Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) har dukket opp som viktige gen regulatorer og er anerkjent som sentrale aktører i tumorigenesis. MIR-145 er rapportert å være nedregulert i flere krefttyper, men kunnskap om sine mål i tykktarmskreft fortsatt begrenset.
metodikk /hovedfunnene
For å undersøke hvilken rolle MIR-145 i tykktarmskreft, har vi ansatt en microarray basert tilnærming for å identifisere Mir-145 mål. Basert på frø nettstedet berikelse analyser og saklig ord analyser, har vi funnet en betydelig berikelse av miRNA bindingssteder i 3′-utranslaterte regioner (UTR) av vitnemål nedregulert på miRNA overekspresjon. Gene ontologi analyse viste en overrepresentasjon av gener involvert i celledød, cellevekst og spredning, cellesyklus, genekspresjon og kreft. En rekke av de identifiserte miRNA mål har tidligere vært innblandet i kreft, inkludert
JA
,
FSCN1
,
ADAM17
,
BIRC2
,
VANGL1
samt transkripsjonsfaktor
STAT1
. Begge
JA Hotell og
STAT1
ble verifisert som direkte Mir-145 mål.
Konklusjon /Betydning
Studiet identifiserer og validerer ny kreftrelevante direkte mål av MIR-145 i tykktarm kreft celler og herved legger viktig mekanistisk forståelse av tumorundertrykkende funksjoner av MIR-145
Citation. Gregersen LH, Jacobsen AB, Frankel LB, Wen J, Krogh A, Lund AH (2010) mikroRNA-145 Mål
JA Hotell og
STAT1
i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 5 (1): e8836. doi: 10,1371 /journal.pone.0008836
Redaktør: Grzegorz Kudla, University of Edinburgh, Storbritannia
mottatt: 28 oktober 2009; Godkjent: 31 desember 2009; Publisert: 21 januar 2010
Copyright: © 2010 Gregersen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Work in forfatternes laboratorium er støttet av EU-kommisjonen (EC) FP7 finansiering (ONCOMIRS, tilskudd avtalenummer 201102. Denne publikasjonen reflekterer bare forfatterens synspunkter. Utvalget er ikke ansvarlig for bruk som kan gjøres av informasjonen i dette dokumentet), Novo Nordisk Foundation, The Lundbeck Foundation, The Danish National Research Foundation, det danske Medical Research Council, den danske Kreftforeningen og det danske nasjonal Advanced Technology Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
I de siste årene små ikke-kodende RNA har blitt anerkjent som viktige gen regulatorer [1] – [4]. mirnas er en rikelig gruppe endogene små ikke-kodende RNA som fungerer som regulatorer av protein kodende genene gjennom translasjonsforskning undertrykkelse og /eller nedbrytning av sine mål mRNA [1]. Omfattende miRNA forskning har vist at mirnas er involvert i reguleringen av tallrike viktige cellefunksjoner slik som metabolisme, celleproliferasjon, tumorgenese, apoptose, differensiering og utvikling [1], [3], [4]. For å regulere målet mRNA modne mirnas er bundet til AGO proteiner og veilede AGO-forbundet RNA indusert stanse kompleks (RISC) til mRNA mål gjennom ufullkomne baseparing mellom miRNA og målet. Dette innebærer ofte perfekt base paring mellom 5 «enden av miRNA strand og sitt mål, også kalt frøet nettstedet. Bio-analyser tyder på at hver miRNA kan styre flere hundre mål gener hos mennesker, og det er nylig blitt rapportert at over 60% av protein-kodende gener er under selektivt trykk for å opprettholde sammenkoblingen med mirnas, noe som indikerer at mirnas har potensial til å regulere det meste av proteinet koder gener [5].
