Abstract
Tykktarmskreft består av en liten bestand av kreft initiere stamceller (CIC) som er ansvarlig for svulst vedlikehold og motstand mot anti -cancer behandlinger, muligens noe som åpner for svulst reprisen når behandlingen stopper. Kombinasjoner av immun-basert terapi med kjemoterapi og andre antitumormidler kan være av betydelig klinisk fordel ved behandling av kreft i tykktarmen. Imidlertid har cellulære immunbaserte terapier ikke blitt eksperimentert ennå i bestanden av kolon CIC. Her viser vi at behandling med lave konsentrasjoner av vanlig kjemoterapi, 5-fluorouracyl og doxorubicin, bevisst kolon CIC til Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksisitet. Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksisitet ble i stor grad formidlet av TRAIL samspill med DR5 etter NKG2D avhengig anerkjennelse av kolon CIC mål. Vi konkluderer med at
in vivo
aktivering av Vγ9Vδ2 T-celler eller adoptiv administrasjon av
ex-vivo
utvidede Vγ9Vδ2 T-celler med passende avstand etter kjemoterapi kan vesentlig øke anti-tumor aktivitet og representerer en ny strategi for tykktarmskreft immunoterapi
Citation. Todaro M, Orlando V, Cicero G, Caccamo N, Meraviglia S, Stassi G, et al. (2013) Kjemoterapi sensitizes Colon Cancer Initiere Cells til Vγ9Vδ2 T-cellemediert cytotoksisitet. PLoS ONE 8 (6): e65145. doi: 10,1371 /journal.pone.0065145
Redaktør: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxembourg
mottatt: 5 mars 2013; Godkjent: 23 april 2013; Publisert: 06.06.2013
Copyright: © 2013 Todaro et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har blitt støttet med tilskudd fra det italienske departementet for Undervisning, universitet og forskning (kontrakt ikke 2008L57JXW til FD.), det italienske helsedepartementet (Progetto Ricerca Finalizzata 2007 «stamceller i ulike patologiske tilstander: innovative terapeutiske approches» til FD), Istituto Superiore di Sanita Oncoproteomic Prosjekt 2007-527 /B /3A /3 (til GS og FD) og Universitetet i Palermo. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer ingen økonomisk eller kommersiell interessekonflikt. Den tilsvarende forfatter, Francesco Dieli, er en faglig redaktør i PLoS ONE. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
I de senere år, ny innsikt i kreftforskningen har antydet at evnen til å initiere og opprettholde tumorvekst er karakteristisk for en liten undergruppe av kreftceller med stemness egenskaper innen tumormassen, som kalles «kreft stamceller» (cscs) eller «kreftceller initiere» (CIC) [1]. Kjemoterapi forblir den primære behandling for mange avansert kreft og har cytotoksisk antitumoraktivitet gjennom en rekke mekanismer. Men de fleste kreftformer er resistente mot dagens behandling på grunn av saktesykkel CIC, plasseringen av disse cellene i hypoksiske nisjer [2], [3], og fordi de ondartede cellene har kapasitet til å utvikle mekanismer for å motstå eller unnslippe cytotoksiske virkningene av kjemoterapi [4], som er opp-regulering av flere ATP-bindende kassett transportører, aktiv DNA-reparasjonsevne og over-ekspresjon av anti-apoptotiske molekyler som forårsaker endringer i signalveier som kontrollerer proliferasjon, differensiering og apoptose [5] .
Flere studier har vist at behandling av tumorceller med cellegifter induserer eller øker deres følsomhet for cytotoksisitet ved hjelp av NK eller T-lymfocytter; Således kan kombinasjoner av cellulære immunbaserte terapier med kjemoterapi og andre antitumormidler være av betydelig klinisk fordel ved behandling av mange former for kreft [6].
