Abstract
Bakgrunn
Vi har evaluert den terapeutiske effekten av den histondeacetylase inhibitor PXD101 alene og i kombinasjon med konvensjonell kjemoterapi i behandling av skjoldbruskkjertelkreft.
metodikk /hovedfunnene
Vi studerte åtte cellelinjer fra fire typer skjoldbruskkjertelen (papillær, follikulær, anaplastisk og medullær). Cytotoksisiteten av PXD101 alene og i kombinasjon med tre konvensjonelle kjemoterapeutiske midler (doxorubicin, paklitaksel og docetaksel) ble målt ved anvendelse av LDH-analyse. Western blot vurderes uttrykk for acetylering av histon H3, histon H4 og tubulin, proteiner assosiert med apoptose, RAS /RAF /ERK og PI3K /AKT /mTOR signalveier, DNA skade og reparasjon. Apoptose og intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) ble målt ved strømningscytometri. Mus med flanke anaplastiske skjoldbrusk kreft (ATC) ble daglig behandlet med intraperitoneal injeksjon av PXD101 5 dager per uke. PXD101 effektivt hemmet tyreoideakreft celleproliferasjon på en doseavhengig måte. PXD101 indusert ROS akkumulering og hemmet RAS /RAF /ERK og PI3K /mTOR trasé i følsomme celler. Dobbelt-trådet DNA-skade, og apoptose ble indusert ved PXD101 i både følsomme og resistente cellelinjer. PXD101 veksthemming av 8505C ATC xenografttumorer med lovende sikkerhet. Kombinasjonsbehandling av PXD101with doxorubicin og paclitaxel vist synergistisk effekt overfor fire ATC linjene
i
vitro
.
Konklusjoner
PXD101 undertrykker skjoldbruskkjertelkreft spredning og har synergistisk effekter i kombinasjon med doksorubicin og paclitaxel i behandling av ATC. Disse funnene støtter kliniske forsøk med PXD101 for pasienter med denne sturen sykdommen
Citation. Lin SF, Lin JD, Chou TC, Huang YY, Wong RJ (2013) Utility av en histondeacetylase inhibitor (PXD101) for Thyroid kreftbehandling. PLoS ONE 8 (10): e77684. doi: 10,1371 /journal.pone.0077684
Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR), Italia
mottatt: 16 juni 2013; Akseptert: 3. september 2013, Publisert: 14 oktober 2013
Copyright: © 2013 Shu-Fu Lin. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Chang Gung Memorial Hospital og Chang Gung University (CMRPG3A0161, CMRPG3A0162, CMRPG3A0163, CMRPG370581, CMRPG370582 og CMRPG370583) (https://www.cgmh.org.tw/. https://www.cgu.edu.tw/bin /home.php). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forekomsten av skjoldbruskkjertelkreft har økt de siste tre tiårene over hele verden [1]. Økt deteksjon av små svulster (≤ 1 cm) står for halvparten av økningen, selv om andre årsaker til denne økningen er fortsatt ikke bestemt [2,3]. De vanligste patologiske typer skjoldbrusk kreft stammer fra follikulær (papillær, follikulær, dårlig differensiert og anaplastisk kreft) og parafollicular skjoldbrusk celler (medullær kreft). Pasienter med godt differensiert skjoldbruskkjertelkreft (papillær og follikulær kreft) har vanligvis gunstig prognose. Det er imidlertid begrenset behandling for pasienter som utvikler metastatisk og radiojod-ildfast thyroid kreft, som ofte er uhelbredelig [4]. ATC er en sjelden og vanligvis dødelig kreft, med en median overlevelse på bare seks måneder. Medullær skjoldbruskkjertelkreft (MTC) står for ca 4% av skjoldbrusk maligniteter i USA i 2012. Selv om to kinase hemmere vandetanib og cabozantinib bedre progresjonsfri overlevelse av MTC og ble godkjent av FDA nylig, ingen helbredelig behandlinger er tilgjengelig for metastatisk MTC [ ,,,0],5]. Totalt har dødeligheten av skjoldbrusk kreft vært svakt økende årlig siden 1992 [1]. Nye behandlinger er nødvendig for å forbedre resultatene av pasienter med ildfaste skjoldbruskkreft.