Upassende uttrykk for miRNAs som regulerer gener som fungerer som enten tumor-undertrykkere eller onkogener kan til slutt føre til oppkjøp av kjennetegnene til kreft, og dermed spesifisere mirnas som både tumor-undertrykkere og onkogener [ ,,,0],3], [6], [7]. Spesifikke endringer i miRNA ekspresjonsnivåer har vært forbundet med forskjellige typer kreft [8] og et stort antall mirnas er lokalisert i såkalte cancerassosierte genomiske regioner, som ofte er utsatt for endringer i kreftceller [9]. Men i motsetning til det store antall mirnas som har blitt identifisert i de siste årene, bare forholdsvis få miRNA mål er blitt eksperimentelt bekreftet. Gitt den overveldende bevis for at mirnas er viktige regulatorer av tumorigenesis [3], [6], er identifisering av miRNA mål er nødvendig for å forstå mekanistiske grunnlaget for involvering av miRNAs i kreft.
MIR-145 har ofte blitt rapportert som nedregulert i kreftformer, inkludert prostata kreft [10], [11], blærekreft, [12], tykktarmskreft [13] – [18], eggstokk-kreft [19], [20], så vel som B -celle maligniteter [21], [22], og det har blitt rapportert at den genomiske regionen som koder for MIR-145 ligger i en skjør område ofte slettet i kreft [23]. Følgelig har MIR-145 overekspresjon vist seg å ha en veksthemmende virkning [16], [17], [24], [25], og for å undertrykke forankringsuavhengig vekst [16]. Det er videre blitt demonstrert at MIR-145-ekspresjon induseres av p53 [16]. Her ble det rapportert at MIR-145 mål c-myc gjennom ufullkommen frø baseparring [16] og det ble foreslått at p53-mediert nedregulering av c-myc er, i det minste delvis, på grunn av p53-medierte oppregulering av MIR-145 . En annen studie fant også et økt nivå av MIR-145 indusert av doxorubicin [26]. Men i stedet for en transkripsjonen aktivering av MIR-145 ble det funnet at p53 aktiverer behandling av primære MIR-145 transkripsjoner inn MIR-145 forløpere [26]. Dette fenomenet ble ikke bare begrenset til MIR-145, men også anvendes på flere andre mirnas med kjent vekstundertrykkende funksjoner, noe som indikerer p53-medierte regulering av miRNA behandling som en måte å utøve sin tumor-undertrykkende funksjon [26]. I tillegg til å c-Myc, og MIR-145 også blitt foreslått for å målrette den humane insulinreseptoren substrat-1 (IRS-1) og type I insulinlignende vekstfaktor-reseptor (IGF-IR) i tykktarmskreft [25], [ ,,,0],27]. Men spesifisiteten av målet interaksjon ble ikke bekreftet av mutasjonsanalyse av frø områdene i begge disse tilfellene.
Uttrykket nivået av MIR-145 er indusert ved differensiering av humane embryonale stamceller og MIR-145 overekspresjon har vist seg å svekke pluripotency i humane embryonale stamceller ved å målrette av
OCT4
,
SOX2 Hotell og
KLF4 Hotell som er involvert i å opprettholde selvfornyende kapasitet humane embryonale stamceller [28]. Denne rollen MIR-145 som induserer differensiering i embryonale stamceller er i samsvar med rollen som MIR-145 som en repressor av vekst i kreftceller. En mus modell designet for å undersøke uttrykk mønster av MIR-145 avslørte uttrykk for MIR-145 i multipotente hjerte forfedre og glatte muskelceller [29] og foreslo at MIR-145 fremmer differensiering i glatte muskelceller [29]. Men en annen studie viste at mus som manglet MIR-145 var levedyktig uten åpenbare avvik i glatt muskulatur celledifferensiering [30], noe som viser at det finnes flere arrangører av differensiering.
Til sammen vises MIR-145 for å ha tumor-suppressor funksjoner når overuttrykt i kreftceller og kan normalt spiller en rolle i differensieringsprosesser. Her har vi fokusert på målet identifisering av MIR-145 i tykktarm kreft, basert på microarray uttrykk profiler av celler som overuttrykker MIR-145. Gene ontologi analyser av MIR-145 responsive gener bekrefte regulering av gener involvert i celledød, cellesyklusregulering og kreft. Vi har identifisert en rekke MIR-145 mål som kan være interessant i en kreft sammenheng og bekreftet at Mir-145 mål JA og STAT1 i tykktarm kreft celler.