γδ T-celler er av spesiell interesse for anvendelse i slike kombinerte behandlinger på grunn av deres sterke anti-tumor cytotoksisitet og det relativt enkelt generasjon
in vitro product: [7]. Humane γδ T-cellene kan deles inn i to hoved populasjoner basert på δ kjede ekspresjon [8]: γδ T-celler som uttrykker den Vδ1 kjeden er oftest funnet i slimhinnevevet, hvor de er involvert i å opprettholde epitelvev integritet i møte med skade, infeksjon, eller svulst transformasjon, mens γδ T-celler som uttrykker den Vδ2 kjeden paret med Vγ9 kjeden (her kalt og deretter Vγ9Vδ2 T-celler) dominerer i det perifere blod og sekundære lymfeorganer [9]. Mens liganden (e) gjenkjent av Vδ1 celler forblir ukjent, Vγ9Vδ2 T-celler gjenkjenner ikke-peptidiske antigener av et MHC-uinnskrenket mekanisme, et viktig trekk som skiller dem fra αβ T-celler [9]. Nærmere bestemt, Vγ9Vδ2 T-celler gjenkjenner phosphoantigens som er produsert gjennom isoprenoid biosyntese-trasé [10] – [12]. Phosphoantigens er ikke stimulerende ved fysiologiske nivåer, men transformert og infiserte celler, produserer økte nivåer av metabolske mellomprodukter som er i stand til å aktivere Vγ9Vδ2 T-celler [13] – [15]. Følgelig kan Vγ9Vδ2 T-celler også aktiveres gjennom en indirekte mekanisme, ved aminobisphosphonates, en klasse av legemidler som brukes til å behandle visse bein sykdommer, som hemmer farnesylpyrofosfat syntase, og årsaken akkumulering av endogene oppstrøms metabolitter som isopentenylpyrophosphate (IPP) [16 ]. Vγ9Vδ2 T-celler kan indirekte bidra til immunforsvar mot kreftceller, ved å produsere cytokiner som er typiske for TM1, TM2 eller Th17-celler [17] – [19], eller tverr snakke med dendrittiske celler [20], makrofager [21] og B -celler [22] – [24]. I tillegg Vγ9Vδ2 T-celler utføre direkte potent cytotoksisk aktivitet mot kreftceller, som er mediert på stort sett samme måte som for CD8 T-celler og NK-celler, via perforin /granzyme, Fas /Fasl, TNF /TNF-R og TRAIL-Trail- R veier [10].
i denne studien har vi vurdert den potensielle synergi av å kombinere kjemoterapi og Vγ9Vδ2 T-celle-mediert cytotoksisitet for anti-tumor terapi. Nærmere bestemt, som kolon CIC er resistente mot både kjemoterapeutiske medikamenter og til Vγ9Vδ2 T-celle-mediert cytotoksisitet, har vi fastslått hvorvidt kjemoterapi kan brukes til å sensibilisere kolon CIC mål til Vγ9Vδ2 T-celle-cytotoksisitet, basert på tre linjer med bevis: (1) pioner arbeid ved Mattarollo og medarbeidere [25] har vist at et høyt nivå av cytotoksisitet mot faste tumor-avledede cellelinjer med kombinasjonsbehandling anvendelse Vγ9Vδ2 T-celler og kjemoterapeutiske midler; (2) IL-17-produserende γδ T-celler spiller en avgjørende rolle i kjemoterapi-indusert anti-cancerimmunresponser hos mus [26]; (3) behandling av tykktarm CIC med bisfosfonater zoledronate forbedrer deres følsomhet for Vγ9Vδ2 T-celle drap [27].
Vi viser her at cellegifter i dag brukes for behandling av kolon kreftpasienter, 5-fluorouracyl og doxorubicin, er i stand til å bevisstgjøre kolon CIC til Vγ9Vδ2 T-celle-mediert drap og vi viser at de underliggende mekanismene involvere NKG2D og TRAIL.
Resultater
Resistance of Colon CIC til kjemoterapi
Vi har tidligere rapportert at tykktarmskreft utgjør et stort flertall av differensierte celler og en liten bestand av CIC som er ansvarlig for tumor initiering og vedlikehold [28]. For denne studien formål, vi renset og spredte tykktarmskreft kuler fra kirurgiske fragmenter av 5 pasienter med tykktarmskreft. Disse kreft sfære linjer ble identifisert ved ekspresjon av CD133 og epiteliale spesifikt antigen ESA, viste tilslutning til kulturskåler i nærvær av serum og deretter differensiert i store, mangekantet tykktarmceller som uttrykker tykktarm epitel-markører, slik som villin, noe som tyder på at kolon kreft kuler beholdt evnen til å
in vitro
skille i enterocyte-lignende celler. Viktigst er at når injisert subkutant i NOD /SCID-mus, et lavt antall av tykktarmskreft kuler, men ikke sfære-avledet differensierte celler, beholdt evnen til å danne en svulst som lignet den humane opprinnelige tumor (Hjelpemiddel figur S1).
