotransplantater ble dissekert ut og umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil videre behandling. Total RNA ble isolert fra frosne DU145 transplantater fra ubehandlede mus (n = 6) og mus behandlet med 1 mg /kg galiellalactone per dag i tre uker (n = 3).
tumorgenisitet assay
ferskt sortert ALDH + og ALDH- populasjoner av DU145 og LNCaP-IL6-celler ble suspendert i serumfritt medium /Matrigel (BD Biosciences) blanding (01:01 volum). Seks til åtte uker gamle mannlige naken NMR1 mus (n = 5) ble injisert med ALDH + eller ALDH- celler subkutant i høyre og venstre flanke av musen, henholdsvis i konsentrasjoner 10 000 eller 100 000 celler per injeksjonsstedet. Tumorvekst ble overvåket under hele eksperimentet. Tumorstørrelse ble målt etter seks uker ved hjelp av et skyvelære, og tumorvolum (ul) ble beregnet ved formelen lengde (mm) x bredde x høyde x 0,5632. Musene ble avlivet med isofluran og halshugging etter 6 ukers.
kvantitativ real-time PCR
genuttrykket av CD44, CD133, inte α2 og ALDH1A1 ble undersøkt med kvantitativ real-time PCR (q-PCR). Cellene ble høstet ved kort sentrifugering direkte etter cellesortering, eller etter behandling med galiellalactone, og pelletene ble lagret ved -80 ° C til RNA-isolering. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av QIAshredder spinnkolonner, og ytterligere anrikning mRNA og ytterligere vasking ble utført ved anvendelse av RNeasy-sett (Qiagen Sciences). For å utelukke DNA-kontaminering, prøver ble DNAse behandlet i 30 min ved hjelp RQ1 RNase-fritt DNAse (Promega). Komplementær DNA (cDNA) ble syntetisert ved hjelp av tilfeldige heksamer og revers transkriptase Hevet II (Invitrogen). Total RNA ble isolert fra DU145 xenotransplantater ved hjelp av Trizol (Invitrogen). Fem mikrogram av total RNA ble oppnådd for cDNA-syntese ved anvendelse av en HPLC-renset Oligo dTprimer med en T7-sekvens.
Kvantitativ real-time PCR ble utført ved anvendelse av 6-20 ng cDNA, 250 nM forover og revers primer i 2 × SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) i en 25 mL reaksjon. Syklusbetingelsene var: 10 min ved 95 ° C for å aktivere enzymet, deretter 40 sykluser med 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 60 sek. Relative uttrykk nivåer ble kvantifisert ved sammenlignende Ct metoden [26] og normalisert til uttrykket av de tre mest stabile interne kontrollgener (
HPRT
,
UBC
, og
YWHAZ
), valgt av geNorm programvare analyse som de mest stabile referansegener. Grunning sekvenser var som tidligere rapportert:
HPRT
,
UBC Hotell og
YWHAZ product: [26],
ALDH1A1 product: [27], CD133 [28], CD44 [29], og integrin α2 [30]. Alle primere ble syntetisert ved Invitrogen og undersøkt for spesifisitet før bruk.
statistikker og
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Statistisk analyse av data ble utført av Dunnetts test eller Student t test med JMP programvare (SAS Institute Inc, Cary, NC). Resultatene ble ansett for å være statistisk signifikant på p. 0,05
Resultater
ALDH uttrykk i prostatakreftcellelinjer
DU145, LNCaP og LNCaP-IL6 celler ble undersøkt for deres ALDH-aktivitet ved hjelp av ALDEFLUOR® analysen og flowcytometri. I DU145-celler 2,62 ± 0,23% av cellene uttrykte høye ALDH-aktivitet (ALDH +), 2,84 ± 0,5% av LNCaP-IL6-celler ble ALDH + og i LNCaP-celler 0,57 ± 0,34% celler viste ALDH-aktivitet (n = 3-4) (Figur 1).
DU145, LNCaP og LNCaP-IL6-celler ble underkastet ALDEFLUOR® assay for å identifisere celler med høy ALDH uttrykket (ALDH +). Den ALDH inhibitor DEAB ble anvendt som en negativ kontroll (venstre panel). Cellene uten inhibitor forskjøvet til høyre ble ansett ALDH + celler (høyre panel).