Resultater
Etter oppfordring fra de mange rapporter om MIR-145 downregulation i kreft vi søkt å identifisere Mir-145 mål som kan forklare rollen til MIR-145 i kreft. For å få innsikt i uttrykket nivåer av MIR-145 i etablerte cellelinjer, vi profilert uttrykket nivåer i en rekke kreftcellelinjer så vel som i ikke-tumorigene cellelinjer (figur S1). Uttrykket profiler av MIR-145 viste at med unntak av MCF10A alle testede ikke-tumorigene cellelinjer uttrykte MIR-145, mens uttrykket nivåer av MIR-145 var svært lav i alle testede kreftcellelinjer, støtter tidligere funn der MIR-145 er nedregulert eller tapt i kreft. På grunn av dens implikasjoner i tykktarmskreft [13] – [18], bestemte vi oss for å undersøke hvilken rolle MIR-145 i tykktarmskreft cellelinje DLD-en. Co-transfeksjon av MIR-145 duplex med en luciferase reporter inneholder en perfekt komplementær nettstedet til modne mirnas resulterte i en markant nedregulering av luciferase aktivitet, viser en svært effektiv overekspresjon (figur S2A). Som demonstrert ved begge krystall fiolett og MTT vekstmålinger, overekspresjon av MIR-145 resulterte i en nedsatt celleformering (figur 1 og figur S3).
DLD-1-celler transfektert med 50 nM MIR-145 duplex oppviser en redusert celleproliferasjon, målt ved krystallfiolett vekstanalyse. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. av fire gjentak.
Identifikasjon av MIR-145 Targets
Gitt de indikasjoner på at Mir-145 spiller en rolle i kreft, sammen med begrenset kunnskap om sine mål i tykktarmskreft, Målet var å identifisere funksjonelt relevante mål som kan bidra til å forklare hvilken rolle MIR-145 i kreft. For å oppnå dette, brukte vi en microarray basert strategi lik den som tidligere ble brukt til å identifisere MIR-21 mål [31]. DLD-1 celler ble transfektert med 50 nM MIR-145 duplex eller mock transfekterte. Totalt RNA ble høstet 24 timer etter transfeksjon og analysert på Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 humane matriser. Totalt åtte matriser ble analysert. For filtrering, ble uninformative gener med samme uttrykk nivå på tvers av alle matriser (inkludert ikke-uttrykte gener) fjernet og differensielt uttrykte gener, ble de tilhørende p-verdier og falske funnrate beregnet som beskrevet i Materialer og metoder.
for å finne ut om genene er regulert på MIR-145 overekspresjon var knyttet til spesifikke cellulære funksjoner, ble et søk innenfor de funksjonelle kommentarer i oppfinnsomhet database (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) utføres for alle MIR-145 responsive gener. De fem beste beriket funksjonelle kategorier av Gene ontologi analyse er opplistet i tabell 1. Blant disse kategoriene er celledød, cellevekst og proliferasjon, cellesyklus regulering og kreft. Tilsvarende analyser ved hjelp av tilfeldige gensettene generert fra Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 merknader, i noen tilfeller ført til anrikning av de samme kategoriene som vi fant beriket i MIR-145 datasett, men med p-verdier 10 størrelsesordener høyere enn i MIR-145 datasett (data ikke vist).
Seed stedet berikelse analyse av forekomster av MIR-145 frø steder i 3’UTRs demonstrert en svært betydelig berikelse blant nedregulert transkripsjoner (figur 2A). P-verdier for anriking av MIR-145 frø nettsteder (inkludert 7mer, 7mer-1A og 8MER nettsteder) var 1,4 · 10
-21 og 7,6 · 10
-8 når de vurderer nedregulert transkripsjoner vs . oppregulert transkripsjoner og nedregulert transkripsjoner vs ingen endring transkripsjoner, henholdsvis. To alternative metoder for beregning av frø nettstedet berikelse, enten som frø språk handlinger etter korrigere opp, ned og ingen endringer stiller til samme størrelse eller som frø språk forekomster per kb, viste en lignende berikelse i nedregulert 3’UTRs ( FIGUR S4). Til sammen bekrefter dette at mikromatrisebasert metode kan brukes for å identifisere miRNA mål. Når hele cDNA-sekvensen av transkriptene ble anvendt for frø området anrikning analyse (rapportert som prosentandelen av transkripter med frø områder), finner vi fremdeles en betydelig anrikning av frø nettsteder, selv om det anrikning er mindre uttalt sammenlignet med bare tatt i betraktning tre «UTR sekvenser (figur s5a). En tilsvarende analyse av sekvensene og 5’UTR sekvenser viste ingen signifikant frø nettstedet berikelse (figur S5b og S5C).
