Abstract
Bezielle (BZL101) er en kandidat muntlig stoff som har vist lovende effekt og utmerket sikkerhet i tidlig fase kliniske studier for avansert brystkreft. Bezielle er en vandig ekstrakt fra urten
Scutellaria barbata
. Vi har rapportert tidligere at Bezielle var selektivt cytotoksisk til kreftceller mens sparsom ikke-transformerte celler. I tumor, men ikke i ikke-transformerte celler, Bezielle indusert generering av ROS og alvorlig DNA-skade, fulgt av hyperactivation av PARP, uttømming av det cellulære ATP og NAD, og hemming av glykolyse. Vi viser her at tumorceller «mitokondrier er den primære kilde for reaktive oksygenforbindelser indusert av Bezielle. Behandling med Bezielle induserer progressivt høyere nivåer av mitokondriell superoksid, så vel som peroksyd-type ROS. Inhibering av mitokondriell respirasjon forhindrer generering av begge typer ROS og beskytter cellene mot Bezielle-indusert død. I tillegg til glykolyse, hemmer Bezielle oksidativ fosforylering i tumorceller og tapper mitokondriell reservekapasitet frata celler av evnen til å produsere ATP. Tumorceller mangler funksjonelle mitokondrier opprett glycolytic aktivitet i nærvær av Bezielle dermed støtter hypotesen om at mitokondriene er det primære målet for Bezielle. De metabolske effektene av Bezielle mot normale celler er ikke signifikante, i overensstemmelse med lave nivåer av oksidative skader som Bezielle påfører dem. Bezielle er derfor et medikament som selektivt er målrettet kreftcelle mitokondrier, og skiller seg fra andre slike medikamenter ved sin evne til å indusere ikke bare inhibering av OXPHOS men også av glykolyse. Denne studien gir en bedre forståelse av mekanismen for Bezielle er cytotoksisitet, og grunnlaget for sin selektivitet mot kreftceller
Citation. Chen V, Staub RE, Fong S, Tagliaferri M, Cohen jeg, Shtivelman E (2012 ) Bezielle selektivt Targets Mitokondrier av kreftceller til å hemme glykolyse og OXPHOS. PLoS ONE 7 (2): e30300. doi: 10,1371 /journal.pone.0030300
Redaktør: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Canada
mottatt: 20 juli 2011; Godkjent: 12 desember 2011; Publisert: 03.02.2012
Copyright: © 2012 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet helt av BioNovo, Inc. Ingen ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Den Funder spilte en rolle i beslutningen om å forske Bezielle som en anti-kreft agent, men hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser.: forfatterne erkjenner at de er betalte ansatte og aksjonærer i BioNovo, Inc, og at denne studien, i sin helhet, ble støttet av midler fra BioNovo. Bezielle (BZL101) er Bionovo proprietære botaniske stoffet kandidat (FDA-IND: 59521) for behandling av metastatisk brystkreft. Bionovo s United States patent nr 7700136 omfatter en fremgangsmåte for behandling av brystkreft ved bruk av en ekstrakt av Scutellaria Barbata. Dette patentet omfatter også bruk av Bionovo proprietære BezielleR formulering som en monoterapi for behandling av brystkreft. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Bezielle (BZL101, FDA IND # 59,521) er et utdrag forberedt fra luftig deler urt
Scutellaria barbata Hotell som har anti-kreft egenskaper.
S. barbata
Ekstraktet ble vist å ha cytotoksisk aktivitet mot forskjellige tumorcellelinjer
in vitro product: [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7 ], [8], [9], [10] og antitumoraktivitet
in vivo product: [11], [12], [13] i modeller for renal, hepatocellulært karsinom og prostata. Enda viktigere, to tidlig stadium kliniske studier med Bezielle viste lovende effekt og utmerket sikkerhet for behandling av avansert brystkreft [14], [15]. I fase Ia kliniske studier seksten pasienter, som alle gikk gjennom flere behandlinger før innmelding var evaluerbare for respons. Fire pasienter hadde stabil sykdom for 90 dager (25%) og 3/16 hadde SD for 180 dager (19%). Fem pasienter hadde en objektiv tumorregresjon [15]. Etterfølgende liten skala eskaleringsstudie med en forbedret formulering av Bezielle viste en tilsvarende virkning lovende [14]. Behovet for nye medisiner for å dempe sykelighet og dødelighet av metastatisk kreft kan ikke understrekes nok. Spesielt er muntlig tilgjengelige medikamenter med mindre toksisitet presserende behov. Bezielle oppfyller disse udekkede behov, og større kliniske studier for å gi mer definitive data vedrørende sikkerhet og effekt er planlagt.
