Abstract
ineffektiviteten generere induserte pluripotente somatiske celler (IPS) skapt to motstridende modeller, nemlig Stochastic modell og Elite-modellen. Selv om det tidligere er mer gunstig for å forklare de iboende ineffektivitet, kan det være feilbarlige å ekstrapolere den samme arbeidsmodell til omprogrammering av kreftceller. Faktisk har tumorceller er kjent for å være iboende heterogen med hensyn til særpreg og dermed gi en egnet plattform for å teste om den omprogrammering prosessen av kreftceller er forspent. Her rapporterer vi våre observasjoner at alle tilfeldig plukket induserte pluripotente kreftceller (IPC) som etablerte tidligere ikke har mutasjoner kjent i foreldre befolkningen. Denne uventede observasjon er mest parsimoniously forklares med Elite-modellen, der antatte tidlige kreft progenies ble valgt under induksjon til pluripotency
Citation. Lai J, Kong CM, Mahalingam D, Xie X, Wang X (2013) Elite modell for generering av Induced pluripotent kreftceller (IPC). PLoS ONE 8 (2): e56702. doi: 10,1371 /journal.pone.0056702
Redaktør: Rajasingh Johnson, University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 20 september 2012; Godkjent: 14 januar 2013; Publisert: 13. februar 2013
Copyright: © 2013 Lai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Departementet utdanning Academic Research Fund Tier 1 tilskudd, R-183-000-259-112 og R-183-000-295-112. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Utførte pluripotent kreftceller (IPC) som
Induksjon av kreftceller til pluripotency (IPC) som har blitt oppnådd på ulike kreftceller og viste lovende resultater for å dempe deres tumorigenicity [1] – [5 ]. Imidlertid, gitt at hver etablert pluripotent kreftcelle koloni antas å være klonal fra en enkel foreldrekreftcelle, og at den parenkreftcellepopulasjonen er sannsynligvis heterogent, vil det være av intens interesse for å forstå hvorvidt den nukleære reprogrammerings-prosessen er forspent. Selv Yamanaka (2009) foreslo at produksjonen av induserte pluripotente stamceller (iPS) er ikke en partisk prosess (Stochastic modell) [6], er det faktisk feilbarlige å ekstrapolere denne modellen til generering av konsulentene, gitt heterogenitet av kreftceller .
intratumor heterogenitet
Individuelle svulster har ofte blitt observert å være morfologisk og karyotypically heterogen [7] – [12], tidvis skjuler histopatologer i nøyaktig bestemmelse av svulst klasse for klinisk diagnose. Videre er en klassisk subkloning forsøk utført av Fidler, I.J. og Kripke, M.L. gitt overbevisende bevis for at heterogenitet innenfor en svulst eksisterer med hensyn på metastatisk evne til [13]. Dessuten har den aggressive fremme av neste generasjons sekvensering (NGS) allerede innledet muligheten for enkelt kjernen sekvensering, som foreslo en punctuated modell for svulst evolusjon [14].
For å teste om den stokastiske modellen har i omprogrammering av celler, bør en identifiserbar heterogen populasjon bli anvendt for å observere hvorvidt en hvilken som helst undergruppe er over representert i omprogrammerte kolonier. Faktisk er denne tilstanden oppfylt ved kreftceller, som presenterer en interessant eksperimentelle oppsettet. Hochedlinger
et al.