Histone deacetylases (HDACs) fjerner acetyl grupper fra lysinresidier i histone og ikke-histone underlag, inkludert transkripsjonsfaktorer og proteiner som styrer cellesyklus, spredning og apoptose. HDACs er delt inn i 4 klasser ifølge deres homologi til sine gjær orthologues og som synes å være lovende mål for cancerterapi [6-8]. Inhibering av HDACs ved hjelp av små molekyler som induserer multiple biologiske effekter, inkludert ROS akkumulering, cellesyklus-stans, DNA-skade og apoptose som kan føre til cytotoksiske virkninger. Ondartede celler er ansett for å være mer utsatt for HDAC-inhibitorer enn benigne celler [6]. FDA har godkjent to HDAC-inhibitorer suberoylanilide hydroksamsyre (Saha) og depsipeptide i behandlingen av kutan T-cellelymfom.
I thyroid prøver, har ATC høyeste andelen HDAC1 og 2 overekspresjon (80% og 92%), etterfulgt av papillær cancer (61% og 53%) og normal skjoldbruskkjertelen vev (0% for begge), noe som tyder HADC1 og 2 bidrar til skjoldbruskkjertelkreft tumorigenesis og dedifferentiation [9]. I tråd med disse funnene, Na
+ /I
– symporter uttrykk og akkumulering jod kan være forårsaket av HDAC hemmere i dårlig differensiert og udifferensiert tyreoideakreft [10,11]. I tillegg til å fremme celle re-differensiering, HDAC-inhibitorer er i stand til å indusere apoptose i tyreoideacancer [12-14]. Disse funnene antyder at HDAC-inhibitorer har potensial til å behandle kreft i skjoldbruskinduserende gjennom kreftcelle re-differensiering og apoptose. Videre kan kombinasjonsterapi av HDAC-inhibitor med kjemoterapi forbedre terapeutisk virkning mot ATC [14-16]. Derfor HDAC hemmere er potensielle agenter i behandling av pasienter med refraktær skjoldbruskkreft.
PXD101 (belinostat) er en pan-HDAC hemmer med potente cytotoksiske effekt mot en rekke krefttyper gjennom å indusere apoptose, uavhengig av inheritant motstand av kjemoterapi [17,18]. Kombinasjonen av PXD101 med docetaxel viste gunstige effekter i behandling av eggstokkreft og prostata kreft celler [19,20]. Klinisk, kombinert behandling av PXD101, paclitaxel og carboplatin resulterte i delvis respons hos pasienter med solide tumorer i en fase I studie [21]. PXD101 i kombinasjon med doxorubicin har også gode resultater ved behandling av mykvevssarkom i et fase I /II studien [22]. Disse data bedt oss å utforske den terapeutiske effekten av PXD101 i skjoldbruskkjertelen. Vi har også vurdert de kombinasjonseffekter av PXD101 og kjemoterapi i behandling av ATC, den mest aggressive typen skjoldbruskkjertelkreft.
Resultater
Cytotoksisitet og acetylering av histoner H3, histon H4 og tubulin ved PXD101
PXD101 hemmet celleproliferasjon i åtte thyroid kreft linjer i en doseavhengig måte (figur 1A). Disse cellelinjene inkluderte en papillær (BHP7-13), en follikulær (WRO82-1), en follikulær udifferensiert (FRO81-2), fire anaplastic (8305C, 8505C, KAT18, KAT4C) og en medullær (TT) menneskelig skjoldbruskkjertelkreft. PXD101 på 1,25 umol /L trykt på minst 45% av celleveksten i 7 av 8-cellelinjer på dag 4. PXD101 ved 10 umol /L hemmes mer enn 70% cellevekst i follikkelcelleadenom-opprinnelses thyroid kreft linjer, og 95% i parafollicular medullær kreft (TT). Median virkning dose (Dm) fra PXD101 på dag 4, ble beregnet for hver cellelinje (figur 1B). Blant follikulære celler opprinnelsesskjoldbruskkjertelkreft, fire ATC linjene var mer følsomme for PXD101 enn follikulær udifferensierte kreft og godt differensiert kreft (Dm; 8305C = 0,59 mikromol /L, 8505C = 0,93 mikromol /L, KAT18 = 0,87 mikromol /L, KAT4C = 1,13 umol /L, FRO81-2 = 1,71 umol /L, WRO82-1 = 1,33 umol /L, BHP7-13 = 1,49 umol /L). Den Dm av MTC kreft linje TT var 0,33 umol /l. Vi har undersøkt virkningene av PXD101 på tre follikkelcelleadenom-avledet thyroid kreft linjer i følgende studier
A, dose-responskurver ble oppnådd på dag 4 fra celler behandlet med en serie på seks. 1: 1 fortynninger av PXD101. B, Dm av PXD101 på dag 4, ble beregnet ved bruk av CompuSyn programvare for hver cellelinje. Blant sju follikkelcelleadenom-avledet skjoldbrusk kreft linjer, ATC cellelinjer (8305C, 8505C, KAT18 og KAT4C) hadde lavest Dm, etterfulgt av godt differensiert follikulær (WRO82-1) og papillær (BHP7-13) kreft, og follikulær udifferensiert skjoldbruskkjertelkreft (FRO81-2). Medullær skjoldbruskkjertelen kreftceller (TT) hadde også lav Dm. C, PXD101 indusert acetylering av histon H3 og histon H4 på en doseavhengig måte. PXD101 også økt acetylering av tubulin i BHP7-13, WRO82-1 og 8505C.