Vi har rapportert tidligere at Bezielle dreper selektivt kreftceller mens sparsom ikke-transformerte celler
in vitro
[8], [15]. Denne selektivitet kan konto for sin overlegne sikkerhetsprofilen vist i tidlige kliniske studier sammenlignet med andre godkjente cytostatika. Til dags dato, analyser av de cellulære effekter av Bezielle har avslørt at grunnlaget for Bezielle selektivitet er dannelse av høye nivåer av reaktive oksygenarter (ROS) i tumorceller som er sterkt dempet i normale celler. ROS indusert ved Bezielle forårsake utstrakt skade på DNA og hyper aktivering av PARP-1 i tumorceller. Betydelig, Bezielle induserte en beskjeden DNA-skader i ikke-transformerte celler som ble reparert og ikke involverer en hyper aktivering av PARP [8]. I tumorceller, aktivering av PARP utarmet NAD + og ATP som brukes for å syntetisere poly-ADP-ribose for PAR-ylation av et antall cellulære proteiner som er involvert i DNA-skade reparasjon, transkripsjonen kontroll og regulering av cellesyklusen [16], [17] , [18]. Uttømming av cytosolisk NAD + er sannsynligvis årsaken til den etterfølgende selektiv hemming av glykolyse [19], [20], [21] som er observert i Bezielle behandlede tumor, men ikke i normale celler [8]. Hemming av glykolyse samt sammenbruddet av redoks status (manifestert i uttømming av NADPH og GSH i tumorceller behandlet av Bezielle) er den sannsynlige årsaken til celledød utløst av Bezielle. Faktisk viser våre resultater at Bezielle induserer hovedsakelig nekrotisk død [8] som er kjent for å være assosiert med den hyperaktive av PARP-1 [21], [22], [23]. En nylig detaljert kombinert proteomikk og metabolomic analyse av brystkreftceller behandlet med Bezielle viste induksjon av oksidativt stress skade, etterfulgt av omfordeling av metabolske flukser [24]. Spesielt ble tre familier av enzymer involvert i vedlikehold av redokspotensial påvirket av Bezielle: glutathione- og thioredoxin relaterte proteiner og peroxiredoxins. Den største undergruppe av proteiner berørt av Bezielle var de involvert i metabolske veier, inkludert glykolyse, Krebs syklus og fettsyremetabolisme. Disse dataene støtter hypotesen om at Bezielle kritisk påvirker kreftceller metabolisme via oksidativ skade.
I denne studien har vi ytterligere analysert mekanismene for Bezielle indusert celledød og dens selektivitet. Vi rapporterer at mitokondrier er den primære cellulære mål for Bezielle, og de tidligere beskrevne cellulære konsekvenser av behandling med Bezielle utløses gjennom virkningene av denne botanisk ekstrakt på mitokondrier. Ved å undersøke de metabolske effektene av Bezielle har vi funnet ut at Bezielle hemmer ikke bare glykolyse men også oksidativ fosforylering, og dermed går på bekostning av både mobilenergiproduksjon veier.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
Bezielle ekstrakt ble fremstilt som beskrevet tidligere for den kliniske grad av materiale [15]. I korte trekk ble den tørkede rå urt malt til et fint pulver, tilsettes i et forhold 01:10 (vekt til volum) for å forvarmes vann og boblet ved 80 ° C i 30 minutter. Supernatanten ble atskilt fra de uoppløselige faste stoffer ved sentrifugering ved 5000 rpm, og utsatt for en frysetørking. Det resulterende pulver ble oppløst i vann ved 50 mg /ml og sterilfiltrert før bruk.
difenylen -jod (DPI), N-acetyl-cystein, apocynin, FCCP (p-trifluormetoksy karbonyl cyanid fenyl-hydrazon), antimycin, og andre kjemikalier ble innkjøpt fra Sigma. Fluorescent indikatorer på ROS CM-H
2DCFDA og MitoSox Red var fra Molecular Probes /Invitrogen. Antistoffer mot PAR var fra Becton Dickinson, til NOX4 fra Epitomics, til subenhet 2 av mitokondrie kompleks IV fra Mitosciences, til LC3 fra Abgent, og å SQSTM fra Cell Signaling.