Karakterisering av isolerte ALDH + celler
Det som kjennetegner ALDH + og ALDH- celle populasjoner isolert fra DU145 og LNCaP-IL6 celler ble undersøkt med hensyn til selvfornyende og kolonidannende kapasitet og tumorigenicity.
sortert ALDH + og ALDH- subpopulasjoner fra DU145 og LNCaP-IL6 celler ble gjenbelagt etter sortering og analysert med ALDEFLUOR ® analysen etter en uke i kultur for å undersøke deres selvfornyende kapasitet. Etter en uke i kultur små populasjoner av ALDH + celler ble oppdaget blant ALDH- DU145 og ALDH- LNCaP-IL6 celler (0,26 ± 0,24% og 0,36 ± 0,05%, henholdsvis n = 2). Men etter en uke i kultur etter sortering, de ALDH + LNCaP-IL6 og ALDH + DU145 cellekulturer reetablert foreldre fenotype og utgjorde en befolkning som ligner på den opprinnelige foreldrenes cellelinje med 2,24 ± 1,23% og 1,24 ± 0,14% ALDH + celler henholdsvis (n = 2).
kolonidannende effektivitet var signifikant større i ALDH + celler sammenlignet med ALDH- celler fra både LNCaP-IL6 og DU145-celler (figur 2A). Den ALDH + kloner dannet var synlig større enn ALDH- kloner. Den tumorgenisitet av ALDH + og ALDH- celler sortert fra ferskt DU145 og LNCaP-IL6-celler ble undersøkt ved å injisere 10 000 eller 100 000 celler subkutant i flanken av nakne mus (n = 5) og tumorvekst ble overvåket ukentlig. ALDH + -celler viste en større svulstdannende evne sammenlignet med ALDH- celler fra både DU145 og LNCaP-IL6-celler og oppdagelsen av palpable tumorer ble forsinket i ALDH- celler (figur 2B). De ALDH + svulstene var betydelig større enn de ALDH- svulster etter seks uker (Figur 2C).
ALDH + cellene vise stamcellelignende egenskaper i form av økt kolonidannende kapasitet og tumorigenicity. A. klonogene analysen. 200 celler /brønn ble kimtilsatt og kolonier ble tellet etter en uke. Clonogenicity ble beregnet som prosent kolonier som dannes i forhold til cellene sådd (n = 2; p 0,05). B. tumorigenitet analysen. Tumor ta etter subkutane injeksjoner av 10 000 eller 100 000 celler av fersk sortert ALDH + og ALDH- celler fra DU145 og LNCaP-IL6 (n = 5). C. Tumor størrelse med ALDH + og ALDH- celle xenografter etter 6 uker (n = 5). ALDH + celle svulster fra 100 000 celler injisert subkutant var betydelig større enn de ALDH- celle svulster både DU145 cellene (p = 0,0002) og LNCaP-IL6 celler (p = 0,0077).
Uttrykk for ulike biomarkører knyttet til stamceller
uttrykk for ulike biomarkører putatively relatert til kreftstamceller ble undersøkt i ferske sortert ALDH + og ALDH- fraksjoner av DU145 og LNCaP-IL6 celler (figur 3). CD44 ble detektert ved immunohistokjemi i både ALDH + og ALDH- celler sortert fra DU145-celler og ekspresjon var mer intens i ALDH + celler sammenlignet med ALDH- celler (figur 3A). CD44 farging ble observert i de fleste ALDH + LNCaP-IL6-celler i motsetning til ALDH- LNCaP-IL6-celler hvor færre celler ble farget for CD44. Inte α2β1 ble uttrykt i både ALDH + og ALDH- celler sortert fra DU145 cellene og uttrykket var mer intens i ALDH + celler i forhold til ALDH- celler. Inte α2β1 ble uttrykt i ALDH + celler fra LNCaP-IL, men bare noen få celler uttrykt inte α2β1 i ALDH- celler. CD133 var ikke påvises i ALDH + og ALDH- celler fra både DU145 og LNCaP-IL6 celler. Ekspresjonen av aktiv STAT3 og NF-kB ble undersøkt i ALDH + og ALDH- fraksjoner av DU145 og LNCaP-IL6-celler (Figur 3A). Økt p-STAT3 ekspresjon ble observert i ALDH + celler sammenlignet med ALDH- celler fra begge cellelinjer. P-NF-kB p65 ble påvist i ALDH + DU145 celler, men ikke i ALDH- DU145, ALDH + LNCaP-IL6 eller ALDH- LNCaP-IL6 celler.