A, De prosenter av gener i opp, ned (dn) og ingen endring (nc ) setter frø områder i sine 3’UTRs. Bare de 6mers som ikke er en del av en 7mer eller 8MER rapporteres som 6mers og bare de 7mers som ikke finnes i en 8MER regnes som 7mers. Logaritmisk fold-endringene var 0,36, 0,02 og -0,40 for opp, ned og ingen endring sett, henholdsvis. P-verdiene er beregnet å teste nullhypotesen at andelen gener med frø nettsteder er det samme for nedregulert og oppregulert gener (dn vs. opp) eller nedregulert gener sammenlignet med ingen endring gener (dn vs. nc). P-verdier for 7mer frø nettstedet berikelse var 1,7 · 10
-33 (dn vs. opp) og 2,9 · 10
-11 (dn vs. nc). P-verdier for 7mer-1A frø stedet berikelse var 3,7 · 10
-18 (dn vs. opp) og 7,8 · 10
-7 (dn vs. nc). B, objektiv ord analyse som viser den løpende summen av overrepresentasjonen poengsum for MIR-145 7mer frø nettsted i rangert liste over 3’UTR sekvenser (svart linje) sammenlignet med permutasjoner av rangert genet liste (røde linjer). Ned- og opp-regulerte gener (definert som gener med FC -1,1 eller FC 1,1) i rangert genet listen angis i grafen. C, Kvantitativ RT-PCR validering av microarray data. -Celler ble transfektert med 50 nM MIR-145 dupleks eller uekte transfektert og total RNA høstet 24 timer etter transfeksjon. De 3’UTRs av
IQGAP1 Hotell og
STAT1
inneholder ikke MIR-145 frø kampene, men begge genene inneholder en 7mer frø kamp i sin kodende region. Alle andre MIR-145 responsive gener inneholde minst én 7mer frø nettstedet i sin 3’UTR. Ekspresjonsnivået av hvert transkript er vist i forhold til nivået i narretransfekterte celler. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. av tre gjentak.
Objektiv ord analyser av 3’UTR sekvenser identifisert 7mer frø stedet av MIR-145 som den mest betydelig anriket 7mer ord i 3’UTRs av nedregulert transkripsjoner (TABLE 2). Flere av de andre høyanriket ord var variasjoner av frø nettstedet MIR-145 og den fjerde mest beriket ord var 7mer-1A frø kamp (tabell 2). En tilsvarende 6mer ord analyse også identifisert MIR-145 frø kampene som de mest betydelig beriket ord (FDR 0,005) (figur S6). Plotte kjører summen av overrepresentasjonen score på 7mer frø nettstedet i transkripsjoner rangeres i henhold til deres logFC viste tydelig at de 3’UTRs av nedregulert transkripsjoner hadde en høy anrikning av MIR-145 7mer frø (svart linje) som ikke ble observert for permutasjoner av rangert genet liste (røde linjer) (figur 2B).
Potensielle Mir-145 mål
Siden Mir-145 er nedregulert eller tapt i kreft, re Innføring av MIR-145 forventes å føre til en direkte downregulation onkogene mål. Faktisk en rekke gener med onkogene funksjon var nedregulert på MIR-145 overekspresjon inkludert Src familiemedlem
JA Hotell og aktin kryssbinding protein
FSCN1
, som finnes i celle overflatefremspring inngår i celle motilitet [32]. Den metalloproteinase
ADAM17 Hotell og medlem av inhibitor av apoptose (IAP) familie
BIRC2 plakater (også kjent som
cIAP1
), som begge inneholder 8MER MIR-145 frø sider i sine 3’UTRs, ble også observert som nedregulert på MIR-145 overekspresjon. I tillegg
VANGL1
som er involvert i sårheling respons av intestinal epiteliale cellelinjer gjennom fremming av cellemigrasjon ble også identifisert som en antatt Mir-145 mål [33].