Cell kultur og behandlinger
Alle cellelinjer ble erholdt fra ATCC. MDAMB231 ble dyrket i RPMI med 10% FCS. MCF10A ble dyrket i DME /F12 med 5% FCS, 50 ug /ml hypofyse-ekstrakt, 10 ug /ml insulin, 0,5 ug /ml hydrokortison og 0,02 ug /ml EGF (Sigma). Hs578T og SKBR3 celler ble dyrket i DMEM med 10% FCS. Fremstilling av den vandige ekstrakt av Bezielle ble beskrevet tidligere i [8]. Celler ble behandlet med Bezielle på 250 ug /ml (tørr vekt pr volum) med mindre annet er angitt i de Legends til figurene, eller med vann (merket som «ubehandlet» gjennom papiret). Alle behandlinger med Bezielle ble gjort i full vekst media mangler pyruvat.
Måling av ROS
Ferske bestander av ROS indikatorer CM-H
2DCFDA og MitoSox Red ble utarbeidet i DMSO ved en konsentrasjon på 0,5 mM og fortynnet i varm vekstmedier til konsentrasjon på 2,5 uM. Mediet inneholdende en av indikatorfargestoffer ble tilsatt til cellene. Etter inkubering av kulturer med probene i 20 minutter, ble cellene vasket med PBS, ble behandlet med trypsin og høstet for analyse ved hjelp av FACS. Fluorescens fra CM-H
2DCFDA ble samlet på FL1 kanal, og for MitoSox Red på FL2 kanal. Hvert eksperiment inkluderte celler som ikke ble utsatt for behandling med Bezielle. Fluorescens nivåer av disse ubehandlede celler ble tildelt en vilkårlig verdi på 1, og fluorescens av Bezielle behandlede celler er vist i figurene som «dobling» over ubehandlede celler
Lentivirus -. Mediert siRNA og genuttrykk
For NOX4 stanse, konstruerer seks shRNA i LKO plasmid vektor ble kjøpt fra Open Biosystems /Thermo. Virus ble produsert i HEK293 celler i henhold til produsentens instruksjoner og brukes til å transduce celler, etterfulgt av valg i forhåndsbestemte konsentrasjoner av puromycin.
Målinger av celle levedyktighet, celletall og apoptose
Celleviabilitet ble bestemt ved bruk av CCK-8 kit (Dojindo). Celledød-analyse ble utført ved anvendelse av Annexin V /propidiumjodidfarging etterfulgt av strømningscytometri. Celler ble oppsamlet ved trypsinering i deres kulturmedia, vasket med PBS og farget med Annexin V-FITC (BioVision) og propidiumjodid (PI) og analysert umiddelbart etter en 5 minutters inkubasjon ved hjelp av Cellquest-programvare på en FACScan (Becton Dickinson). ATP-nivåer ble kvantifisert med ATP Bioluminesens testsettet HS II (Roche Applied Science).
Kvantifisering av redusert glutation hjelp fluorescerende probe monobromobimane
Celler i 96 brønners plater ble behandlet som ønsket, behandling media ble fjernet og erstattet med media som inneholder 8 mikrometer monobromobimane (MBB). Fluorescens ble avlest på en plateavleser med filtre satt til eksitasjon på 360 nm og emisjon ved 460 nM.
Western blot-analyse
Hele cellelysatene ble underkastet elektroforese på SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner . Membranene ble blottet med antistoffer i anbefalte konsentrasjoner over natten ved 4 ° C og de bundne primære antistoffer ble påvist ved anvendelse av peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer. Blottene ble utviklet ved hjelp av SuperSignal forbedret chemiluminescence kit (Pierce) og avbildes på Kodak Imager ISR2000.
