Abstract
microRNAs (mirnas) er korte, ikke-kodende RNA som regulerer en rekke cellulære funksjoner ved å undertrykke mål protein uttrykk. Vi antok at et sett av mikroRNA regulere tumorrespons til hypoksi ved å hemme komponenter av hypoksi signalveien. Vi fant at MIR-22-ekspresjon i humane tykktarmskreft er lavere enn ved normal tykktarm vev. Vi fant også at Mir-22 styrer hypoksi induserbar faktor 1α (HIF-1α) uttrykk i HCT116 tykktarmskreft cellelinje. Over-uttrykk for MIR-22 hemmer HIF-1α uttrykk, undertrykker vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) produksjon under hypoksi. Motsatt, knockdown av endogen MIR-22 forbedrer hypoksi-indusert ekspresjon av HIF-1α og VEGF. Den kondisjonerte medium fra celler over-uttrykker Mir-22 inneholder mindre VEGF protein enn kontrollcellene, og også indusere mindre endotelial cellevekst og invasjon, noe som tyder på MIR-22 i tilstøtende celler påvirkninger endotelceller funksjon. Til sammen våre data tyder på at Mir-22 kan ha en anti-angiogen effekt i tykktarmskreft
Citation. Yamakuchi M, Yagi S, Ito T, Lowenstein CJ (2011) mikroRNA-22 Regulerer Hypoksi signale i Colon kreft celler. PLoS ONE 6 (5): e20291. doi: 10,1371 /journal.pone.0020291
Redaktør: Costanza Emanueli, University of Bristol, Storbritannia
mottatt: 18 januar 2011; Godkjent: 24 april 2011; Publisert: 23. mai 2011
Copyright: © 2011 Yamakuchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av American Heart Association stipend (0835446N) (MY) og NIH stipend (CJL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er korte ikke-kodende RNA (18-22 nt), som hemmer genuttrykk. Moden mirnas er produsert av RNase III enzymer drosha og dicer, deretter innlemme i den RNA-induserte stanse kompleks (RISC), og til slutt bindes til den 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) av sine målgen mRNA, inhibering av sin uttrykk [1], [2]. Det antas at påfølgende baseparing på minst 7 nukleotider mellom miRNA sekvens (seed-sekvens) og miRNA anerkjennelse element (MRE) er nødvendig for å undertrykke proteintranslasjon [3], [4], [5], [6], [7]. I tillegg har enkelte studier tyder på at ufullstendig binding som slingringer eller buler i frøet sekvensen hemmer protein oversettelse [8], [9].
mirnas har en rekke fysiologiske og patologiske funksjoner, herunder kontroll av tumorigenesis [ ,,,0],10], [11], [12]. Transkripsjonsfaktor hyppigst muterte i kreft, p53, regulerer et sett av miRNAs. Aktivering av p53 øker MIR-34a produksjon, og over-uttrykk for MIR-34a induserer cellesyklus arrest, alderdom og apoptose. En annen transkripsjonsfaktor knyttet til kreft, c-myc, regulerer et separat sett av miRNA. C-myc reduserer uttrykket av flere mirnas inkludert Mir-22 i kreftcellelinjer [13]. Nyere studier viser at Mir-22 retter seg mot flere proteiner som østrogen reseptor a (ERA), c-myc bindende protein (MYCBP), Myc forbundet faktor X (MAX), og PTEN, noe som tyder på at MIR-22 kan være innblandet i tumorigenesis. Imidlertid funksjonen av MIR-22 i kreftceller er ukjent.
hypoksi induserbar faktor 1 (HIF-1) er et heterodimert transkripsjonsfaktor som regulerer transkripsjon av gener så som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) [14], [15], [16]. HIF-1 er en heterodimer som består av to subenheter, HIF-1 a og HIF-1 p (ARNT). Hypoksi eller hypoksi etterligninger stabil HIF-1α ved å hemme prolyl hydroksylering. HIF-1 er involvert i angiogenese, invasjon, metastase, glukoseopptak og metabolisme i kreftceller [17]. Hypoksi i tumorer kan fungere som en utløser for angiogenese for å gi økt oksygen til kreft. HIF-1α uttrykket er assosiert med dårlig prognose i tykktarmskreft og bukspyttkjertelkreft [17], [18], [19].
Vi har nå identifisere HIF-1α som et mål for MIR-22 i et tykktarmskreft cellelinje. Vi finner at Mir-22 nivåer i menneskelig tykktarmskreft er lavere enn ved normal tykktarm vev. Siden tykktarmskreft prøver med lavere Mir-22 viser høyere VEGF uttrykk, hypotese vi at Mir-22 regulerer hypoksi signalering i tykktarm kreft cellelinjer.