Histone H3, histon H4 og tubulin kan acetylert ved hemming av HDACs. Virkningene av PXD101 å indusere acetylering av disse proteinene ble evaluert etter 48 timer i 3 cellelinjer som representerer papillær (BHP7-13), follikulær (WRO82-1) og anaplastisk (8505C) i skjoldbruskkjertelen (figur 1C). PXD101 ≥ 0,625 mikromol /L betydelig indusert acetylering av histon H4 og tubulin i alle cellelinjer. PXD101 ≥ 1,25 mikromol /l økt acetylering av histon H3 i WRO82-1 og 8505C. I BHP7-13, acetylert histon H3 dukket opp når høyere dose PXD101 (2,5 mikromol /l) ble brukt. Disse dataene antyder PXD101 er i stand til å undertrykke HDACs.
Effekter av PXD101 på apoptose
BHP7-13, WRO82-1 og 8505C ble utsatt for PXD101 for 48 og 72 timer og sub-G1 celler ble evaluert (Figur 2A). Sammenlignet med kontroll, PXD101 ved 1,25 og 2,5 pmol /l betydelig apoptose som bestemmes av andelen av sub-G1-celler ved 48 og 72 timer i alle cellelinjer.
A, apoptose ble analysert ved måling av DNA innhold ved hjelp av flowcytometri ved 48 og 72 timer. Økende doser av PXD101 indusert høyere andel av sub-G1-celler i alle cellelinjer. B, immunoblot viste PXD101 degradert bøddel caspase-3 i tre cellelinjer.
For å bekrefte apoptotisk effekt, ble caspase-3 evaluert av Western blot etter 48 timers behandling (figur 2B). Høyere doser av PXD101 forårsaket mer degradering av apoptotisk bøddel caspase-3 i BHP7-13 og 8505C. Nedbrytning av caspase-3 ble også observert i WRO82-1 ved behandling med PXD101 på 2,5 umol /l. Disse funnene støtter apoptose er mekanismen for cytotoksisitet av PXD101 i skjoldbruskkjertelen kreftceller.
Effekter av PXD101 på ROS opphopning
Opphopning av ROS av HDAC hemmere regnes som en av de mekanismene som står for cytotoksisitet (6). Vi evaluerte denne virkning ved å bruke 2 «, 7»-Dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) analyser for å påvise intracellulære ROS i celler eksponert for PXD101 i 16 timer (Figur 3A). Sammenlignet med kontrollen, PXD101 på 0,625 mikromol /L økt betydelig DCFH-DA fluorescens i WRO82-1 (163,1 ± 0,8 og 124,3 ± 2,4, P 0,001) og 8505C (135,6 ± 0,9 og 117,1 ± 0,5, P 0,001). Høyere doser av PXD101 indusert mer ROS akkumulering i disse cellene. Men denne effekten ble ikke observert i BHP7-13 som er mindre følsom for PXD101. Lengre eksponering av PXD101 fortsatt ikke klarte å overtale ROS akkumulering i BHP7-13 (24 og 48 timer, data ikke vist). To representative cellelinjer demonstrert evne PXD101 å indusere ROS akkumulering (figur 3B). Disse funnene tyder ROS akkumulering kan ikke gjøre rede for cytotoksisitet av PXD101 i motstandsdyktig skjoldbruskkjertelkreft cellelinje.
A, DCFH-DA fluorescens ble brukt til å måle ROS ved flowcytometri i skjoldbruskkjertelen kreftceller behandlet med PXD101 i 16 timer . Økende doser av PXD101 produsert mer ROS i WRO82-1 og 8505C, men denne effekten ble ikke observert i BHP7-13. B, to cellelinjer representerer evnen til å akkumulere PXD101 ROS. C, viser Immunoblot PXD101 trykt p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr37 /46) og p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) på 8505C. De hemmende effekter ble ikke observert når lav dose PXD101 (0,625 mikromol /l) brukes i BHP7-13 og WRO82-1. D, økende doser av PXD101 økt nedbrytning av KU70, KU80 og RAD51, og økt uttrykk av p-H2AX (Ser139), RAD52 og ERCC1 i BHP7-13, WRO82-1 og 8505C.