A. Fersk sortert ALDH + og ALDH- celler fra DU145 og LNCaP-IL6 celler ble utsatt for Cytospin og farget for CD44, inte α2β1, p-STAT3 og p-NF-kB p65. B. Den relative mRNA uttrykk av CD44 og inte α2 i ALDH + og ALDH- celler fersk sortert fra DU1145 og LNCaP-IL6 celler.
genuttrykket av CD44, inte α2 og CD133, ble undersøkt med kvantitativ -PCR. (Figur 3B). mRNA uttrykk nivåer av CD44 og inte α2 ble økt i ALDH + celler i forhold til ALDH- celler fra LNCaP-IL6 celler. Det var ingen forskjell i mRNA-nivået av CD44 og integrin α2 i ALDH + og ALDH- celler fra DU145. mRNA nivåer av CD133 var ikke påvises i ALDH + og ALDH- celler fra både DU145 og LNCaP-IL6 celler.
Galiellalactone synker andelen ALDH + celler
DU145 og LNCaP-IL6 celler ble behandlet med galiellalactone (5, 10, 25 eller 50 uM) i 24 timer og underkastet ALDEFLUOR® analyse for å undersøke effekten av galiellalactone på andelen av ALDH + celler i forhold til kjøretøyet. Galiellalactone minsket andelen av ALDH + celler av både DU145 og LNCaP-IL6-celler på en doseavhengig måte (figur 4A). Inkubering med galiellalactone ved 25 uM i 24 timer signifikant reduserte andelen av ALDH + DU145-celler med 51% (p = 0,0013), og andel ALDH + LNCaP-IL6-celler med 75% (p = 0,0441).
A. DU145 og LNCaP-IL6-celler ble behandlet med galiellalactone (5-50 uM) i 24 timer og underkastet ALDEFLUOR® analysen. Andelen av ALDH + celler i betydelig grad redusert på grunn av galiellalactone behandling på en doseavhengig måte. Andelen av ALDH + celler er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 2-4). Andelen av ALDH + DU145-celler ble signifikant redusert ved galiellalactone ved konsentrasjonene 10 uM (p = 0,0060) og 25 uM (p = 0,0013) og 50 uM galiellalactone (s 0,0001). Andelen av ALDH + LNCaP-IL6-celler ble signifikant redusert ved galiellalactone ved konsentrasjonene 25 uM (p = 0,0441) og 50 uM (p = 0,0445). B. Den relative mRNA-ekspresjon av ALDH1A1 i DU145 transplantater i mus behandlet med 1 mg /kg /dag galiellalactone i tre uker. Kontroll mus fikk bilen. Den relative mRNA uttrykk for ALDH1A1 ble redusert i galiellalactone behandlede mus sammenlignet med kontrollgruppen (0,139 ± 0,107 og 0,644 ± 0,161, henholdsvis p = 0,07, n = 3-6).
Galiellalactone reduserer ALDH1A1 mRNA-ekspresjon i DU145 xenotransplantater
Mus med DU145 xenotransplantater ble behandlet med bærer eller 1 mg /kg galiellalactone daglig i tre uker, ble tumorene høstet og genekspresjon ble analysert. MRNA uttrykk for
ALDH1A1
var 4,6 ganger lavere i galiellalactone behandlet xenografter sammenlignet med kontroller (figur 4B).