Resultater
Uttrykk av MIR-22 i tykktarmskreft
først brukt Northern blotting for å måle MIR-22 ekspresjon i humane vev, og fant at MIR-22 uttrykkes i de fleste vev, men relativt tallrike i hjerte, glatt muskulatur, blære, og fettvev (fig. 1A). Vi neste undersøkte uttrykk for MIR-22 i flere kreftcellelinjer. Vi kunne påvise MIR-22 i tre kolon kreft cellelinjer, HCT116, HCT116 p53 KO og HT29, og også i en epitelial kreft cellelinje, HeLa (Fig. 1B). For å undersøke nivået av MIR-22 i tykktarmskreft, målte vi MIR-22 uttrykk ved qPCR i 9 humane tarmkreft prøver og 9 normale tykktarm vev fra pasienter ved The Johns Hopkins Hospital. Ekspresjon av MIR-22 er lavere i tykktarmskreft prøver (P = 0,02) (fig. 1C). Siden vi er interessert i å studere hvordan mikroRNA regulere tumor angiogenese, vi også målt VEGF mRNA uttrykk i de samme prøvene og fant at VEGF mRNA uttrykk i tykktarm kreft prøver er høyere enn i vanlige kolon prøver (P = 0,03) (Fig.1C) . Vi fant også at RNA nivåer av MIR-22 og VEGF er negativt korrelert (P 0,05) (figur 1D.)
(A) MiR-22 uttrykk i normale menneskelige vev.. En kommersiell membran som inneholder RNA fra normale menneskelige vev ble undersøkt for MIR-22 ved hjelp av Northern analyse. (B) MiR-22 ekspresjon i cellelinjer. Cellelysater ble analysert for MIR-22 ved Northern blotting. (C) MiR-22 og VEGF-ekspresjon i normalt humant vev og humant kolon kreft i tykktarmen. RNA ble ekstrahert fra 9 normale humane tykktarm prøver (hvit) og fra 9 humane tarmkreft prøver (svart), og analysert ved hjelp av qPCR for MIR-22 og VEGF ekspresjon (n = 9 ± S.D.). Tykktarmskreft prøvene inneholder mindre MIR-22 og mer VEGF enn normalt kolon prøver. (D) Foreningen av MIR-22 og VEGF i menneskets tykktarm kreft. Naturlig log transformasjon av relative forholdet mellom RNA for MIR-22 og VEGF ble brukt for statistisk analyse (n = 30).
HIF-1α er et mål på MIR-22
siden HIF-1α er en del av et større oksygenføle vei, vi søkte etter potensielle miRNA som kan styre HIF-1α oversettelse ved hjelp av beregningsorientert analyse (Menneske miRNA Targets på Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Computational Biology nettsiden http: //cbio. mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl), og fant at MIR-22 frø sekvensen matcher 3 «UTR av HIF-1α (7 nukleotider kamper inkludert en slingre kamp). Vi utforsket hvordan Mir-22 regulerer HIF-1 og hypoksi signale hjelp HCT116 kolon kreftceller som en in vitro modell for hvordan kreftceller svare på hypoksi. For å undersøke om Mir-22 regulerer HIF-1α protein uttrykk, transfektert vi HCT116-celler med pre-MIR-22 for over uttrykk for MIR-22 og med anti-sense-MIR-22 for knockdown av MIR-22. Transfeksjon av pre-MIR-22 i HCT116 økt MIR-22 nivåer mer enn 10 ganger (fig. 2A). Knockdown av MIR-22 ved trans med anti-sense-MIR-22 sank Mir-22 nivåer ned til 40% (Fig. 2A). Hypoksi øket HIF-1α ekspresjon i HCT116, som forventet (fig. 2B). Men over-uttrykk for MIR-22 hemmet hypoksi-indusert HIF-1α uttrykk i HCT116 og HT29 (Fig. 2B-D). I motsetning til dette, knockdown av MIR-22 forbedret HIF-1α til uttrykk under hypoksi (fig. 2C-D). Over-ekspresjon av MIR-22 forandret ikke graden av HIF-1β, dimerisering partner av HIF-1α (figur S1). Disse studiene viser at endogen MIR-22 hemmer HIF-1α.