Modulation av protein forbundet med RAS /RAF /ERK og PI3K /AKT /mTOR signalveier ved PXD101
RAS /RAF /ERK og PI3K /AKT /mTOR signaliserer overføring er viktig for vekst og overlevelse av skjoldbruskkjertelkreft (4 ). En tidligere rapport viser at en HDAC hemmer kan hemme disse banene på leukemiceller [23]. Vi utforsket effekten av PXD101 på disse banene i BHP7-13, WRO82-1 og 8505C (figur 3C). PXD101 gående trykt p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr37 /46) og p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) på 8505C, som er den sensitive celle linje. PXD101 hadde minimal effekt på p-AKT i BHP7-13 og WRO82-1. Uventet, lav dose PXD101 (0,625 μmmol /L) aktivert p-ERK1 /2 og p-S6 ribosomal protein i BHP7-13 og WRO82-1. p-4E-BP1 ble også økt i WRO82-1. Derfor hemmer PXD101 RAS /RAF /ERK og PI3K /AKT /mTOR signalering kaskader i en følsom cellelinje.
Effekter av PXD101 på DNA-skade og reparere
HDAC hemmere er i stand til å fremme dobbel -stranded DNA pauser (DSB sin) og føre til apoptose [24,25]. Denne mekanismen kan bidra til cytotoksisitet av PXD101 i skjoldbruskkjertelen. Vi evaluerte ekspresjon av proteiner forbundet med DNA-skade og reparasjon i celler behandlet med PXD101 i 48 timer (Figur 3D). p-H2AX (Ser139), en tradisjonell DSB sin markør ble betydelig forbedret med en doseavhengig måte i alle cellelinjer, støtter PXD101 kan indusere DSB sin i skjoldbruskkjertelen kreftceller. Tidligere rapporter viser HDAC hemmere kan undertrykke DNA reparasjons proteiner som bidrar til DSB sin [24-26]. Vi studerte denne muligheten og funnet PXD101 betydelig redusert en ikke-homolog ende bli (NHEJ) DNA-reparasjon protein KU70 i alle cellelinjer (figur 3D). En annen NHEJ protein KU80 ble også undertrykt til en viss grad. Nedbrytning av enten KU70 eller KU80 kan føre til svekkelse av NHEJ reparasjon. Homolog rekombinasjon (HR) reparasjon er en annen viktig DSB sin reparere veien. Vi fortsatte å studere uttrykk for en sentral HR reparasjon protein RAD51 og fant RAD51 ble spesielt undertrykt av PXD101 i alle cellelinjer (figur 3D). Disse dataene antyder at PXD101 kan hemme HR reparasjon. Når den siste avgjørende DSB sin reparasjon maskiner NHEJ og HR ble kompromittert, kan den enkelt-strand DNA gløding (SSA) veien være et alternativ mekanisme for DSB sin reparasjon [27]. Denne muligheten ble undersøkt i denne studien også, og SSA proteiner RAD52 og ERCC1 økt med eksponering for PXD101 eksponering i alle cellelinjer (figur 3D).
Samspill PXD101 og kjemoterapi i ATC celler
virkningen ved å kombinere PXD101 med forskjellige kjemoterapeutiske midler mot ATC-celler ble evaluert. Tre kliniske relevante kjemoterapeutika (doxorubicin, paclitaxel og docetaxel) ble brukt i denne studien [28]. Den Dm av disse midler i hver ATC-cellelinjen ble rapportert tidligere [29]. Interaksjoner mellom PXD101 og doxorubicin, paclitaxel og docetaxel ble evaluert. Kombinasjonen av PXD101 og hver kjemoterapeutisk middel demonstrert gunstig terapeutisk effekt i alle ATC kreft linjer (figur S1).