(2004) observerte at omprogrammerte muse melanomceller har en homogen karyotype konfigurasjon, i motsetning til dets parentale cellepopulasjon som er heterogen [15]. Faktisk, hvis den stokastisk modell holder, karyotypen til omprogrammeres melanom populasjonen bør være heterogen mellom kloner. Men en kritisk parameter for fullt bygge avvisning av den stokastiske modellen må bestemmes: Andelen av foreldre celler som besitter den samme karyotype konfigurasjon som omprogrammeres celler. Hvis dette forhold er stort i den tidligere kjente, statistisk sett, er det lite grunnlag for å avvise den stokastiske modellen i dette tilfellet. Men hvis andelen er tilstrekkelig liten, er det faktisk oppfattes å avvise Stochastic modellen
Her rapporterer vi tilsvarende observasjoner på omprogrammering av to ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler -. H358 og H460 . Den tidligere ble rapportert å være
TP53
homozygot slettet [16], sistnevnte bærer homozygot slettet
CDKN2A product: [17] og mutant
CDKN2B
(upubliserte data). Ganske overraskende, observerte vi at ipcs generert fra disse kreftceller, dvs. iPCH358 og iPCH460, ikke lenger havn hvilken som helst av de kjente delesjoner eller mutasjoner. Videre
TP53
observert i iPCH358 og
CDKN2A, CDKN2B
i iPCH460 ble observert å være vill-type. Videre ble den tidligere nevnte kritiske parameteren bestemmes og antyder avvisning av den stokastiske modellen; våre eksperimentelle resultatene tyder på at omprogrammering av kreftceller følger Elite-modellen som har valgt en distinkt undergruppe av celler fra en heterogen foreldrekreftcellepopulasjon.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur
celle~~POS=TRUNC linjene~~POS=HEADCOMP anvendt i denne studien er human fetal lunge fibroblast IMR90 (ATCC nr. CCL-186), HeLa (ATCC nr. CCL-2), adenokarsinom NCI-H358 (ATCC nr. CRL-5807), storcellet carcinoma NCI-H460 (ATCC nr. HTB-177), så vel som humane embryonale stamceller H1 (WiCell nr. WA01). NCI-H460 hentet fra Dr. Koeffler laboratorium ble også kjøpt fra ATCC. Alle cellelinjer ble holdt i fuktig inkubator holdt ved 5% CO
2 og 37 ° C dyrket på ATCC anbefalt media supplert med 10% FBS. Den generasjonen av konsulentene ble beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt konsulentene ble etablert via Yamanaka protokoll med liten endring [19]. Lentivirus og retrovirus ble produsert ved å transfektere 293T-celler og Plat-E-celler, respektivt. Før infisere H358 og H460-celler, virus ble filtrert gjennom et 0,45 pm pore-størrelse overflateaktivt middel-frie celluloseacetat filter (Sartorius). konsulenter og hESC ble dyrket på bestrålte mus embryonale fibroblast (iMEFs) badet i DMEM /F12 (Invitrogen) supplert med 20% Knockout Serum Replacement (Invitrogen), 1 mM L-glutamin (Invitrogen), 100 mikrometer ikke-essensielle aminosyrer, 100 mikrometer beta p-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich) og 4 ng /mL basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) (Invitrogen). Før gjennomføre eksperimenter på konsulenter og hESC, celler ble sådd på Matrigel (BD Biovitenskap) og vedlikeholdes i mTeS®1 (STEMCELL Technologies).
RNA /DNA isolering og revers transkripsjon PCR (RT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen) og revers-transkribert ved hjelp av revers transkriptase enzym (Promega) samt oligo dT primere (Promega), i henhold til produsentens instruksjoner. Total DNA ble ekstrahert ved hjelp DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen).
Microarray analyse
Microarray data for genekspresjon og DNA metylering ble hentet fra GSE35913. Analysene ble utført ved hjelp av R i lumi og methylumi miljøer [20]. Heat kartet ble generert ved hjelp gplots pakken.
PCR og sekvense
TP53
,
CDKN2A Hotell og
CDKN2B
ble forsterket fra cDNA og genomisk DNA fra IMR90 (positiv kontroll), H358, H460 og 10 tilfeldig plukket iPCH358 og iPCH460 kolonier. Primere for presiseringer kan finnes i tabell S1. PCR produktene ble løst ved gel elektroforese og renset med QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) og sekvensert ved hjelp BigDye® Terminator v3.1 sykle sekvense kit (Applied Biosystems). PCR-produktet for
TP53
amplicon 2 for iPCH358 Col # 3 ble klonet inn pGEM®-T vektor (Promega) før sekvensering.