(A) Endring av MIR-22 uttrykk ved transfeksjon. HCT116-celler ble transfektert med forhånds MIR-22 eller anti-sense-MIR-22 eller kontroll-oligonukleotider, og nivåene av MIR-22 ble målt ved qPCR. (B) Over uttrykk for MIR-22 hemmer HIF-1α uttrykk. HCT116-celler ble transfektert med kontroll-oligonukleotider eller pre-MIR-22, og deretter utsatt for normoxia eller hypoksi i 16 timer. Cellelysater ble immunblottet for HIF-1α. Hypoksi induserer HIF-1α, men MIR-22 undertrykker HIF-1α. (C) To tykktarmskreft cellelinjer, HCT116 (to øverste panelene) og HT29 (to nederste paneler), ble transfektert med pre-MIR-22 eller anti-sense-MIR-22, utsatt for hypoksi, og cellelysater ble immunblottet for HIF-1α. (D) Kvantifisering ved densitometri av immunoblotting for HIF-1α i HCT116-celler transfektert som ovenfor (n = 3 ± S.D.).
mikroRNA kan regulere genuttrykket ved å undertrykke oversettelse. Over-ekspresjon eller knockdown av MIR-22 endret ikke ekspresjon av HIF-1α mRNA, noe som antyder at MIR-22 regulerer HIF-1α oversettelse, men ikke transkripsjon (fig. 3A). Menneskelig HIF-1α 3 «UTR har et potensial bindingssete for MIR-22 (Fig. 3B). For å utforske den mekanismen som MIR-22 regulerer HIF-1α, har vi gjort et luciferase reporter vektor, som inneholder et fragment av den 3 «UTR fra HIF-1α (som strekker seg etter stoppkodonet 0-401 bp) som inneholder en MIR -22 bindingssete. Vi kotransfektert HCT116-celler med denne reporteren vektor og med pre-MIR-22 eller kontroll. Over-uttrykk for MIR-22 redusert luciferase aktivitet (Fig. 3C venstre). Men MIR-22 ikke påvirke uttrykket av luciferase med en mutert Mir-22 bindende elementer (Fig. 3C høyre), noe som tyder på at MIR-22 hemmer HIF-1α uttrykk via interaksjon med 3 «UTR av HIF-1α.
(A) MiR-22 påvirker ikke HIF-1α mRNA. HCT116-celler ble transfektert med Pre-MIR-22 eller anti-sense-MIR-22 eller kontroll. Totalt RNA ble høstet og analysert for HIF-1α mRNA ved qPCR (n = 3 ± S.D.). (B) Menneskelig HIF-1α 3’UTR inneholder et bindingssete for MIR-22. (C) MiR-22 undertrykker trans av HIF-1α 3’UTR. HCT116-celler ble transfektert med en luciferase reporter vektor (MiRreport) som inneholder 3 «UTR av HIF-1α (venstre panel) eller en mutert 3’UTR av HIF-1α (høyre panel) og med pre-MIR-22 eller pre-MIR -kontroll. Cellene ble høstet og luciferase aktivitet ble målt (n = 3 ± SD).
MiR-22 kontroller VEGF uttrykk i HCT116
For å undersøke hvilken rolle MIR-22 i VEGF uttrykk , transfektert vi HCT116 med pre-MIR-22 eller anti-sense-MIR-22 eller kontroll, og deretter målt VEGF mRNA uttrykk av qPCR. Hypoksi og hypoksi mimetiske desferioxamine (DFX) økte uttrykket av VEGF mRNA (fig. 4A, hvite søyler). Over-uttrykk for MIR-22 redusert hypoksi eller DFX indusert VEGF uttrykk (Fig. 4A, svarte striper). Motsatt, knockdown av MIR-22 økte DFX indusert VEGF uttrykk (Fig. 4B). Neste vi målte konsentrasjon av VEGF i media. DFX øker utskillelsen av VEGF fra HCT116-celler. Over-uttrykk for MIR-22 undertrykte utskillelsen av VEGF. I kontrast, knockdown av MIR-22 forbedret VEGF frigjøring (fig. 4C-D). Videre undersøkte vi effekten av MIR-22 ved ekspresjon av Angiopoietin 2 (ANGPT2) og stamcellefaktor (SCF), fordi ANGPT2 og SCF er angiogene vekstfaktorer som er regulert av HIF-1 [20]. Hypoksi indusert ANGPT2 og SCF, og over-uttrykk for MIR-22 hemmet hypoksi-indusert uttrykk for ANGPT2 og SCF (figur S2).