CIC er preget av høy motstand mot narkotika og general giftstoffer som er målrettet mot raskt prolifererende celler og spare slow dele celler på grunn av en oppregulering av flere ATP-bindende kassett transportører, aktiv DNA-repair kapasitet, overuttrykk av anti-apoptotiske molekyler som forårsaker endringer i signalveier som kontrollerer proliferasjon, differensiering og apoptose [5]. Følgelig eksponering av 5 forskjellig kolon CIC CIC linjer (# 1 til # 5 CIC) til 5-FU (2,5 og 25 ug /ml) (figur 1A) eller DXR (0,025 og 0,25 uM) (figur 1 B) for 24-72 timer hadde nesten ingen signifikant cytotoksisk effekt, som bestemmes av PI farging. Høyeste doser av 5-FU (250 ug /ml) og DXR (2,5 uM) forårsaket lav, men detekterbar cytotoksisitet av CIC linjer som strekker seg fra 15 ± 5% til 23 ± 6% (gjennomsnitt ± SD). Omvendt, 5-FU og DXR var fullt ut i stand til å drepe 3 differensierte tykktarmskreftcellelinjer DLD-1, SW620 og SW403, og 2 differensierte cellelinjer (CDC # 3 og CDC # 4) oppnådd fra to pasienter (P # 3 og P # 4), der danner CIC linjene ble også erholdt, med en doseavhengig økning i cytotoksisitet opp til 85%. Levedyktighet av ubehandlede celler var over 90% (figur 1A og B).
Colon CIC, differensierte tykktarmskreft cellelinjer DLD-en, SW620, SW403, CDC # 3 og CDC # 4 ble behandlet med ulike konsentrasjoner av 5-FU eller DXR i 48 timer. Cytotoksisitet (% ± SD) ble bestemt ved graden av reduksjon av levedyktige celler med evnen til å beholde CFSE og inkluderer PI (CFSE
høy PI
-). Vist er en representant eksperiment av tre.
Kjemoterapi sensitizes Colon CIC til Vγ9Vδ2 T Cell Cytotoksisitet
I analogi til deres motstand mot cellegift, de fem testede kolon CIC linjer, var også motstandsdyktig mot Vγ9Vδ2 T-celle-mediert cytotoksisitet, selv når et E: T forhold på 50:1 ble anvendt (figur 2A). De fattige cytotoksisk aktivitet mot kolon CIC var ikke en iboende egenskap ved Vγ9Vδ2 T-celler, fordi de differensierte tykktarmskreft cellelinjer DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 og CDC # 4 ble effektivt drept av to Vγ9Vδ2 T-cellelinjer COLD2 -1 og COLD2-2 oppnådd fra to forskjellige tykktarmskreftpasienter (P # 3 og # P 4) (figur 2A), samt Vγ9Vδ2 T-cellelinjer erholdt fra friske forsøkspersoner (data ikke vist). Som en kontroll ble alle de testede Vγ9Vδ2 T-cellelinjer mislyktes i å drepe normal colon-cellelinjen CCL-241 (figur 2A).
(A) Cytotoksisitet prosentandel av 2 forskjellige til Vγ9Vδ2 T-cellelinjer, COLD2-1 og COLD2-2 innhentet fra 2 pasienter rammet av tykktarmskreft, mot tykktarmskreft sfære celler fra 5 forskjellige pasienter (CIC # 1 til CIC # 5), differensierte tykktarmskreft cellelinjer DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 og CDC # 4, og normal colon-cellelinjen CCL-241, ved et E: T forhold på 50:1. (B) Tre forskjellige mål kolon CIC (CIC # 2, CIC # 4 og CIC 5 #) ble behandlet med eller uten enten 5-FU (2,5 til 250 ug /ml) eller DXR (0,025 til 2,5 uM) i 48 timer ble testet for deres følsomhet for to forskjellige til Vγ9Vδ2 T-cellelinjer, COLD2-1 og COLD2-2 hentet fra 2 pasienter rammet av kreft i tykktarmen og brukes på en E: T-forhold på 20:01. Resultatene tyder på cytotoksisitet av tumormål følgende 6 timer ko-kultur med Vγ9Vδ2 T-cellelinjer. Dataene er gjennomsnittlig prosent ± SD av 5 forskjellige eksperimenter, hver utført i tre eksemplarer.