Western Blot
Hele cellelysater av H1, HeLa, H358, H460 og 10 tilfeldig plukket iPCH358 og iPCH460 kolonier hver ble oppløst ved SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran. TP53 primære antistoff (Cell Signaling # 9282) ble anvendt for å undersøke tilstedeværelse av TP53 i H1, HeLa, H358 og alle iPCH358 kolonier. CDKN2A primært antistoff (Cell Signaling # 4824) ble brukt for å undersøke tilstedeværelse av CDKN2A i H1, HeLa, H460 og alle iPCH460 kolonier.
Serie fortynningsassay
30 ng /mL av IMR90 genomisk DNA ble serielt fortynnet 10 ganger med 30 ng /mL av H460 genomisk DNA. 1 mL av concoction ble deretter brukt som mal for forsterkning av
CDKN2B
.
Eksplanter svulster
Om 2 × 10
6 H358 og H460 cellene ble resuspendert i 30% Matrigel og injisert subkutant i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus, eller nakne mus (tabell S2). Svulster fikk vokse i tre til fire uker. Mus ble avlivet før fjerning av tumorer. De dyreforsøk ble utført under godkjent IACUC (The National University of Singapore Institutional Animal Care og bruk Committee) protokoller av 117/09.
meta spre
metafase sprer foreldrenes og post-iPC var utført som beskrevet av Jeppesen [21]. I korthet ble cellene dyrket til 70% konfluens og ble behandlet med 0,1 ug /ml Demecolcine oppløsning (Sigma) i 7 timer. Cellene ble deretter dissosiert med trypsin og behandlet med 75 mM KCl ved 37 ° C i 10 minutter. 5 x 10
3-celler (i 100-500 ul KCl) ble sentrifugert ved 1000 opm til de cytosentrifuge lysbildene i 5 minutter. Glassene ble deretter vasket med KCM (120 mM KCl, 20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100) i 5 minutter, blokkert med 10% BSA (fortynnet i KCM) for 45 minutter. Dette blir etterfulgt av inkubasjon med primære antistoffer i to timer og deretter ble fluorescens-konjugerte sekundære antistoffer for en time. Etter vasking av glassplatene med KCM, ble de sprer fiksert med 4% formaldehyd i 15 minutter. Til slutt ble objektglassene vasket med destillert vann, lufttørket og montert sammen med monteringsmedium inneholdende DAPI (Vector Laboratories). Alle bildene ble tatt med Olympus Fluoview FV1000 mikroskop. Primære antistoffer som ble brukt var
CENPA plakater (Abcam) og
TRF2 plakater (BD Transduction Laboratories).
deponeringsnummer
Alle sekvense data av
TP53
,
CDKN2A Hotell og
CDKN2B
ble lastet opp til GenBank under deponeringsnummer JQ694043-51and JX391994.
Resultater
tilstedeværelse av
TP53
observert i iPCH358
Den vellykkede etableringen av iPCH358 og iPCH460 i vårt laboratorium ble rapportert tidligere [18]. Genuttrykk microarray data viste at påvisning av
TP53
uttrykk i H358 var lik bakgrunn støynivå for alle tre biologiske replikater, men oppregulert i iPCH358, som var helt uventet (figur 1A). For å utelukke microarray gjenstand,
TP53
i 10 tilfeldig plukket iPCH358 kolonier ble avhørt av PCR og Western Blot. Til vår overraskelse, disse analysene enstemmig enig med microarray data (Figur 1b). Videre sekvensert vi kodingen regionen i
TP53 Hotell og funnet det å være vill-type i tre tilfeldig plukket kolonier av iPCH358 (GenBank tiltredelse: JQ694049-JQ694051).
(A) log transformintensitetsavlesninger fra Illumina HumanHT-12 indikerer en signifikant (FDR justert P 0,05) oppregulering av
TP53
avskrift i iPCH358 forhold til H358. Dette er uventet siden H358 er kjent for å være
TP53 Anmeldelser – /-. (B) PCR (øvre panel) og Western Blot (nedre panel) analyser som bekrefter uttrykk for
TP53
i flere tilfeldig plukket kolonier av iPCH358. Kodingen regionen
TP53
i Col # 1, Col # 3 og Col # 11 er villtype (GenBank tiltredelse: JQ694049-JQ694051). (C) PCR (venstre panel) og Western Blot (høyre panel) analyser på iPCH358 kolonier av 20 passasjer avslørt at passasjen nummeret er uninformative til utfallet av disse analysene. Resultater fra eksperimenter utført på separate anledninger eller beskjæres fra det samme bildet er merket med en stiplet linje; opprinnelige bildene kan bli funnet i Presentasjon S1 som inkluderer detaljert dokumentasjon av passasje nummer.