Noen av de nedregulert gener ikke har et frø side MIR-145 i sin 3’UTR, men i stedet hadde en eller flere et frø steder i kodingen regionen. STAT1, en velkjent transkripsjonsfaktor [34], [35] og IQGAP1 en negativ regulator av celle-celle adhesjon og stimulator av celle motilitet og invasjon [36], som begge hadde MIR-145 frø områder i de kodende regioner av deres transkripter. I tilfelle av
STAT1
, er frøet nettstedet MIR-145 ligger i den nest siste ekson av karakterutskriften. Siden
STAT1
var blant de mest nedregulert transkripsjoner i microarray analyse, ble det også ansett som et potensielt mål og inkludert i de påfølgende undersøkelsene. De tidligere identifiserte Mir-145 mål
OCT4
,
SOX2 Hotell og
KLF4
i humane embryonale stamceller ble ikke uttrykt i DLD-1 celler (data ikke vist).
MYC
,
ISR-1 Hotell og
IGF-1R
, foreslått av andre som Mir-145 mål [16], [25], [27], viste ingen endring i uttrykket nivå på MIR-145 overekspresjon i vårt datasett (data ikke vist). Den fullstendige listen over identifiserte potensielle Mir-145 målene som inneholder frø områder i deres 3’UTR er presentert i tabell S1.
Target Validering
neste bekreftet microarray data ved kvantitativ RT-PCR for syv utvalgte transkripsjoner som ble funnet nedregulert i microarray analyse (figur 2C). Spesielt,
STAT1 Hotell og
JA
, som har MIR-145 frø steder i kodingen regionen og 3’UTR henholdsvis viste en klar nedregulering på karakterutskriften nivå på MIR-145 overekspresjon. For å avgjøre om MIR-145 direkte regulerer
JA Hotell og
STAT1
, luciferaserapportørplasmid konstruksjonene ble klonet. Basen sammenkobling mellom miRNA frø områder og potensielle mRNA mål er avbildet i figur 3A. I begge tilfeller overekspresjon av MIR-145 resulterte i redusert luciferase aktivitet, noe som indikerer at miRNA kan binde både
JA
3’UTR og
STAT1
cDNA og direkte megle undertrykkelse (figur 3B ). Dette var ikke tilfellet med reporter konstruksjoner der frøet nettstedene hadde blitt mutert (figur 3b). For ytterligere å bekrefte miRNA mediert nedregulering av STAT1 og JA på proteinnivå, western blot-analyser ble utført i begge DLD-1-celler og HCT116 tykktarmskreftceller. Overekspresjon effektiviteten av MIR-145 i HCT116 målt ved luciferaserapportørplasmid konstruksjoner var lik den som ble observert i DLD-1 celler (figur S2B). En markert nedgang på YES protein nivå formidlet av MIR-145 ble observert 48 timer etter transfeksjon i begge DLD-1 og HCT116-celler (figur 3C). En mer subtil, men likevel klart nedregulering av STAT1 mediert av MIR-145 ble også observert (figur 3D). Spesielt er graden av undertrykkelse STAT1 varierte mellom DLD-1 og HCT116-celler, med den sterkeste undertrykkelse av STAT1 observert i DLD-1 celler.
A, Sekvens innretting av frø region MIR-145 og mRNA-mål. Stillingen koordinatene er angitt for transkripsjon isoformer oppført nedenfor.