Interaksjoner mellom PXD101 og kjemoterapeutika ble vurdert ved å beregne kombinasjon index (CI) ved Chou-Talalay ligning ( Figur 4A), hvor CI 1 indikerer synergisme, CI = 1 viser en vanedannende effekt og CI 1 indikerer antagonisme [30,31]. Synergieffekter ble anerkjent for kombinasjonen av PXD101 med doxorubicin og PXD101 med paclitaxel i alle ATC linjer (KI; 8305C = 0,52 til 0,98 og 0,68 til 0,91, 8505C = 0,32 til 0,39 og 0,03 til 0,58, KAT18 = 0,61 til 0,76 og 0.18- 0,94, KAT4C = 0,51 til 0,69 og 0,68 til 0,71 henholdsvis). Kombinasjonen av PXD101 med docetaxel var synergistisk i 8305C, 8505C og KAT4C (KI; 8305C = 0,83 til 0,84, 8505C = 0,04 til 0,42, KAT4C = 0,42 til 0,76). Kombinasjonen av PXD101 med docetaxel varierte fra synergistisk å antagonist i KAT18 (CI, 0,1 til 1,2). Disse resultater viser at kombinasjonen av PXD101 med doksorubicin og paklitaxel har synergistisk effekt overfor alle ATC linjer, og kombinasjonen av PXD101 med docetaxel er synergistisk i tre av fire linjer. Vi beregnet dosereduksjon indeks (DRI) for hver kjemoterapeutiske agent; DRI indikerer fold av medikamentdosereduksjon i nærvær av PXD101 (figur 4B). Under eksponering for PXD101, kan doser av doxorubicin, paclitaxel og docetaxel reduseres (alle DRI 1,0).
En ble CI av PXD101 med hver kjemoterapeutika beregnet ved hjelp CompuSyn programvare for hver ATC cellelinje. PXD101 pluss doxorubicin og paclitaxel demonstrert synergieffekter i alle cellelinjer, med CI 0.8 på de fleste forhold. PXD101 pluss docetaxel var synergistisk i 8305C, 8505C og KAT4C, og synergistisk å antagonistisk i KAT18. De horisontale stiplede linjer på CI = 1 ble trukket. B, de typiske områdene av DRI verdier for kjemoterapi i kombinasjon med PXD101. Med tilstedeværelse av PXD101, doksorubicin, paclitaxel og docetaxel alle hadde gunstig DRI. Det laveste DRI av doksorubicin, paclitaxel og docetaxel alle dukket opp i KAT18 (1.8, 1.5 og 1.6, respektivt). De horisontale stiplede linjer på DRI = 1 ble trukket.
PXD101 behandling av murine flanke svulster
Den terapeutiske effekter og sikkerhet av PXD101
in vivo
ble evaluert i atymiske nakne mus med flanke ATC 8505C og TT xenografter. Mus med etablerte flanke tumorer ble behandlet med intraperitoneal PXD101 (40 mg /kg) eller bærer daglig i 5 doser pr uke til 14 dager (Figur 5A). PXD101 betydelig undertrykt 8505C tumorveksten sammenlignet med kontrollgruppen på dag 7 (1,7 ± 0,1 ganger og 3,4 ± 0,5 fold, P = 0,004) og dag 14 (3,6 ± 0,3 ganger og 6,6 ± 1,0-fold, P = 0,014). PXD101 hadde ingen signifikante effekter for å endre kroppsvekt i løpet av studieperioden (figur 5B). Vi observerte ikke noen sykelighet i disse dyrene.
En daglig intraperitoneal injeksjon av PXD101 for 5 dager per uke trykt 8505C tumorvekst. Forskjellene i tumorvolumøkning mellom PXD101 og kontrollgruppen nådde statistisk signifikans på dager 7 og 14. B, PXD101 ikke føre til betydelig vekttap hos mus (P 0,05). C, innen 3 timer, økt PXD101 fosforylering av H2AX og acetylering av histoner H3 og H4, og undertrykt p-AKT, RAD51, caspase-3 og PCNA. De endringer av disse proteinene svekket av 6-16 timer.
De proteiner som kan bli berørt av PXD101 ble evaluert i disse dyre tumorer (figur 5C). En enkelt intraperitoneal injeksjon av PXD101 (40 mg /kg) øket p-H2AX (Ser139) og acetylering av histon H3 og H4 ved 3 timer og effekten redusert av 6 timer. RAD51 ble undertrykt av 3 timer, og det dukket opp igjen på 6 til 24 timer (figur 5C, Figur S2). p-AKT (Ser473) ble gradvis fortrengt ved 3 og 6 timer, og denne inhiberende effekt var fraværende etter 16 timer. Markøren spredning prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) ble noe redusert fra 3 til 6 timer. PXD101 betydelig redusert caspase-3 på 3 til 6 timer. Disse dataene viser at PXD101 hadde robuste, men forbigående effekter i ATC xenografter, og foreslår at hyppigere administrasjon av PXD101 kan forsterke terapeutisk effekt.