CDKN2A Hotell og
CDKN2B
ikke mutert i iPCH460
dette resultatet motivert for oss å fastslå hvorvidt en lignende forekomst ble observert i H460. Probe sett (DNA metylering microarray) for arrangøren av
CDKN2A product: (
P16
) og
CDKN2B product: (
P15
) var ikke i stand til å produsere pålitelig signaler for alle biologiske replikater (n = 3) av H460, som er sannsynlig på grunn av mutasjoner på avhørt loci. Men det samme kan ikke sies for iPCH460 (figur 2A). For å validere denne observasjonen, primerpar designet av Shan,
et al.
(2004), som ikke vil gi noen PCR-produkter fra H460 genomisk DNA mal, ble benyttet [22]. Overraskende er det samme primerpar var i stand til å fremstille PCR-produkter fra 10 tilfeldig plukket kolonier av iPCH460 genomisk DNA templat (figur 2B). Tilsvarende primerparene utformet for å amplifisere den kodende regionen av både
CDKN2A
og
CDKN2B
mRNA ikke gi noen PCR-produkter fra H460, men alle 10 iPCH460 kolonier ga PCR-produkter under de samme betingelser (figur 2B). Videre sekvense resultatene av de kodende regioner av begge
CDKN2A Hotell og
CDKN2B
mRNA av tre tilfeldig plukket iPCH460 kolonier ble observert å være vill-type (GenBank tiltredelse: JQ694043-JQ694048). I tillegg
CDKN2A Hotell som er kjent for å bli slettet i H460 er uttrykt og påvises ved Western Blot i iPCH460 (figur 2B). Selv om ingen PCR-produkter fra forsterke
CDKN2B
i H460 ble observert, er CDKN2B protein aktivt uttrykt i H460 og forble slik i iPCH460 (figur S1). Vårt laboratorium oppdaget at i stedet for hele genet sletting, mulige små mutasjoner i det omkringliggende loci av
CDKN2B
i H460 gjengitt etablerte PCR metoder for å mislykkes. Dette ble bekreftet med uavhengig hentet H460 celler fra Dr. Koeffler laboratorium (figur S2).
(A) Varme kart som viser metylering array-prober (rader) unnlater å hybridisere til
CDKN2A Hotell og
CDKN2B
arrangører i H460 (tom barer), men ikke så i iPCH460. (B) PCR (øvre panel) analyse som viser
CDKN2A Hotell og
CDKN2B
kan påvises i iPCH460 mens Western Blot (nedre panel) analysen viser
CDKN2A
, som er homozygot slettet i H460, er synlig i iPCH460. (C) PCR (øvre panel) og Western Blot (nedre panel) analyser på iPCH460 kolonier av 20 passasjer avslørt at passasjen nummeret er uninformative til utfallet av disse analysene. Resultater fra eksperimenter utført på separate anledninger eller beskjæres fra det samme bildet er merket med en stiplet linje; opprinnelige bildene kan bli funnet i Presentasjon S1 som inkluderer detaljert dokumentasjon av passasje nummer.
Uttrykk av slettede gener vedvarer gjennom sent passasjer iPC kolonier
Chin og kolleger rapportert at de tidlige passasjer ( eller under 10 passasjer) av iPS kolonier oppførte seg annerledes enn slutten passasjer ( 20 passasjer) kolleger [23]. I våre tidligere analyser (figur 1B og figur 2B), våre prøver var overveiende ≤20 passasjer. Derfor fortsatte vi å karakter hvis passasje antallet vil endre uttrykket oppførselen til
TP53
i iPCH358 samt
CDKN2A Hotell og
CDKN2B
i iPCH460. Interessant, vi ikke observere noen endring i uttrykket oppførsel i slutten av passasjen konsulenter (figur 1C, 2C og presentasjon S1).