Galiellalactone hemmer spredning og induserer apoptose av ALDH + celler
Ordnet ALDH + og ALDH- celler fra DU145 og LNCaP-IL6 celler ble behandlet med 25 mikrometer galiellalactone i 24 timer og immunostained for apoptotiske markør c-PARP (figur 5A). ble påvist økt antall c-PARP-positive celler i galiellalactone behandlet ALDH + og ALDH- celler sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5A). Den apoptotiske respons i ALDH + og ALDH- celler sortert fra DU145 og LNCaP-IL6 celler behandlet med 25 mikrometer galiellalactone i 24 timer ble kvantifisert ved å telle c-PARP uttrykke celler (figur 5B). Behandling med galiellalactone økte mengden av c-PARP uttrykkende celler i ALDH + DU145, ALDH + LNCaP-IL6 og ALDH- LNCaP-IL6-celler sammenlignet med ubehandlede kontroller betydelig. De ALDH + -celler viste en større apoptotisk respons på galiellalactone forhold til ALDH- celler som målt ved hjelp av c-PARP-ekspresjon. Men denne forskjellen var ikke signifikant (p = 0,059 for DU145 celler og p = 0,119 for LNCaP-IL6-celler, n = 2). Effekten av galiellalactone på levedyktigheten og spredning av ALDH + og ALDH–celler ble undersøkt (figur 5C). Galiellalactone redusert spredning av både ALDH + og ALDH- celler isolert fra DU145 og LNCaP-IL6-celler på en doseavhengig måte (figur 5C). De ALDH + celler var betydelig mer følsomme for galiellalactone behandling enn ALDH- celler sortert fra DU145 cellene. Men det var ingen signifikant forskjell i følsomhet for galiellalactone mellom ALDH + og ALDH- LNCaP-IL6 celler.
A. ALDH + og ALDH- celler sortert fra DU145 og LNCaP-IL6 celler ble behandlet med 25 mikrometer galiellalactone i 24 timer. Apoptotiske celler ble påvist ved c-PARP-farging. B. Kvantifisering av c-PARP farget apoptotiske celler i ALDH + og ALDH- celler sortert fra DU145 og LNCaP-IL6 celler og behandlet med 25 mikrometer galiellalactone i 24 timer. Behandling med galiellalactone økt betydelig mengden av c-PARP uttrykkende celler i ALDH + DU145, ALDH + LNCaP-IL6 og ALDH- LNCaP-IL6-celler sammenlignet med ubehandlede kontroller (p = henholdsvis 0,019, 0,035 og 0,009; n = 2). Forskjellen i apoptotisk respons mellom galiellalactone behandlet ALDH + og ALDH- celler fra DU145 og LNCaP-IL6-celler var ikke signifikant (p = 0,059 og p = 0,119, henholdsvis; n = 2). C. Galiellalactone redusert levedyktighet ALDH + og ALDH- celler sortert fra DU145 og LNCaP-IL6 celler. De ALDH + DU145-celler var signifikant mer følsomme for galiellalactone sammenlignet med de tilsvarende ALDH- cellene ved 5 jiM (p = 0,0017), 10 pM (p = 0,0010) og 25 uM (p = 0,0019) og 50 uM (p = 0,0025). Resultatene er presentert som gjennomsnitt prosent av ubehandlede kontroll (n = 2).
diskusjon
Prostatakreft stamceller er vist å være androgen uavhengig og mangler ekspresjon av et funksjonelt androgen reseptor [6], [18] som gjør dem immune mot androgen deprivasjon terapi (ADT). I en musemodell av prostatakreft, økt ekspresjon av stamcellemarkører ble observert etter ADT [31]. Videre kreft stamceller er resistente mot dagens cellegift og ALDH uttrykker kreftstamceller har vist motstand mot og berikelse av paclitaxel behandling [32]. Kreften stamcelleegenskaper som langsom vekst, multiresistens, forbedret DNA-reparasjon, høy uttrykk for anti-apoptotiske proteiner [33], og i prostatakreft manglende respons på ADT, gjør disse cellene svært vanskelig å målrette med konvensjonell prostata kreftterapi. Nye behandlingsformer må derfor videreutvikles, for å målrette både svulsten bulk og kreftstamceller.
I denne studien identifiserte vi kreftstamcelleliknende subpopulasjoner i dyrkede prostatakreft cellelinjer som respondert på behandling med STAT3 inhibitor galiellalactone. En liten fraksjon (2-4%) av populasjoner cellelinjen viste høy ALDH-aktivitet. Disse ALDH +-celler viste stamcelle-lignende egenskaper, for eksempel øket kolonidannende og selvfornyende kapasitet og høy tumorigenisitet, så vel som ekspresjon av putative prostatakreftstamcelle markører. Disse cellene responderte på behandling med galiellalactone.