I tidligere studier har vi vist at zoledronate sensitizes tykktarmskreft CIC til Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksisitet [27]. Evnen til Vγ9Vδ2 T-celler til å drepe tykktarmskreft CIC ble så vurdert etter behandling av målene med kjemoterapi. Representative resultater som er oppnådd med tre forskjellige CIC linjer (CIC CIC # 2, # 4 og # 5 CIC) er vist i figur 2B. Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksisitet ble forsterket i alle tilfeller ved forbehandling av target CIC med kjemoterapi. I detalj, nesten fullstendig lysering av CIC linjer resultat av kombinasjonen av de høyeste doser av 5-FU (250 ug /ml) eller DXR (2,5 uM) og Vγ9Vδ2 T-celler, med celledød prosentandeler over 90% ved et E: T forhold på 20:01. Behandling av mål med lavere doser kjemoterapi (2,5 og 25 ug /ml 5-FU og 0,025 og 0,25 uM DXR) resulterte i forbedret dreping av CIC linjer ved Vγ9Vδ2 T-celler, noe som indikerer at kjemoterapi og Vγ9Vδ2 T-celler har additiv aktivitet, selv når de anvendes ved suboptimale doser.
kjemoterapi oppregulerer DR5 (TRAIL-R2) Død Receptor Expression på CIC
for å dechiffrere de molekylære mekanismene bak kjemoterapi-mediert allergi av CIC til Vγ9Vδ2 T celler cytotoksisitet, fokuserte vi på uttrykket av mRNA som koder for molekyler som er kjent for å være ligander for nøkkelaktiverende reseptorer på Vγ9Vδ2 T-celler og død reseptorer, før og etter eksponering av CIC for kjemoterapeutika. Som vist i figur 3, ble alt av disse molekylene konstitutivt uttrykt i CIC, selv om uttrykket gående varieres blant forskjellige CIC linjer; men ble ikke observert noen store forskjeller i alle testede CIC linjer for HLA-klasse I, ICAM-1, CD155, CD112, MICA /B og ULPBP1-4 uttrykk før og etter eksponering for kjemoterapi.
RT PCR av ekspresjonen av mRNA som koder for forskjellige overflatemolekyler i kolon CIC behandlet med eller uten enten 5-FU (25 ug /ml) eller DXR (0,25 uM) i 48 timer. Data representerer gjennomsnittsverdiene ± SD av 4 separate eksperimenter, hver utført med tykktarmskreft kuler fra 5 forskjellige pasienter (CIC # 1 til CIC # 5).
Expression of Fas (CD95), TNF R1, DR4 (TRAIL-R1) og DR5 (TRAIL-R2) dødsreseptorer ble økt i de fleste CIC linjer etter eksponering for cytostatika (figur 3), men økt uttrykk av Fas, fikk TNF-R1 og DR4 ikke oppnå statistisk betydning. Den største og signifikant økning ble kun observert for DR5 uttrykk etter eksponering av CIC til 5-FU og, skjønt i en mindre grad, DXR (figur 3). Oppregulering av DR5 etter 48 timers eksponering for tykktarm CIC til kjemoterapi ble bekreftet ved hjelp av strømningscytometri ved farging med spesifikk mAb (figur 4).
Colon CIC ble behandlet med medium, 5-FU (25 ug /ml) eller DXR (0,25 mm) i 48 timer, vasket grundig og farget med anti-DR5 mAb. Flowcytometri histogrammer vise DR5. Mean fluorescens intensitet (MFI) for DR5 farging er angitt i øvre høyre hjørne av hvert panel. Stiplede linjene representerer isotypekontrollantistoff mAb, mens grå fylt histogrammet representerer anti-DR5 mAb.
Killing av kjemoterapi-behandlede CIC av Vγ9Vδ2 T celler er mediert av NKG2D og TRAIL
Vγ9Vδ2 T celler utnytte ulike veier for dreping av kreftceller som er avhengige av sekresjon av proinflammatoriske cytokiner og proapoptotiske molekyler eller på celle kontakt avhengig lyse gjennom NK-lignende eller TCR-avhengige interaksjoner [9]. Vi vurderte de mekanismene som er ansvarlig for å ha drept av kjemoterapi-sensibilisert CIC av Vγ9Vδ2 T-celler, ved individuelt å blokkere TCR eller NKG2D reseptorer. Cytotoksisiteten av kjemoterapi-forbehandlede kolon CIC linjer ved to forskjellige Vγ9Vδ2 T-cellelinjer ble betydelig inhibert av anti-NKG2D mAb, mens den Vγ9Vδ2 TCR synes å spille en mindre rolle som angitt ved svikt av anti-CD3 og anti-pan γδ TCR mAb for å inhibere cytotoksisitet (figur 5). I tillegg ble Vγ9Vδ2 T-celle-dreping av kjemoterapi-sensibiliserte mål måles i nærvær av mevastatin, som hemmer 3-hydroksy-3-metylglutaryl-CoA og hindrer zoledronate-mediert akkumulering av endogene phosphoantigens som IPP. Mevastatin mislyktes i å hemme avliving av alle testede kjemoterapi-forbehandlede kolon CIC linjer ved to forskjellige allogene Vγ9Vδ2 T-cellelinjer (figur 5), noe som indikerer at kjemoterapi-indusert sensibilisering av CIC til Vγ9Vδ2 T-celle-cytotoksisitet ikke er avhengig av produksjonen av mevalonat metabolitter.