Diskusjoner
PXD101 effektivt hemmet spredning av åtte skjoldbrusk kreft cellelinjer stammer fra fire store histologiske typer. Blant sju skjoldbrusk kreft linjer, ATC var mer følsomme enn follicular og godt differensiert kreft. Disse funnene tyder på at ATC avhenger sannsynligvis på HDACs mer enn de andre krefttyper. TT har også en lav Dm, noe som tyder på HDACs er viktig for parafollicular skjoldbruskkjertelen kreftceller. PXD101 hemmer et bredt spekter av HDACs, inkludert klasse I, IIa og IIb som hindrer å konkludere som HDAC er mer viktig i overlevelse av skjoldbrusk kreft.
En terapeutisk mekanisme HDAC hemmere ved behandling av malignitet er gjennom induksjon av apoptose. PXD101 forårsaket apoptotiske effekter i en dose- og tidsavhengig måte i BHP7-13, WRO82-1 og 8505C, noe som tyder på at denne mekanismen står for terapeutisk effekt av PXD101.
Tidligere rapporter viser HDAC hemmere reduserer thioredoxin aktivitet, akkumuleres ROS og fører til apoptose i transformerte celler, men ikke i normale celler [6,32]. Derfor kan ROS akkumulering i ondartede celler være en mekanisme av cancer-spesifisitet cytotoksisitet av HDAC-inhibitorer. I denne studien PXD101 akkumulert ROS på en doseavhengig måte i WRO82-1 og 8505C, men ikke i den resistente cellelinje BHP7-13. Disse observasjonene er i samsvar med denne mekanismen av følsomhet for HDAC hemmere.
RAS /RAF /ERK og PI3K /AKT /mTOR signalveier er viktig for skjoldbruskkjertelkreft tumorigenesis, progresjon og overlevelse [4,33]. Avbrudd av disse signalveier er en strategi for å behandle skjoldbrusk kreft [29,34]. I denne studien PXD101 hemmet disse banene i den sensitive cellelinjen 8505C, men ikke i WRO82-1 og BHP7-13. Dataene antyder at evnen til å inhibere PXD101 RAS /RAF /ERK og PI3K /AKT /mTOR veier kan gi følsomhet.
p-H2AX er en klassisk markør av DSB, en alvorlig form for DNA-skade [35 ]. PXD101 betydelig indusert p-H2AX i tre skjoldbrusk kreft cellelinjer, støtter DSB sin som en mekanisme regnskap for cytotoksisitet av PXD101. Vi viser at PXD101 reduserer DSB sin reparasjons proteiner i NHEJ (KU70 og KU80) og HR (RAD51) veier. For NHEJ, gjenkjenner KU70-KU80 heterodimer DSB sin, og rekrutterer en DNA-protein kinase kompleks. Den reduserte uttrykk for KU70 eller KU80 kan forringe NHEJ reparasjon pathway [27,36]. For HR, RAD51 binder seg til resected slutten av enkelttrådet DNA (RAD51-ssDNA nucleoprotein filament), noe som åpner for syntese avhengig tråd annealing for DSB reparere [37]. En analyse av omfanget av bidrag fra hvert av HR-proteiner til DNA-reparasjon og fant at uttømming av RAD51 induserer den mest signifikante HR defekt [37,38]. SSA veien er en alternativ mekanisme for DSB sin reparasjon når NHEJ og HR er defekte [27,39]. PXD101 økt RAD52 og ERCC1, noe som tyder på SSA veien ble aktivert. Men når p-H2AX økes, synes aktivering av SSA utilstrekkelig for å reparere DSB sin [40]. I tillegg til PXD101, andre HDAC hemmere er i stand til å undertrykke DSB reparasjon proteiner [41-43]. Noen HDACs er ansvarlig for DNA-reparasjon; HDAC1 og to fremme NHEJ, og HDAC 9 og 10 er nødvendig for HR [44,45].
PXD101 behandling betydelig undertrykt 8505C tumorvekst i løpet av studieperioden. PXD101 forbigående økt acetylering av histon H4 som er konsistent med tidligere rapport [17]. Økning av p-H2AX antyder PXD101 indusert DSB sin i 8505C xenografter. Anti-tumoreffekten til PXD101 kan være ved apoptose og inhibisjon av proliferasjon siden caspase-3 og PCNA ble redusert. Ingen signifikant vekttap eller toksisitet observert i denne studien, noe som tyder på en fordelaktig sikkerhetsprofil. Vi undersøkte også den terapeutiske effekten av PXD101 i mus med TT svulster. Daglig intraperitoneal injeksjon av PXD101 (40 mg /kg) i 5 doser pr uke mislyktes i å undertrykke veksten av TT-xenotransplantater (data ikke vist). Det er mulig at en mer intensiv PXD101 behandling diett kan påvirke veksten av TT xenografter.