HCT116 ble transfektert med pre-MIR-22 eller anti-sense-MIR-22 eller kontroll, og deretter utsatt for normoxia eller hypoksi i 16 timer. Mediene ble analysert på VEGF ved hjelp av ELISA og RNA fra cellelysater ble analysert for VEGF mRNA ved qPCR (n = 3 ± S.D. * P 0,05) (A) Pre-MIR-22 reduserer VEGF-mRNA. (B) Anti-sense-MIR-22 øker VEGF mRNA. (C) Pre-MIR-22 avtar VEGF protein. (D) Anti-sense-MIR-22 øker VEGF protein.
MiR-22 i HCT116 regulerer endotelial cellevekst
Siden angiogenese innebærer endotelceller spredning, testet vi effekten av MIR-22 på HUVEC spredning. Vi transfektert HCT116-celler med pre-MIR-22 eller kontroll, utsatt cellene normoxia eller hypoksi, og høstet media. Vi har lagt dette betinget media til menneskelig primære endotelceller (HUVEC), kultivert i 3 dager, og deretter målt spredning av HVUEC av BrdU inkorporering analysen. Det var ingen signifikant forskjell mellom media fra normoxia celler transfektert pre-MIR-22 og media fra normoxia celler transfektert kontroll (Fig. 5A). Som forventet, media fra hypoksiske celler transfektert med kontroll økt HUVEC spredning. Men media fra hypoksiske celler transfektert pre-MIR-22 blokkert denne økningen i spredning (Fig. 5A).
HCT116-celler ble transfektert med pre-MIR-22 eller kontroll, og mediene ble samlet. (A) HUVEC-celler ble dyrket i 12 brønners plater, ble det kondisjonerte medium tilsatt og HUVEC ble inkubert i 3 dager. Proliferasjon ble målt ved BrdU-inkorporering analyse (n = 5 ± S.D. * P 0,05). Pre-MIR-22 reduserer muligheten for hypoksiske behandlede celler til å produsere faktorer som stimulerer endotel proliferasjon. (B) HUVEC-celler ble skrapet, det kondisjonerte medium ble tilsatt, og fotografert ved 16 timer. (C) Måling av den avstand som dekkes av hver enkelt viklet i forhold til kontrollgruppen eksponerte med normoxia. (* P 0,05)
Siden angiogenese også involverer endothelial migrasjon, testet vi effekten av MIR-22 på HUVEC migrasjon bruker scratch sårtilheling analysen. Vi har lagt til HUVEC celler i kondisjonert medium fra HCT116-celler som hadde blitt transfektert med pre-MIR-22 eller kontroll og hadde da blitt utsatt for normoxia eller hypoksi. Etter 16 timer målte vi endothelial migrasjon fra kanten av scratch såret. Media fra HCT116 cellene utsatt for hypoksi økt endothelial migrasjon (fig. 5B-C). Over-uttrykk for MIR-22 i HCT116 bremset HUVEC migrasjon (fig. 5B-C). Disse data antydet at Mir-22 i HCT116 påvirker endotelial biologi, økt spredning og migrasjon.
Diskusjoner
Den store funn av denne studien er at MIR-22 hemmer hypoksi signalering. MiR-22 uttrykkes i mange kreftceller, inkludert kreft i tykktarmen HCT116-cellelinjen. Videre MIR-22 undertrykker HIF-1α oversettelse. Til slutt, MIR-22 hemmer VEGF uttrykk ved å undertrykke HIF-1α uttrykk. Siden andre har vist at c-myc grenser MIR-22 ekspresjon, kan tumorer over-uttrykker c-myc forventes å ha lavere nivåer av MIR-22, høyere nivåer av HIF-1α og VEGF. Derfor er disse data tyder på at Mir-22 kan regulere tumor angiogenese.
Mål av MIR-22
Individuell miRNA kan modulere uttrykk for mange gener. Flere rapporter identifisere potensielle mål av MIR-22 ved hjelp av programvare algoritmer, som TargetScan, Miranda og PicTar, i kombinasjon med cellestudier. MiR-22 mål østrogen reseptor a (ERA) og undertrykker østrogen signalering i flere brystkreftcellelinjer [21], [22]. MiR-22 også fortrengt c-Myc-bindende protein MYCBP [23], c-myc bindingspartner MAX [24] og tumorsuppressorgen PTEN [25], [26], [27]. PPAR-alfa og BMP7 er også mål for Mir-22 [28]. Vi fant ut at HIF-1α er et nytt mål på MIR-22. 3 «UTR av HIF-1α inkluderer en komplementær sekvens for MIR-22 består av 7 nukleotider; dette frøet sekvensen inneholder en wobbling bindings nukleotid (G-A). Vår biokjemiske data tyder på at Mir-22 regulerer direkte HIF-1α uttrykk kjøpe undertrykke oversettelse av HIF-1α.