Vγ9Vδ2 T-cellelinje COLD2-1 ble dyrket med to kjemoterapi-behandlede kolon CIC CIC (# 3 og # 5 CIC) ved et E: T-forhold på 20:01, i nærvær av blokkerende antistoffer til den γδ TCR, CD3, NKG2D, eller i nærvær av mevastatin. Spesifikke cytotoksisitetstester nivåer oppnås ved Vγ9Vδ2 T cellelinje COLD2-1 var 65 ± 11 for CIC # 3 og 71 ± 9 for CIC # 5. Dataene er gjennomsnitt ± SD av to eksperimenter utført i tre eksemplarer. Prosent hemming med anti-NKG2D mAb var vesentlig annerledes enn verdier i alle andre grupper (* p 0,001).
For ytterligere å belyse mekanismene for drapet på kjemoterapi-sensitivisert kolon CIC av Vγ9Vδ2 T-celler, vi individuelt hemmet granulat eksocytose, TNF-α-, henger, og Fasl-mediert veier. Killing-inhiberings-forsøkene viste at Vγ9Vδ2 T-celle-cytotoksisitet av kjemoterapi-forbehandlede kolon CIC målene ble betydelig inhibert av anti-DR5-mAb, mens mAbs mot DR4, TNF-α, og Fasl, eller behandling med CMA for å blokkere granul-exocytose vei, alle klarte å hemme. Figur 6 viser representative data med to Vγ9Vδ2 T-cellelinjer og de to kolon CIC linjer, CIC # 2 og CIC # 4.
Vγ9Vδ2 T cellelinje COLD2-1 var dyrket med to kjemoterapi-behandlet kolon CIC ( CIC CIC # 3 og # 5) ved et E: T-forhold på 20:01, i nærvær av blokkerende antistoffer mot TNF-α, Fasl (CD95L), TRAIL-reseptorer R1 (DR4) eller R2 (DR5), eller concanamycin A (CMA). Spesifikke cytotoksisitetstester nivåer oppnås ved Vγ9Vδ2 T cellelinje COLD2-1 var 61 ± 7 for CIC # 3 og 65 ± 12 for CIC # 5. Dataene er gjennomsnitt ± SD av eksperimenter utført i tre eksemplarer. Prosent hemming med anti-DR5 og anti-TRAIL mAbs var vesentlig annerledes enn verdier i alle andre grupper (* p 0,001).
Diskusjoner
Det er nå fremstår som kreft er generert av en populasjon av celler som viser stemness funksjoner, kalt kreft stamceller eller kreft-celler initierer (CIC) [1], [2]. Disse celler, som bare bidrar til en liten brøkdel av den totale tumormasse, gjennomgår langvarig utvidelse med bibehold av deres evne til å reprodusere den opprinnelige tumor fenotype, og dermed gi bevis for selvfornyelse og tumor-initiere kapasitet [1], [ ,,,0],2]. CIC befolkningen er mer motstandsdyktig enn differensiert primære celler til konvensjonell kjemoterapi og strålebehandling, og til mulige innovative behandlinger for eksempel basert på bruk av TRAIL. Dette ildfasthet har blitt tilskrevet det faktum at CIC uttrykker multimedikament-resistens gener inkludert høye nivåer av anti-apoptotiske proteiner og ABC (ATP Bindings kassett) transportører som pumper ut medikamentene, men også til det faktum at kjemoterapi mål delende celler, og dermed ikke klarer å drepe sakte sykling CIC [3] -. [5]
data~~POS=TRUNC fra nyere kliniske studier har antydet at å kombinere kjemoterapi med immunterapi har overlevelse fordeler enn kjemoterapi alene [6], [29], som beskrevet for eksempel ved en kombinasjon av kjemoterapi og monoklonale antistoffer [30] – [32]. Videre er det kjent at kjemoterapeutiske medikamenter kan sensibilisere tumorceller for å cytotoksisitet mediert av CD8, NKT eller Vγ9Vδ2 T-celler [33] thorugh flere forskjellige mekanismer [34]. Men vi har nylig funnet at kolon CIC er motstandsdyktig mot Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksisitet, med mindre de er sensibilisert med zoledronate [35]: Tilsvarende har vi nå testet muligheten for at cellegiftene i dag brukes i behandling av kreft i tykktarmen kan også bevisst kolon CIC å Vγ9Vδ2 T-celle drap.