ATC er den mest aggressive i skjoldbruskkjertelen, og er vanligvis dødelig, med en 1-års overlevelse på bare 20% [28] . Nye behandlingsformer for å forbedre dystre resultater. Vi har funnet at kombinasjonen av PXD101 med doksorubicin og PXD101 med paklitaxel hadde synergistisk effekt overfor fire ATC cellelinjer. Tidligere rapport viser heterogenitet av cancerceller vises til og med i en enkelt svulst [46]. Derfor kan kombinasjonsregime med synergieffekter mot flere ATC cellelinjer som har variert genetisk bakgrunn være av klinisk betydning. Doxorubicin hemmer topoisomerase II og fører til brudd i genomisk DNA [47]. PXD101 hemmet dobbeltkjedet DNA-reparasjon av veier som kan forsterke cytotoksisiteten av doksorubicin. Paclitaxel har vist en 53% svarprosent mot ATC i en fase II studie [48]. De gunstige kombinasjonseffekter av PXD101 med paclitaxel støtte vurdering av bruk av denne behandlingen hos pasienter med ATC.
Nylig Chan et al. rapporterte også at PXD101 retarderer veksten av PTC xenografttumorer [49]. PXD101 har derfor en evne til å hemme veksten av både er godt differensiert og udifferensiert tyreoideakreft
in vivo
. Disse data styrker muligheten for at PXD101 kan anvendes for å behandle pasienter med denne dødelig sykdom. I kontrast til våre funn PXD101 gående trykt p-AKT (Ser473) og p-ERK i den tidligere undersøkelsen. En mulig forklaring på dette avviket mellom to studier er den svært høy dose av PXD101 (≥ 20 ganger) som ble brukt i tidligere studie som sammenlignet med vår nåværende studie. Slike høye doser av PXD101 er mer sannsynlig å undertrykke p-AKT og p-ERK. Vår undersøkelse viser også at flere molekylære hendelser indusert av PXD101 kan føre til cytotoksisitet, og viser effekten av kombinasjonsbehandling med PXD101 med konvensjonell kjemoterapi for tiden er i bruk for anaplastisk thyroid kreft. Viktigere, viser vi synergieffekter av kombinasjonen PXD101 med doksorubicin og paclitaxel, noe som tyder på sannsynlig klinisk betydning ved behandling av pasienter med ATC.
I konklusjonen, PXD101 pålagt betydelig cytotoksisitet i fire store histologiske typer skjoldbruskkjertelkreft. Nude mus med 8505C xenografttumorer demonstrerte de terapeutiske effekt og sikkerhet profiler av PXD101. Viktigere, PXD101 forbedrer synergistisk terapeutisk effekt av doksorubicin og paclitaxel mot fire ATC cellelinjer. Disse gunstige data støtter utformingen av fremtidige kliniske studier som studerer nytten av PXD101 som et middel til å behandle pasienter med avansert skjoldbruskkreft.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Åtte veletablerte skjoldbrusk kreft cellelinjer ble studert, inkludert en papillær (BHP7-13), en follikulær (WRO82-1), en follikulær udifferensiert (FRO81-2), fire anaplastic (8305C, 8505C, KAT18, KAT4C) og en medullær (TT) menneskelig skjoldbruskkjertelkreft [29,50-52]. Alle cellelinjer unntatt KAT4C ble autentisert ved hjelp av DNA (korte tandem repetisjoner) profilering og lagres i flytende nitrogen før bruk [29,53]. BHP7-13, WRO82-1, FR081-2, KAT4C og KAT18 ble opprettholdt i RPMI 1640 med natriumbikarbonat (2,0 g /l). 8505C og 8305C ble opprettholdt i MEM med natriumpyruvat (1 mmol /L) og natriumbikarbonat (2,2 g /l). TT ble opprettholdt i F12K. Alle medier inneholdt 10% FCS, 100.000 enheter /l penicillin og 100 mg /l streptomycin. Alle celler ble opprettholdt i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 37 ° C.
farmakologiske midler
PXD101 er en pan-HDAC-inhibitor som er beskrevet tidligere [17], og ble oppnådd fra Selleck Chemicals. PXD101 ble oppløst i DMSO (10 mmol /l
in vitro
og 100 mg /ml til
in vivo-studier
; Sigma) og lagret ved -30 ° C inntil eksperimenter. For
in vivo
studier ble PXD101 ytterligere fortynnet med PBS til en sluttkonsentrasjon på 8,6 mg /ml. Doxorubicin, paclitaxel og docetaxel ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. Doxorubicin (5 mmol /liter) ble oppløst i PBS, paclitaxel (320 umol /L) og docetaxel (640 umol /l) ble oppløst i DMSO og lagret ved -30 ° C inntil bruk.