Ja1
3’UTR: ENSG00000176105: ENST0000035983
STAT1
cDNA: ENSG00000115415: ENST00000361099. B Firefly luciferase assay med pGL3 + konstruerer holder en 3’UTR fragment av
JA
eller en cDNA fragment av
STAT1
, nedstrøms til ildfluen luciferase genet. Celler ble ko-transfektert med ildflueluciferase journalister sammen med en
Renilla
luciferase transfeksjon kontroll plasmid enten alene eller sammen med 50 nM MIR-145 duplex og 50 nM AllStar duplex som en negativ kontroll. I pGL3 + mut vektorer to basepar i frøet nettstedet MIR-145 har blitt mutert. Luminescens ble målt 24 timer etter transfeksjon og forholdet ildfluen til
Renilla
aktivitet er vist i forhold til transfeksjon uten RNA duplex og tom vektor. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. av fire gjentak. *, P 0,05 ved hjelp av en to-tailed t-test, ***, p 0,01 ved hjelp av en to-tailed t-test. C og D, Western blot analyse av DLD-1 og HCT116-celler transfektert med MIR-145 tomannsboliger eller mock transfekterte celler utslettet for JA (C) og STAT1 (D). Vinculin eller tubulin ble brukt som laste kontroller. Båndene ble kvantifisert i forhold til de riktige lasting av kontroller ved å bruke TotalLab programvare og er vist i forhold til proteinnivået i narretransfekterte celler. Dataene som vises er representative for to eksperimenter.
Sekundære effekter på grunn av STAT1 Deregulering
STAT1 er en godt karakterisert transkripsjonsfaktor beste anerkjent som en transkripsjonen aktivator, men eksempler på negative transkripsjonsregulering Det er også blitt beskrevet [34]. Den STAT1 bindende motiv som definert av Jaspar CORE databasen [37] er vist i figur S7A. For å finne ut om MIR-145-mediert nedregulering av STAT1 også forårsaket en endring av uttrykket nivået av STAT1 målgener i microarray analyse, et søk etter STAT1 bindingsseter i arrangører av nedregulert, oppregulert og karakterutskrifter uten endringen i ekspresjonsnivået ble gjennomført. Ut av alle Jaspar kjerne transkripsjonsfaktorer, STAT1 var den mest betydelig beriket bindingssetet både når nedregulert (p-verdi = 4,18 · 10
-4) og oppregulert gener (p-verdi = 1,34 · 10
-4) ble sammenlignet med de gener med ingen endring i ekspresjonen (tabell 3). Dette var ikke tilfelle for en permuted STAT1 bindende matrise ved sammenligning oppregulert gener til gener med ingen endring i uttrykket nivå (figur S7b). Men når de vurderer nedregulert gener sammenlignet med ingen endring gener, det var også en liten anrikning av STAT1 permuted bindingsseter, noe som indikerer at noen av de observerte effektene kan være uspesifikke (FIGUR S7C).
Diskusjoner
mirnas er fremstår som viktige gen regulatorer og intensiv forskning av sine funksjoner og mål har avdekket en rolle miRNAs i flere viktige cellulære funksjoner. Selv om vår forståelse av funksjonelle roller mirnas i kreft er stadig økende, er kunnskap om MIR-145 og sine mål i tykktarmskreft fortsatt i stor grad mangler. Vi derfor fokusert på identifisering av MIR-145 mål i tykktarm kreft celler. Støtte tidligere funn om at MIR-145 er nedregulert i tumorer [10] – [13], [15], [16], [18] – [21], [38] – [42], en profil av speil 145 uttrykk i etablerte cellelinjer viste at uttrykket nivåer av MIR-145 ble drastisk redusert i kreftcellelinjer i forhold til ikke-tumorigene cellelinjer. Etter avtale med rapporter som viser en vekst hemmende effekt av MIR-145 [16], [17], [41], vi også observere en vekstreduksjon på DLD-1 celler ved forbigående MIR-145 transfeksjon, noe som innebærer at MIR-145 besitter en tumor-suppressor funksjon
in vitro
.
Her har vi brukt microarray profilering på MIR-145 overekspresjon som en metode for identifisering av potensielle mål. Microarray uttrykk profiler kombinert med frø nettstedet berikelse analyse er en veletablert metode som brukes for å identifisere potensielle miRNA mål [31], [43], [44]. Det har den fordel i forhold til strengt beregnings mål forutsigelse at det ikke bare er basert på tilstedeværelsen av et frø område og sekvens trekk ved potentielt mål, men tar hensyn til hvorvidt målet er uttrykt i betraktes cellelinjen og hvorvidt målet er regulert på karakterutskriften nivå. Siden denne tilnærmingen er utelukkende basert på endringene som er observert på karakternivå, mål utelukkende regulert av translasjonsforskning undertrykkelse vil ikke bli identifisert.