En mulig feilkilden til vår observasjon så langt er tilstedeværelsen av forurensende normale fibroblaster i disse kreft cellelinjer. Derfor, for å utelukke muligheten for at disse resulterende konsulentene ble avledet fra forurensende normale fibroblaster, ble metafase spredning gjennomført på post-IPC celler (spontant differensiert IPC kolonier via embryoid kroppen formasjon). Vi observerte at post-IPC celler forblir aneuploid og dermed konkludere med at de etablerte IPC koloniene ikke var avledet fra forurensende normale fibroblaster (Figur S3). Vi har også utelukket 293T celle og Plat-E celle forurensning fordi begge lentivirus og retrovirus ble filtrert gjennom et 0,45 mikrometer pore-size filter før infisere H358 og H460. I tillegg fant vi at GFP-kontroll vektorer spilte ingen rolle i uttrykket av de muterte gener i både H358 og H460 (figur 1B og figur 2B).
Til sammen har vi her to utfyller hypoteser til forklare hvorfor
TP53
null H358-celler uttrykte TP53 på omprogrammering (på samme måte,
CDKN2A
null H460 celler uttrykt CDKN2A på omprogrammering): 1) omprogrammering induserer et gen utvinning mekanisme; 2) omprogrammering, i en heterogen befolkning, beriket en undergruppe av celler med ulike mutasjonsstatus enn majoritetsbefolkningen. Faktisk gir den sistnevnte hypotesen den mest parsimonious forklaring (se diskusjon).
Elite modell av omprogrammering spår våre observasjoner
Gitt at H358 og H460 er heterogene med hensyn til genmutasjon status, spurte vi «Hva er sannsynligheten for at alle tilfeldig plukket iPCS kolonier er utledet fra den mindreårige undergruppe uten kjent mutasjon som preger majoritetsbefolkningen, hvis omprogrammering følger Stochastic modellen» Vi først etablert en parameter: estimert andel av mindre undergruppe (for enkelhets skyld vil denne subpopulasjon bli referert til som «mutasjon-free» subpopulasjon). For å estimere det ble IMR90 genom seriefortynnet med H460 genom og viste effekt for å forsterke
CDKN2B
av PCR. Vi valgte å forsterke
CDKN2B
på grunn av sin forsterkning effektivitet sammenlignet med
CDKN2A
eller
TP53 plakater (figur S4). I vår analyse, beregnet vi at den maksimale andelen H460 celler uten mutant
CDKN2B
er 1:5000 (figur 3A). Med dette anslaget, vi beregnet sannsynligheten for å observere alle tilfeldig plukket kolonier som ble hentet fra «mutasjon-free» undergruppe. For både iPCH358 og iPCH460, til sannsynligheten for å observere alle 10 tilfeldig plukket kolonier være «mutasjon-free» er en × 10
-37 (Figur 3B). I tillegg til det minst mulige forhold resultere i en sannsynlighet på 0,05 eller mer i denne sannsynlighetsmodell er 0,75 (
10C
10 x 0,75
10 x 0,25
0 0,05), dvs. hvis utgangspopulasjon hadde ikke mindre enn tre «mutasjon-free» celler for hver fire celler. Dette forhold er ikke på langt nær 0,25, som er den dårligste beregnede andelen fra den minst effektive forsterkning av seriefortynning analyser (figur S4A). Dermed forkaster vi nullhypotesen og konkluderer med at omprogrammering av kreftceller følger Elite modell.
(A) Serial fortynningsassay viser at ved 10
3,7 ganger fortynning,
CDKN2B
i IMR90 kan påvises ved basale nivåer. Derfor, på det meste en i 5000 H460 celler er «mutasjon fritt». (B) Sannsynligheten modell for å teste nullhypotesen: «Generation of konsulentene følger Stochastic modellen». Påfølgende input av parametrene bestemmes i (A) antyder avvisning av stokastiske modellen i omprogrammering av H358 og H460.