Antistoffer
Antistoffer rettet mot acetyl. histon H3 og histon H4 var fra EMD Millipore. Acetyl. tubulin og α-tubulin-antistoffer var fra Sigma. Caspase-3, p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr37 /46), p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236), p-H2AX (Ser139) , KU70, KU80, RAD52, ERCC1 og PCNA antistoffer var fra Cell Signaling. RAD51 antistoff var fra Invitrogen.
cytotoksisitetsanalyser
Celler ble sådd ut i 2 x 10
3 til 2 x 10
4 celler per brønn i 24-brønners plater i en mL media. Etter inkubering over natten, ble PXD101 eller kjøretøy tilsatt ved den angitte konsentrasjon. Seks serie 1: 1 fortynninger av PXD101 ble testet som starter på 10 mikromol /l over en 4-dagers behandlingsforløpet. Cytotoksisitet ble bestemt på dag 4. Cellene ble vasket med PBS og lysert med Triton X-100 (1,35%, Sigma) for å frigi intracellulære laktatdehydrogenase (LDH), som ble kvantifisert med en Cytotox 96 kit (Progmega) ved 490 nM ved hjelp av spektrofotometri (BT-MQX200R, Bio-Tek Instruments). Hvert forsøk ble utført i tre paralleller og resultatene er vist som prosentandelen av overlevende celler bestemmes ved å sammenligne den LDH av hver prøve i forhold til kontrollprøver som betraktes som 100% levedyktighet. Dm på dag fire ble beregnet for hver cellelinje ved hjelp CompuSyn programvare [30,31].
For kombinasjonsbehandling eksperimenter, ble ATC celler behandlet med PXD101 og en kjemoterapeutisk stoff (doxorubicin, paclitaxel eller docetaxel) i en fast doseforholdet. Celler ble inkubert med bærer, PXD101, kjemoterapeutisk middel, eller begge deler samtidig i en 4-dagers og cytotoksisitet ble målt. Seks til sju serie 1: 1 fortynninger ble undersøkt på følgende startdoser for 8305C, 8505C, KAT18 og KAT4C: PXD101 på 2,4, 3,6, 3,6 og 4,4 mikromol /L, doxorubicin ved 0,64, 0,16, 0,22, 0,27 mikromol /L, paclitaxel ved 50,8, 22,4, 17,6 og 13,2 nmol /L, docetaxel på 34,4, 6,8, 5,2 og 7,6 nmol /L, henholdsvis. Dosene valgt var basert på Dm bestemt i denne og tidligere studier [29].
Western blot
Celler ble belagt på 1 x 10
6 celler i 10-cm petriskåler i 10 ml media over natten og behandlet med PXD101 eller vehikkel i 48 timer. Cellepelletene ble oppløst i radio-immunutfelling assaybuffer, og protease-inhibitor cocktail, vortex-blandet og klaret ved sentrifugering. Totalt protein (20-50 ug) ble elektroforert på 10-12% Tris-HCl geler, overført til polyvinylidendifluorid-membraner, blokkerte, og utsatt for primære antistoffer, etterfulgt av et sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase. Signaler ble utviklet ved hjelp av en forbedret chemiluminescence kit (Bionovas bioteknologi). α-tubulin tjente som lasting kontroll.
apoptose og ROS vurdering
Celler ble sådd ut i 1 x 10
5 celler per brønn i 6-brønners plater i 2 ml media over natten og behandlet med placebo eller PXD101 ved angitte doser på 48 og 72 timer. Flytelegemer og trypsinisert adherente celler ble samlet opp, vasket med PBS, fiksert med kald 70% etanol og inkubert med RNase A (100 ug /ml; Sigma) og propidiumjodid (5 ug /ml, Sigma) ved 37 ° C i 15 min . Apoptotiske sub-G1-celler ble påvist ved DNA-innhold ved hjelp av flowcytometri (BD FACSCalibur Flowcytometer, BD Biosciences).
Celler ble sådd ut i 1 x 10
5 celler per brønn i 6-brønners plater i to ml medium i 24 timer og behandlet med placebo eller PXD101 ved angitte doser i 16 timer. Trypsinisert adherente celler ble samlet opp og inkubert med 10 pmol /L DCFH-DA (Sigma) ved 37 ° C i mørke i 30 minutter. 0,05.