Seed nettstedet berikelse analyse og saklig ord analyse viste en klar berikelse av MIR-145 frø områder i 3’UTRs av nedregulert transkripsjoner, bekrefter vår tilnærming til å identifisere Mir-145 mål. Vi observerte ikke noen berikelse av MIR-145 frø steder i kodingen regionen nedregulert transkripsjoner. Imidlertid, siden noen av de gener som inneholdt frø områder innenfor den kodende regionen tidligere hadde blitt implisert i kreft, spekulert vi at de nevnte kandidater kan også spille en funksjonell rolle nedstrøms MIR-145. Den objektive ord analyse, som brukes her for å evaluere anrikning av ordene i 3’UTRs henhold til logFC av transkriptet ved MIR-145 overekspresjon, presenterer en meget nyttig metode for visualisering av virkningene av miRNA overekspresjon uten å gjøre noen antagelse om fordommer cutoff verdier. Formen på løpende sum kurven viser en skarp topp av Mir-145 7mer frø nettsteder for de mest nedregulert gener som tyder på at målet transkripsjon nedregulering for en stor del skyldes direkte effekter av MIR-145 målgruppe. Den objektive ord-analyse bekreftet tidligere rapporter som viser at en A i posisjon 1 av frø området er fordelaktig uavhengig av dens potensial for å basepar med miRNA [2], [45].
Mange av de mål identifisert her har tidligere vært implisert i kreft. De beriket funksjonelle kategorier av alle miRNA responsive målene støttes videre innblanding av MIR-145 i kreft og innebærer at både de direkte virkningene av MIR-145 samt sekundære effekter kan forklare rollen MIR-145 i kreft. En rekke gener med onkogene funksjon, og mange av disse har også vært forbundet med tykktarmskreft, ble identifisert som potensielle Mir-145 mål basert på microarray analyse. Disse inkluderer
ADAM17
,
BIRC2 Hotell og
VANGL1
. ADAM17 har vært rapportert oppregulert i kolon karsinom og har vist seg å fremme frigivelsen av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) ligander fra cellemembranen, og således aktiverer EGFR [46]. BIRC2 har vist seg å være avgjørende for å opprettholde endotelial celleoverlevelse og vaskulær integritet i sebrafisk ved å aktivere dannelsen av TNF-reseptor-komplekset I, samt å fremme nedbrytningen av IkB, hvorpå NF-kB frigjøres og translocates inn i cellekjernen hvor det aktiverer pro-overlevelse gener i endotelceller [47]. Cellemembranen forbundet brøkdel av VANGL1 øker med differensiering og ble vist til co-lokalisere med E-cadherin i menneskelige kolon celler [33]. I tillegg ble det vist at overekspresjon av
VANGL1
stimulerte sår nedleggelse av intestinale epitelceller cellelinjer, mens siRNA rettet mot Vangl1 hemmet den vandrende respons [33]. Tidligere rapportert MIR-145 mål inkludert
OCT4
,
SOX2 Hotell og
KLF4
involvert i markedsføringen av stamcelleforskningen spredning ble ikke uttrykt i DLD-1 celler, noe som tyder på at veksthemmende virkning av MIR-145 overekspresjon i DLD-1-celler ikke skyldes nedregulering av disse genene. En annen viktig regulator av celledeling,
MYC
, tidligere rapportert som en MIR-145 mål viste ingen endring i uttrykket nivå på MIR-145 overekspresjon i våre omgivelser.