Definere «mutasjon fritt «undergruppe
Mens elite modell i dette eksperiment omprogrammering hevder at prosessen er forspent mot den «mutasjon-free» undergruppe, er den anrikning av denne unnvikende subpopulasjonen i sin naturlige tilstand teknisk utfordrende. Ikke desto mindre, Hochedlinger
et al.
(2004) tidligere viste at karyotype konfigurasjonen av omprogrammeres kreftcellen er lik den av eksplantatet tumor [15], som tyder på at inokulering av kreftcellelinje i SCID-mus har valgt tumorigent undergruppe med cytogenetisk funksjonen lik som den omprogrammeres kreftcelle. I tillegg ble det påpekt at Chang
et al. Product: (2003) observerte at tumorcellelinjer var typisk heterogene i motsetning til sine derivative eksplantering svulster [24]. Derfor ble fire eksplantering svulster i H358 og H460 genereres hver (tabell S2). Men bare en explant svulst i H358 (H358-2) ga påvisbare
TP53
på sin genomisk DNA (figur 4A). På den annen side, er ingen av eksplantatet svulster H460 ga påvisbar
CDKN2A
eller
CDKN2B
(figur 4B). Derfor inokulering av kreftcellelinje i SCID mus svakt emulerer selektivitet atom omprogrammering.
(A) En av fire H358 eksplantering svulst generert viser tilstedeværelse av
TP53
i genomet, som indikerer berikelse av unnvikende «mutasjon-free» undergruppe. ble observert (B) Ingen av de eksplantering svulster H460 å bli beriket for «mutasjon-free «undergruppe. Genomisk DNA fra SCID-mus halen ble brukt til å kontrollere for mus DNA-kontaminering i eksplantering tumorer. Informasjon fra eksplantering svulster kan finnes i tabell S2.
Diskusjoner
Omprogrammering diskriminerer heterogen kreftcellepopulasjon
De data som presenteres her viser at status forskjellig genetisk mutasjon mellom foreldrenes kreftcelle befolkning og omprogrammeres motstykke. Selv om vi ikke har eksperimentelle data til å vise den homogenitet eller heterogenitet av H358 og H460 kreft celle populasjoner direkte, for å forklare dette spennende observasjon, foreslo vi to utfyller hypoteser: 1) starter befolkningen er homogen og dermed atom omprogrammering utilsiktet korrigerer viss mutasjoner; 2) Start befolkningen er heterogen og kjernekraft omprogrammering beriker en mindre undergruppe. Den første hypotese hengsler på en antagelse, hvorved en celle er i stand til å utvinne et mutert gen. Men det er klart at en slik mekanisme ikke eksisterer fordi etablering av IP-adresser fra
p53, TERC Kjøpe og
Ink4 /Arf
knock-out mus embryonale fibroblaster [25], [26], ikke se utvinning av disse genene. På den annen side, den andre hypotese går ut i fra et scenario der reprogrammerings diskriminerer innenfor den heterogene kreftcellepopulasjon av varierende grad av genetisk fornærmelse. Denne antakelsen ligner til observasjon Hochedlinger og kolleger gjorde der den heterogene karyotype av musene melanom blir homogen etter omprogrammering [15]. Derfor er den andre hypotesen favoriserte å forklare avviket mellom mutasjonsstatus i cellene før og etter omprogrammering.
Hvis start bestander av H358 og H460 er heterogene, og det finnes en «mutasjon fritt» undergruppe hvorfor skulle PCR eller Sør-blot [16] ikke oppdage disse genene? Vi foreslår at andelen av «mutasjon-free» subpopulasjon er for liten til å gi tilstrekkelig templat for PCR-amplifikasjoner under dannelse av produkter som er tilstrekkelige for etidiumbromid deteksjon. Ja, vi viste dette i utvanning av IMR90 genomisk DNA på minst 5000 ganger vil maskere påvisning av
CDKN2B
amplicon. Basert på denne analyse, beregnet vi at det er høyst en «mutasjon-free» celle for hver 5000 H358 eller H460-celler. Derfor, for å oppnå konsulenter avledet fra denne unnvikende «mutasjon fritt» undergruppe er svært usannsynlig hvis omprogrammering prosessen er stokastisk. Derfor foreslår vi at omprogrammering av kreftceller følger Elite modell.