Evnen til å rekonstituere en heterogen masse er en definisjon av kreft stamceller, og vi har funnet at isolerte ALDH + prostatakreftceller var i stand til selvfornyelse og re-etablering av foreldrenes cellelinje og besatt høy tumorigenicity
in vivo Hotell og
in vitro
. Den ALDH + befolkningen i LNCaP-IL6 cellene hadde et høyt uttrykk for den antatte prostata kreft stamceller markører CD44 og inte α2β1 [34] sammenlignet med ALDH- befolkningen. Men vi gjorde ikke oppdage CD133 uttrykk i ALDH + eller ALDH- prostatakreftceller. Dette er i samsvar med fersk undersøkelse utført av Pfeiffer og Schalken [35] antyder at CD133 er ikke en markør for stamceller i prostata kreft cellelinjer. Økt JAK /STAT3 og NF-kB aktivitet er uttrykt i stamceller og tumor initiere stilk-lignende celler i prostata kreft [18], [36] og våre funn av aktiv STAT3 og NF-kB i ALDH + celler er i henhold til dette forslag . Til sammen våre resultater, og andre [14], viser at ALDH uttrykk kan være et middel for å identifisere kreftstamcelleliknende celler i prostata kreft.
kreft stamcelleliknende ALDH + befolkningen var større i lang begrepet IL-6 stimulert LNCaP celler i forhold til LNCaP celler som støtter det syn at prostatakreft stamceller viser en pro-inflammatorisk fenotype [18], [37]. Genekspresjon profilering av prostatakreft stamceller viser at STAT3 signalveien er overuttrykt i disse celler [18] og flere studier peker på STAT3 som et mål for terapeutisk intervensjon i tumor stamceller [38], [39]. Dette er i tråd med det resultatet at den ALDH + stamcelle-liknende celler fra prostatakreftcellelinjer uttrykte aktiv STAT3 og at disse ALDH + celler reagerte på STAT3 inhibitor galiellalactone, som tidligere har blitt vist å indusere apoptose i prostatakreftceller med konstitutiv ekspresjon aktiv STAT3 [22]. Dose-respons relatert reduksjon av andelen av ALDH + celler i DU145 og LNCaP-IL6 cellepopulasjoner og induksjon av apoptose av disse cellene ved galiellalactone behandling tyder på at disse kreftstamcelle-lignende celler er sensitive overfor hemning STAT3. Noteably, DU145 xenografter fra galiellalactone behandlet mus viste redusert genekspresjon av
ALDH1A1
sammenlignet med ubehandlede DU145 xenografter indikerer at galiellalactone kan målrette prostata kreft stamcelleliknende celler også
in vivo
. Vi har tidligere vist at uttrykket av Stat3 relaterte gener
BCL2L1 Hotell og
MCL1
ble nedregulert av galiellalactone noe bekrefter STAT3 hemmende effekt av legemidlet
in vivo
[22].
Andre naturlige produkter foruten galiellalactone har blitt vist å hemme kreft stamceller. Sesquiterpene lakton parthenolid og curcumin er cytotoksisk for kreft stamceller og målrette celler ved å hemme aktiviteten av NF-kB og STAT3 [40], [41]. Målrette det STAT3 sti i prostata kreft stamcelleliknende celler med naturlig produkt avledet forbindelser kan være et lovende terapeutisk tilnærming for utvikling prostata kreft narkotika.
I konklusjonen, prostatakreftcellelinjer inneholdt ALDH + subpopulasjoner med stilk celle- lignende egenskaper som kommer til uttrykk fosforylert STAT3. Disse subpopulasjoner var tydelig hemmet av STAT3 inhibitor galiellalactone. Disse funn understreker at rettet mot det STAT3 reaksjonsveien i prostatakreftceller, inkludert prostata cancer stamcelle-lignende celler, kan være en ny potent behandlingsstrategi i pasienter med fremskreden prostatakreft motstandsdyktig mot ADT og cytotoksisk terapi og det galiellalactone er en viktig forbindelse for å studere STAT3 signalisering i prostatakreft og et potensielt utgangspunkt for utvikling av fremtidige prostata kreft narkotika.
Takk
Ved Institutt for klinisk Sciences, Malmö, Lund University, Skåne universitetssykehus, Malmö, Sverige ønsker vi å takke Susan Evans Axelsson for utmerket hjelp med dyrestudier, Elise Nilsson for å utføre immunhistokjemi og Per-Anders Bertilsson for utmerket hjelp med cellesortering. Vi ønsker også å takke professor Zoran Culig ved Institutt for Urologi, Innsbruck Medical University, Innsbruck, Østerrike for den generøse gaven av LNCaP-IL6 celler.