Role of Mir-22 i tumor angiogenese
MiR-22 har unike roller i spesifikke celletyper. MiR-22 regulerer differensiering av en monocytt-cellelinje [24]. MiR-22 regulerer PPAR-alfa og BMP7 signalveier i menneskelige chondrocytes [28]. I kreft, er funksjonen av MIR-22 kontroversielt. Musen MIR-22 genet er adressert til en kreft-assosiert genomisk region, og den menneskelige MIR-22 genet ligger innenfor et tap av heterozygositet region (LOH) i flere kreftceller [23], [29], noe som tyder på at MIR-22 er involvert i undertrykkelse av tumorvekst. Ektopisk ekspresjon av MIR-22 inhiberte proliferasjon og kolonidannelse av MCF-7-celler [23]. Denne tumor suppressor aktivitet av MIR-22 innebærer undertrykkelse av MYCBP. Men andre har vist at det knockdown av MIR-22 øker apoptose rate i 16HBE-T-celler [26]. Den tilsynelatende motsetning mellom disse to studiene kan skyldes forskjellige cellelinjer eller forskjellige fremgangsmåter for å endre MIR-22 nivåer. Vi fant at MIR-22 inhiberer VEGF-sekresjon, noe som tyder på MIR-22 kan virke som en anti-angiogenese faktor i kolon kreftcellelinjer. Våre humandata støtter denne ideen: menneskelige eksemplarer av tykktarmskreft har lavere nivåer av MIR-22 og høyere nivåer av VEGF, sammenlignet med normal menneskelig kolon vev. Våre data indikerer en annen mekanisme som MIR-22 kan fungere som en tumor suppressor. Tap av MIR-22 uttrykk ikke bare tillater en økning i MYCBP men også en økning i HIF-1α
Hypoksi alarm og miRNA
lokal tumorvekst er begrenset av hypoksi: som svulsten ekspanderer, vil dens sentrum hypoksiske, induserende gener så som VEGF som utløser angiogenese [30], [31], [32]. Den HIF-1 heterodimer spiller en avgjørende rolle i hypoksisk signalering i tumorer [15], [33]. Vi og andre har identifisert miRNA som styrer hypoksi signalering. Vi har tidligere funnet at MIR-107 hemmer HIF-1β [34]. Andre har vist at Mir-20b begrenser HIF-1α uttrykk i lunge adenokarsinom og brystkreftcellelinjer [35], [36], [37]. Mir-17-92 klynge modulerer også tumorvekst ved å hemme HIF-1α uttrykk. Vår nåværende studien legger MIR-22 på listen over mirnas som regulerer HIF-1 protein.
Materialer og metoder
Cell Culture, hypoksi eksponering og Transfeksjon
Menneskelig umbilical vein endotelceller (HUVEC) ble anskaffet fra Lonza (Walkersville, MD). HUVEC (passasje 2-5) ble dyrket i basalmedium endotel (EBM2) supplert med vekstfaktorer (Lonza). HeLa og HEK293 (ATCC, Manassas, VA) ble dyrket i DMEM-media (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS). HCT116 (gave fra Bert Vogel, The Johns Hopkins University School of Medicine) og HT29 (ATCC) ble dyrket i McCoys 5A media supplert med 10% FBS. Desferrioksamin (DFX) og andre reagenser ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO). Å utsette celler til hypoksi, cellene ble dyrket i Billups-Rotenburg kammer med 94% N2, 1% O2 og 5% CO2 på 37 C i 24 timer.
Menneske Specimen
Menneskelig tykktarmen kreft prøver (n = 9) og sammenkoblede ikke-kreft normal kolon prøven (n = 9) ble oppnådd fra pasienter på The Johns Hopkins Hospital i Baltimore, MD, med dokumentert informert samtykke i hvert enkelt tilfelle. Innsamling og analyse av menneskelige tykktarmskreft prøven ble godkjent av The Johns Hopkins University School of Medicine Institutional Review Board. Pasienter som gjennomgår kirurgi for kolorektal kreft gitt skriftlig samtykke til å donere vev for analyse.