Tidlig kreft progenies kan definere kompetanse mot omprogrammering
Siden omprogrammering prosessen diskriminerer en heterogen kreftcellepopulasjon, vi forsøkte å avgrense underliggende egenskaper i kreftcellene som bestemmer kompetanse mot omprogrammering. Tidligere studier har pekt på at omprogrammering faktorer aktivere flere alderdom og tumor-undertrykkende mekanismer (dvs.
TP53 Hotell og
CDKN2A
) som fungerer som barrierer mot omprogrammering [25] – [27]. Overraskende, til tross for somatiske genet delesjoner av disse barrierene i flertallet av H358 og H460-celler, ingen av de tilfeldig plukket koloniene var null for disse gener. I tillegg observerte vi at karsinogent potensial (bestemt ved SCID-mus inokulering) svakt emulerer anrikningen ved omprogrammering prosessen. På den annen side, tyder våre data på at derivater av disse IPCer er antatte tidlig progenies av svulsten befolkningen.
Muller Skralle fastslår at mutasjoner i organismer som formerer seg vegetativt er irreversible og akkumuleres over generasjoner [28]. Tilsvarende kreftceller «reprodusere» via mitose og genetiske skader er irreversible og akkumuleres over flere cellesykluser. Med andre ord innebærer dette at derivatene av iPCH358 og iPCH460 er celler fra de tidligere stadier av tumorigenesis. Dessuten, gitt at de muterte gener i spørsmålet (
TP53
,
CDKN2A Hotell og
CDKN2B
) er viktig for integriteten av genomet, er det sannsynlig at disse «mutasjon -fri «celler har en lavere grad av genetisk nivå fornærmelser. Paradoksalt nok, men disse cellene er aneuploid og vise større spredning av kromosomtall enn foreldre celler (figur S2), plausibly bekreftende teorien om at Aneuploidy fremmer genomisk ustabilitet [29]. Slutter seg til denne teorien, Navin og kolleger på samme måte observert at kopiere antall forsterkning av
KRAS
, en viktig onkogen, er unikt for aneuploid svulst befolkningen [14]. Derfor foreslår vi en veiledende hypotese om at omprogrammering velger kreftceller fra de tidligere progenies av tumordannelse, der genetisk nivå fornærmelser er lav, men grovt aneuploid (figur 5). Faktisk, genetisk integritet opprettholdes av
TP53 Hotell og
CDKN2A
, blant andre, kan være nødvendig for å bevare den strengt regulert pluripotency kretser for å sikre omprogrammering suksess [30] – [32]. Bortsett fra å forklare hvorfor konsulenter generert fra H358 og H460 ikke var
TP53
null og
CDKN2A
null, henholdsvis, dette kan svare på et interessant spørsmål som stilles av Zhang og kolleger om hvordan en omprogrammert sarkom celle med flere genetisk nivå skaden kan likevel oppnå pluripotency [5]. Fremtidige eksperimenter som Flow-FISK (flowcytometri fluorescens
in situ
hybridisering) for å sortere ut «mutasjon fritt» undergruppe etterfulgt av én kjerne sekvensering vil gi bevis for å underbygge eller forfalske denne hypotesen. . I tillegg vil videre studier på genomet til eksplantering svulst H358-2 være av interesse i å ta denne hypotesen
Fra våre data, observerte vi at derivater av våre konsulenter: 1) manglet nøkkel genetisk mutasjon (er) ; 2) aneuploid; 3) mindre undergruppe. Gitt disse observerte egenskaper, er det trygt å anta at disse derivatene var tidlig progenies av svulsten befolkningen (representert i grønt). Dermed er Aneuploidy muligens første ervervet før kritiske mutasjoner å drive videre fordelaktige mutasjoner (avgrenset i grått), i samsvar med observasjon av Navin et al (2011). Sammen med den forståelse at den pluripotency reguleringskretser er strengt regulert og kompleks, mindre genetisk nivå fornærmelser i celler (sirkler mangler rød «X») vil sikre integriteten til kretser og derfra vellykket etablering av iPC (representert i lilla) som kan differensieres til flere linjene (representert i blått).