Første testing av cytotoksisitet avdekket at i analogi med våre tidligere rapporterte resultater [27], mange kolon CIC linjer var resistente mot den cytotoksiske aktiviteten til Vγ9Vδ2 T-celler, men forbehandling med lav, sublethal konsentrasjoner av cellegifter 5-FU og DXR sensitizes CIC mål til Vγ9Vδ2 T-celle drap, noe som resulterer i additiv cytotoksisitet aktivitet.
Vγ9Vδ2 T-celler kommuniserer med og drepe tumormål thorugh flere ulike mekanismer, inkludert granule eksocytose, død reseptor /ligander interaksjoner med TNF, TRAIL og Fasl, og TCR- eller NKG2D-mediert anerkjennelse av phosphoantigens eller stress-induserbar molekyler, henholdsvis. Alle testet kolon CIC linjer konstitutivt uttrykt mRNA som koder for HLA-klasse I, ICAM-1, CD155, CD112, MICA /B, ULPBP1-4, Fas (CD95), TNF-R1, DR4 (TRAIL-R1) og DR5 (TRAIL -R2) molekyler på deres overflate, men ekspresjon av alle disse molekylene ikke gjengi CIC følsom for Vγ9Vδ2 T-celle-dreping. Men eksponering av kolon CIC til 5-FU og, selv om det til en viss grad DXR, betydelig økt DR5 uttrykk.
Flere tidligere publiserte rapporter i litteraturen har vist at mange kjemoterapeutiske legemidler, inkludert 5-FU og DXR , oppregulere DR5 uttrykk på kreftcellelinjer tydelig vev opprinnelse [36] – [42]. Imidlertid har denne effekten blitt rapportert på differensierte kreftceller, mens til vår kunnskap, er det ingen bevis for lignende DR5 oppregulering på CIC. Hvorvidt kjemoterapi-indusert DR5 oppregulering er begrenset til kolon CIC eller er et generelt fenomen observert på andre CIC er faktisk under studien.
Likevel fant vi at Vγ9Vδ2 T-celler utnyttet ulike mekanismer for å drepe CIC mål, som var strengt avhengig av veien for målet CIC sensibilisering. Uansett om cellegifter eller zoledronate ble brukt til å bevisstgjøre CIC, Vγ9Vδ2 T-celler dreper av disse målene var TCR- eller NKG2D-mediert: i tråd med vår forrige rapport [27] kjemoterapi-sensitivisert kolon CIC ble drept etter NKG2D-mediert anerkjennelse og TRAIL /DR5 interaksjon, mens begge mekanismene var unnværlig til cytotoksisitet av zoledronate-sensitivisert kolon CIC, som ble nesten utelukkende drept av TCR-mediert interaksjon og perforin /granzyme sti.
Tidligere studier har understreket betydningen av NKG2D -MICA /B-interaksjoner for svulst celle anerkjennelse og effektiv cytotoksisk aktivitet av Vγ9Vδ2 T-celler [35] – [44]. Forskjellen mellom NKG2D-mediert gjenkjennelse av kjemoterapi-sensibiliserte kolon CIC og TCR-mediert gjenkjennelse av zoledronate-sensibiliserte CIC mål kan ikke forklares differensial ekspresjon av glimmer /B eller ULBPs siden verken 5-FU eller DXR endret konstitutiv ekspresjon nivåene av disse molekyler. Det er sannsynlig at phosphoantigens produksjon /uttrykk av kolon CIC er svært lav, under terskelen som kreves for effektiv anerkjennelse av det reaktive Vγ9Vδ2 TCR, derav målgjenkjenning bare skjer gjennom NKG2D: Oppdagelsen av at kolon CIC blir følsomme for Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksisitet ved eksponering til zoledronate [27], som forbedrer phosphoantigen akkumulering og produksjon, støtter denne muligheten.
Vi konkluderer med at
in vivo
aktivering av Vγ9Vδ2 T-celler eller adoptiv overføring av
ex vivo
-aktivert Vγ9Vδ2 T-celler, sammen med eller rett etter administrering av visse cellegifter kan øke sine anti-tumor effekter. Andre kliniske studier er derfor nødvendig for å vurdere effekten av denne combinatory terapi, eventuelt inkludert romanen γδ T cellebasert immunterapeutisk tilnærming som
ex-vivo
utvidelse av polyklonale γδ T-celler etterfulgt av innføring av en CD19-spesifikke kimære antigen reseptor gjengi dem bispesifikt og mer effektiv i drapet på CD19
+ tumorcellelinjer
in vitro Hotell og i xenografter [45].