Transfeksjon
Precursor mirnas og anti-sense oligonukleotider for mirnas var fra Applied Biosystems (Foster City, California). For transfeksjon av forløper miRNA, ble HCT116-celler transfektert med SIPORT NeoFX (Applied Biosystems) med forløper miRNA 0-20 nM eller med anti-sense miRNA 0-40 nM og høstet 48 timer senere.
Northern blotting
Totalt RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp Trizol (Invitrogen). Humant vev RNA ble oppnådd fra Applied Biosystems. Northern blotting for MIR-22 ble utført som tidligere beskrevet. I korthet ble 10 ug av hver RNA ble applisert på 15% TBU-gel (Invitrogen), overført til nitrocellulosemembran og hybridisert med
32P-ende-merkede prober spesifikke for MIR-22 ved 42 ° C i 16 timer. Mir-22 probe, 5′-TAAAGCTTGCCACTGAAGAACT-3 «ble syntetisert ved Integrerte DNA Technologies; alle andre reagenser ble kjøpt fra Applied Biosystems.
Kvantitativ Real-Time PCR (QRT-PCR)
For å analysere miRNA uttrykket, TaqMan mikroRNA analyser ble brukt til å kvantifisere nivåer av modne mirnas følge produsentens bruksanvisning. I korthet cDNA ble syntetisert fra renset små RNA (10 ng) og utført Real-Time PCR ved bruk iCycler iQ (BioRad). Expression nivåer ble normalisert til U6. Primerne for miRNA RT-PCR og PCR-miksen ble innkjøpt fra Applied Biosystems. For å oppdage mRNA uttrykk, ble cDNA syntese utført ved hjelp av High Capacity cDNA syntese kit (Applied Biosystems). Primerne for human VEGF og ß-aktin ble innkjøpt fra Applied Biosystems.
luciferase Assays
A-fragment av den 3 «UTR fra HIF-1α (starter etter TGA stoppkodonet og som strekker seg til 401 bp) som inneholder MIR-22 respons element ble klonet inn pMIR-RAPPORT luciferase vektor (Applied Biosystems). Mutasjon av Mir-22 respons element (5»-GTTGACGG-3 «→ 5»-G
En
T
C
En
G
GG -3′) var laget av QuikChange seterettet mutagenese kit (Stratagene). HCT116-celler ble sådd ut i 5 x 10
4 celler per brønn i 24 brønners plater. Neste dag ble pMIR-RAPPORT luciferase vektorer inkludert 3 «UTR av HIF-1α og forløper MIR-22 eller egge oligonukleotider transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble luciferase-analyser utført ved anvendelse av den doble luciferase-rapportøranalysesystemet (Promega).
Western blotting
Cellene ble lysert i 0,4 ml lysisbuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% NP40, 20 mM NaF, 1 mM ortovanadat og protease-inhibitor cocktail). Lysater ble separert ved elektroforese, blottet på membranen og omsatt med spesifikke antistoffer. Antistoff mot mus HIF-1α var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Alle andre primære antistoffer og egnede sekundære antistoffer var fra Santa Cruz.
VEGF Konsentrasjoner
En ELISA ble anvendt for å kvantifisere VEGF utskilt fra HCT116 cellene i media. HCT116-celler ble inkubert i 1 ml medium med 1% FBS i fraværet (kontroller) eller nærvær av DFX eller under normoxia eller hypoksi i 24 timer ved 37 ° C. Supernatantene ble analysert for VEGF produksjon ved hjelp av Human VEGF ELISA kit i henhold til produsentens protokoll (R 0,05 ble betraktet som signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
HIF-1β er ikke et mål for MIR-22. Beskrivelse: HCT116-celler ble transfektert med forhånds MIR-22 eller pre-MIR-kontroll, og utsatt for normoxia eller hypoksi i 16 timer. Cellelysater ble immunblottet for HIF-1a og HIF-1b. Over-uttrykk for MIR-22 hemmer HIF-1a uttrykk, men ikke HIF-1b
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020291.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
MiR-22 regulerer uttrykk av angiogene faktorer. Beskrivelse: HCT116-celler ble transfektert med forhånds MIR-22 eller kontroll, og deretter utsatt for normoxia eller hypoksi i 8 timer. RNA-er fra cellelysater ble analysert for Angiopoietin 2 (ANGPT-2), stamcellefaktor (SCF), og COX-2-mRNA etter qPCR (n = 3 ± SD * P 0,05) Over-ekspresjon av MIR-22 redusert uttrykkene av angiogene faktorer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020291.s002 plakater (TIF)
takk
Vi takker Dr. Scott Kern for å gi oss med menneskelige tykktarmskreft prøver.