Eksperimentell validering av
YES Hotell og
STAT1
som Mir-145 mål viste en markert nedregulert på mRNA og protein nivå, beviser den biologiske effekten av MIR-145 på de endogene mål. Nedregulering i 3’UTR /cDNA luciferase analysene bekrefter videre at dette er et resultat av direkte interaksjon, siden mutasjoner av frø nettsider MIR-145 avskaffe denne nedregulering. Grunnen til de forskjellige virkninger av MIR-145 i de forskjellige analyser er trolig på grunn av en mangel på direkte sammenlign mellom disse analyser. Denne forskjellen kan også skyldes andre bindende faktorer involvert i regulering av det endogene transkript, som disse bindingsseter ikke er til stede i de 3’UTR eller cDNA-fragmenter som anvendes i de klonede luciferase reporter konstruksjoner.
En rekke studier har knyttet økt uttrykk av JA i kreft med økt cellemotilitet og tumorinvasjon [48], [49]. JA er en del av Scr-kinase-familien [50] og dens tyrosin-kinase-aktivitet har blitt vist å være forhøyet i colonic adenomer sammenlignet med dens aktivitet i tilstøtende normal slimhinne [51]. Videre JA aktivitet ble funnet å korrelere med den forutsagte kreftrisiko basert på størrelse, histologi, og graden av dysplasia [51]. Tatt sammen antyder den foreliggende data at oppregulering av JA er viktig for vekst og transformasjon av tarmcellene.
STAT proteinene fungerer på nedstrømssiden av Jaks og MAPK, som induserer dimerisering av STAT proteinene, for derved å tillate translokasjon av STAT proteiner til kjernen [34], [35]. STAT1 er best kjent for sin pro-apoptotisk rolle i respons til interferoner, men STAT1 har også blitt rapportert å ha en pro-overlevelse rolle i noen kreftformer [35]. Vi observerte en nedregulering av
STAT1
på karakterutskriften nivå og proteinnivå på MIR-145 overekspresjon. Videre viser vi at denne nedregulering av STAT1 omsettes til en effekt på ekspresjonsnivået av potensielle STAT1 mål. Dette er tilfelle for gener både positivt og negativt regulert av STAT1, men effekten er størst i genene negativt regulert av STAT1. Selv om STAT1 har blitt rapportert både som en transkripsjonen aktivator og repressor, den viktigste mekanisme for STAT1 transkripsjonsregulering er aktiveringen av dets målgener [34]. Våre funn tyder på at transkripsjonen undertrykkelse er mer utbredt enn tidligere innregnet. For å oppsummere, transkripsjonsfaktoranalyser av arrangører av deregulerte gener gir et middel for å karakterisere sekundære effekter som tidligere er publisert for MIR-34a [52]. Den identifiserte anrikning av STAT1 bindingssteder i arrangører av regulerte gener viser at sekundære effekter av miRNA overekspresjon uttales allerede 24 timer etter transfeksjon. Derfor er det viktig å vurdere sekundære effekter når analysere miRNA overekspresjon datasett.
I konklusjonen, ved hjelp av en microarray basert tilnærming vi har identifisert flere mål for kreft-assosiert miRNA MIR-145 i tykktarm kreft celler. De miRNA mål identifisert i denne studien kan bidra til å avklare rollen til MIR-145 i tykktarm kreft, så vel som andre krefttyper.
Materialer og Metoder
cellekulturer
DLD-1 celler ble dyrket i DMEM Glutamax ™ -I høy glukosemedium (31966, Gibco Invitrogen) supplementert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS, CH30160.03, Hyclone), 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin (P /S, 15 140 Gibco Invitrogen) og inkubert i 5% CO
2 pluss 20% oksygen. HCT116-celler ble dyrket i McCoys 5A L-Glutamin-medium (22330, Gibco Invitrogen) supplementert med 10% (v /v) FBS og P /S. Overekspresjon av MIR-145 ble oppnådd ved transfeksjon med et MIR-145 duplex som etterligner den modne MIR-145 (PM11480; Ambion). Transfeksjon med
Caenorhabditis elegans
lin-4 duplex (PM10768, Ambion) eller AllStar negativ kontroll siRNA (1027281, Qiagen) ble brukt som kontroll. Alle transfeksjoner ble utført ved anvendelse av Lipofectamine ™ 2000 Transfection Reagent (11668-019, Invitrogen) i henhold til protokollen produserer.