Materialer og Metoder
perifert blod og tykktarmskreft Prøver
menneske~~POS=TRUNC perifere mononukleære blodceller (PBMC) og tykktarmskreft vev ble oppnådd i samsvar med de etiske standarder for den institusjonelle komiteen av menneskelig eksperimentering fra pasienter som gjennomgår et kolon reseksjon for colon adenokarsinom. Histologisk diagnose var basert på mikroskopiske trekk carcinoma celler som bestemmer histologisk type og kvalitet. PBMC ble isolert fra tykktarmskreftpasienter ved tetthetsgradient sentrifugering ved bruk av Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige) og ble oppbevart i 80% RPMI 1640 (Life Technologies, Monza, Italia), 10% DMSO (Sigma, St. Louis, MO) og 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS, Life Technologies).
Ifølge italienske regler (artikkel 13 i rettslig forordning nr. 196/03), denne studien ikke krever tillatelse fra den lokale etisk komité. Studien ble utført i henhold til prinsippene i Helsinki deklarasjonen og alle personer ga skriftlig informert samtykke til å delta.
Rensing og kultur av CIC
kreft vev ble grundig vasket i saltvann buffer som inneholder antibiotika og inkubert over natten i DMEM /F12 (Life Technologies) inneholdende penicillin (500 IU /ml), streptomycin (500 ug /ml) og amfotericin B (1,25 ug /ml) (Life Technologies). Enzymatisk fordøyelse ble utført ved anvendelse av kollagenase (Life Technologies, 1,5 mg /ml) og hyaluronidase (Sigma, 20 ug /ml) i DMEM inneholdende antibiotika /antimykotika i 1 time. Gjenvundne celler ble deretter dyrket i serumfritt medium (DMEM /F12) supplert med 6 mg /ml glukose, 1 mg /ml NaHCO3, 5 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 4 ug /ml heparin, 4 mg /ml BSA , 10 ng /ml βFGF, 20 ng /ml EGF, 100 ug /ml apotrasferrin, 25 ug /ml insulin, 9,6 ug /ml putrescin, 30 nM natriumselenitt vannfri og 20 nM progesteron (Sigma) til en sluttkonsentrasjon på 3 × 10
5 celler /ml. Disse kulturbetingelser velge for umodne kreftceller som sakte sprer, som gir opphav, i løpet av 2-3 måneder, til tumorcelleaggregater, kalt «kuler». Kule-dannende celler kan formeres ved enzymatisk dissosiasjon av kuler (3 mM EDTA, 50 nM DTT i PBS), etterfulgt av re-plettering av enkeltceller og rest små cellestørrelser i friskt serumfritt medium [28], [46] [47].
tumorigenitet ble evaluert ved subkutan implantasjon av enten disaggregerte tykktarmskreft sfære celler eller kule-avledet differensierte celler [27]. Differensierte tykktarmskreft cellelinjer DLD-1, ble SW620 og SW403 (American Type Culture Collection) hentet fra Dr. Ruggero De Maria ( «Regina Elena» National Cancer Institute, Roma, Italia) og ble opprettholdt i DMEM inneholder antibiotika og 10% FCS . Alle cellekulturer ble utført ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktet inkubator.
antitumormidler, Antistoffer og reagenser
kjemoterapeutika 5-fluorourcil (5 -FU) og doxorubicin (DXR) ble oppnådd fra Sigma, gjennom apotek ved Universitetssykehuset. Narkotika ble fortynnet i DMSO og fortynnet til de nødvendige konsentrasjoner i PBS før bruk
Følgende konjugerte, FITC-, PE, PE-Cy5- eller APC-konjugerte monoklonale antistoffer (mAbs) ble brukt. Anti -TCR Vδ2 (B6, BD Biosciences, San José, California), anti-NKG2D (1D11, eBioscience, San Diego, CA), anti-CD95L (2C101, Vinci Biochem, Firenze, Italia), anti-MICA /B (6D4 BD Biosciences)
i tillegg er følgende rensede mAbs ble også brukt. anti-CD3 (blokkering, MEM-57), anti-HLA klasse i monomorfe (MEM-147) fra Prof. Vaclav Horejsi (Institute molekylær genetikk, Praha, Tsjekkia), anti-TCR pan γδ (IMMU510, en gave av Dr. Marc Bonneville, Institut de Biologie, Nantes, Frankrike), anti-TNF-α (Infliximab, en gave av professor Giovanni Triolo , Dipartimento Biomedico di Medicina Interna e Specialistica, Università di Palermo, Palermo, Italia), anti-TRAIL reseptorer TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), TRAIL-R3 (LIT, DcR1) og TRAIL-R4 (TRUNDD , DcR2) alle levert av Dr. Henning Walczak (Tumor Immunology Unit, Division of Medicine, Imperial College, London, UK).