Avsluttende kommentarer
i denne studien har vi benyttet kreftcellelinjer som er iboende heterogene, slik at vi kan observere hvilke variable ( s) fordommer mot den vellykkede generasjonen av produktkonsulenter. Ja, våre observasjoner at «mutasjon-free «subpopulasjoner ble valgt mot flertallet foreslår at omprogrammering av kreftceller følger Elite modell. Denne konklusjonen er ikke forfalske tidligere forslag om at produksjonen av iPS følger stokastiske modellen, i kraft at normale somatiske celler og kreftceller er forskjellige. I tillegg fører vår data til en veiledende hypotese om at antatte tidlige progenies av svulsten befolkningen ble valgt under omprogrammering prosessen. Future klarlegging av tilhørende egenskaper til «mutasjon fritt» undergruppe foreslått av våre data vil være til stor nytte i videre forstå omprogrammering av kreftceller prosess for å løse den underliggende heterogene make-up av svulster, som vil være sentrale i anti-kreft terapeutiske strategier.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Expression of CDKN2B protein i H460 og iPCH460.
CDKN2B
er mutert i H460 som gjengir alle PCR-analyser for å mislykkes, men gjorde ikke forurolige sin protein uttrykk
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056702.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Tilstedeværelse av
CDKN2B
i H460 celler fra vårt laboratorium og Dr. Koeffler laboratorium (Klab). (A) CDKN2B-proteinet kan påvises i H460-celler fra vårt laboratorium og Klab. (B) En alternativ primerpar vi utformet (Tabell S1) var i stand til å forsterke
CDKN2B
både genomisk DNA og cDNA av H460. Vi sekvensert koderegionen av dette genet, og fant det å være vill-type (GenBank tiltredelse: JX391994)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056702.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
metafase spredning viser at post-konsulentene (piPCs) er aneuploid. (A) Representative metafase sprer av H358, H460, piPCH358 og piPCH460. (B) Tabell oppsummerer tellinger av kromosomer fra minst åtte uavhengige sprer per prøve. Blå – DAPI beiset kromosomer; grønn – TRF2; . Rød – CENPA
doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
to ganger serie fortynning av IMR90 genomet for forsterkning av
TP53 Hotell og
CDKN2A
. (A) IMR90 genomisk DNA var to-ganger fortynnet i serie med H358 genomisk DNA som mal for å forsterke
TP53
. Vi observerte at ved 4 gangers fortynning, PCR bånd tilsvarende
TP53
er marginalt synlig. Dette gir oss et estimat som for hver fjerde H358 celler, er en «mutasjon fritt». (B) På tilsvarende måte IMR90 genomisk DNA var 2 ganger fortynnet i serie, men i stedet med H460 genomisk DNA. Amplification effektiviteten av
CDKN2A
ble likeledes truet av ikke-spesifikke produkter; ved 32 gangers fortynning, PCR bandet var marginalt merkbar og dermed gi et anslag som for hver 32 H460 celler, er en «mutasjon fritt». Uansett, vil parsing noen av disse parametrene inn i sannsynlighetsmodell i figur 3 resultere i en sannsynlighets mye mindre enn 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056702.s004 plakater (TIF)
Presentasjon S1 .
Originale bilder brukt i Figur 1 og Figur 2.
doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s005 product: (PDF)
Tabell S1.
Primer Sekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056702.s006 plakater (XLSX)
Tabell S2.
Eksplantering svulstene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056702.s007 plakater (XLSX)
Takk
Chiou Mee Kong er en mottaker av forskningsstipend fra Yong Loo Lin School of Medicine, NUHS, NUS, Singapore. Vi takker Dr. Patrick Tan for innsiktsfulle kommentarer samt Dr. Phillip Koeffler for hans type gave H460 celler.