Concanamycin A (CMA) og mevastatin ble kjøpt fra Sigma, mens zoledronate var fra Novartis Pharma, Basel, Sveits.
Generering av polyklonale Vγ9Vδ2 T-cellelinjer
Polyclonal Vγ9Vδ2 T-cellelinjer ble generert ved først å anrike PBMC ved hjelp av en γδ T-celle isolasjon kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland), fulgt ved å sortere enkelt Vγ9Vδ2 T-celler via en FACSAria (BD Biosciences) med spesifikke mAbs. Celler (2 x 10
3) ble deretter dyrket i hver brønn av rundbunnet, 96-brønners plater inneholdende 2 x 10
4 bestrålt (40 Gy) og allogene PBMC, 2 x 10
3 bestrålt ( 70 Gy) EBV-transformerte allogene B-celler, 0,5 ug /ml PHA (Sigma) og 200 U /ml rekombinant interleukin-2 (Proleukin, Novartis Pharma). Økende linjer ble ekspandert i 200 U /ml IL-2 og restimulert hver 2. uke. Vanligvis celler ble samlet etter 4-6 uker med kultur som skal brukes for funksjonelle analyser
in vitro
.
cytotoksiske analysen
Target kolon CIC (10
5 cellsml) ble forbehandlet med 5-FU (2,5 til 250 ug /ml), DXR (0,025 til 2,5 uM) eller zoledronate (0,5 pM) i 24, 48 eller 72 timer. Celler ble vasket grundig i PBS og farget med CFSE (Merck, Milano, Italia) som følger: 50 ul CFSE ble tilsatt til 1 ml av mål-sfære cellesuspensjon (5 x 10
5 celler /ml) i PBS for å oppnå sluttkonsentrasjon på 2,5 uM CFSE. Cellene ble inkubert i 10 minutter ved 37 ° C og blandet forsiktig hver 5 min. Ved slutten av inkuberingen, ble 1 ml FBS tilsatt til cellesuspensjonen for å stoppe fargingsreaksjonen, og cellene ble sentrifugert ved 600 g i 5 minutter ved romtemperatur, vasket to ganger med kald PBS og resuspendert i serumfritt medium.
Vγ9Vδ2 T-cellelinjer ble resuspendert ved sluttkonsentrasjoner på 10
6 og 2,5 × 10
6 celler /ml, ble lagt til CFSE-farget target kolon CIC (1 × 10
5 ) og ko-kulturer ble opprettholdt i 6 timer i 37 ° C i nærvær av 5% av CO
2. Ved slutten av inkubasjonsperioden ble cellene vasket med PBS og farget med 20 ul av propidium jodid (PI, Sigma, 1 ug /ml) i 10-15 minutter på is. Til slutt 100 ul kald PBS ble tilsatt før oppkjøpet på en FACSCalibur cytometer (BD Biosciences). Beregningen av cytolytiske aktivitet var basert på graden av reduksjon av levedyktige målceller med evnen til å beholde CFSE og inkluderer PI (CFSE
høy PI
-) i henhold til referanse [27]
Blokkeringsmidler ble brukt til å evaluere mekanismene for Vγ9Vδ2 T-celle-mediert cytotoksisitet av kolon CIC. For å evaluere bidraget fra mevalonat metabolitter tumor målceller ble behandlet med mevastatin (25 uM i 2 timer) en selektiv inhibitor oppstrøms av mevalonat pathway. Etter denne inkuberingsperioden ble målceller vasket, og Vγ9Vδ2 T-celler tilsatt i nærvær av 25 uM mevastatin, for å opprettholde en konstant konsentrasjon av dette stoffet i løpet av inkubasjonen fordi dens effekt er hurtig reversibel [27]. Å inhibere perforin-mediert cytotoksisitet, ble Vγ9Vδ2 T-celler inkubert med concanamycin A (CMA, 15 nM) i 30 minutter ved 37 ° C før ko-kultur med target CIC, uten ytterligere vasking [27]. For å blokkere de relevante cytotoksiske trasé, ble spesifikke eller isotype-kontroll mAbs brukt på 10 mikrogram /ml endelig konsentrasjon like før co-inkubasjon analyse [27].
Sanntids Kvantitativ RT-PCR