Comet Assay
Comet analysene ble utført ved hjelp av Comet assay kit fra Trevigen i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene høstet, vasket og resuspendert med PBS. Cellene ble kombinert med smeltet, lavt smeltepunkt agarose ved 37 ° C og pipettert til Comet lysbilder. Agarosen ble tillatt å stivne ved 4 ° C i 30-40 minutter, og objektglass ble neddykket i kald lyseringsløsning (Trevigen, Inc.) i 30 minutter ved 4 ° C. Platene ble nedsenket ved siden inn i nyfremstilt alkali-oppløsning (300 mM NaOH og 1 mM EDTA) i 20 minutter og underkastet elektroforese i de samme alkaliske buffer ved 15 V (0,5 V /cm) og 300 mA i 25 min. Platene ble skyllet i vann og fiksert i 70% etanol i 5 min. Etter luft-tørking ble kjernene farget med SYBR grønn (Trevigen, Inc.) og sett under et fluorescens mikroskop. Prosenter av celler med kometer ble kvantifisert ved to observatører blindet til identiteten til lysbildene. Kjerner ble også fotografert og analysert med TriTek CometScore bildeanalyse programvare. Oliven hale øyeblikk, definert som produktet av prosent DNA i halen og forskyvning mellom posisjonen av de midlere sentrene av masse i de hoder og haler, ble bestemt for minst 40 celler per sample.
Metabolsk analyser Seahorse XF96 ekstracellulær Flux Analyzer
celler ble belagt over natten på XF96 PET 96 brønners plater ved eksperimentelt forhåndsbestemte numre (10 × 10
3 celler per brønn for MDAMB231 og 12 × 10
3 celler per brønn for MCF10A). Metabolsk flukser ble analysert på Seahorse XF96 analysator i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere [25]. Basal ECAR (ekstracellulære forsuring rate, i mph /min), OCR (oksygenforbruk, i pmol O
2 /min) og PPR (normalisert proton produksjon rente, i nmol H + /min) verdiene ble målt i 4 sykluser. Hver syklus besto av en 3 minutter media blandetiden og en 5 minutters målinger tid. Etter måling av basale nivåer av ECAR og OCR for 4 sykluser, ble det mitokondrielle uncoupler FCCP 1 mikrometer automatisk injiseres i de eksperimentelle brønner for å kvantifisere den maksimale pustekapasitet, eller mitokondriell reserve. Etter en syklus av målinger inhibitor for mitokondriell kompleks III antimycin A på 5 uM ble injisert i de eksperimentelle brønnene, og en annen målesyklus ble utført for å verifisere at oksygenforbruk var mitokondriell opprinnelse. Hvert eksperimentelt punkt var i gjennomsnitt 6 til 10 replikerte brønner i hvert forsøk, og Forsøkene ble gjentatt minst 3-4 ganger. Eksperimentelle data ble ansett akseptabelt bare når variasjoner i pH-verdier mellom mix og måle sykluser var mindre enn 0,05-0,1 pH-enheter. Dette sikret at ECAR data ikke var kunstig endret ved endringer i pH-verdier, og i virkeligheten nøye parallell endringer i PPR-verdier. Normalisering av verdier oppnådd i XF96 analyser ble utført med kvantifisering av cellulær DNA på eksperimentelle plater med CyQuant analysen (Promega). Alle XF96 data er uttrykt som ECAR eller OCR verdier normalisert til DNA innhold.
Resultater
Rollen mitokondrier i induksjon av ROS og celledød ved Bezielle
har rapportert tidligere at Bezielle selektivt cytotoksisk til brystcancercellelinjer, men ikke i ikke-transformerte celler slik som bryst immortaliserte celler og primære fibroblaster, som er forholdsvis motstandsdyktige mot sin cytotoksiske virkning [8]. Vi har siden testet Bezielle sin cytotoksisitet i over to dusinvis av kreftcellelinjer og fire forskjellige immortaliserte cellelinjer og primære celler. Vi har observert at i gjennomsnitt de ikke-transformerte celler er mye mindre følsom for Bezielle at kreftcellelinje (manuskript under forberedelse). Figur 1A illustrerer disse observasjonene med to cellelinjer: brystkreft linje MDAMB231 og udødelig epitel linjen MCF10A. Vi har observert at følsomheten til Bezielle generelt ikke korrelerer direkte med formeringshastigheten av de cellelinjer (data ikke vist). Således er den formeringshastigheten av de ikke-transformerte celler MCF10A faktisk noe høyere enn den for cancercellelinjer MDAMB231, og er mye høyere enn den til andre brystcancercellelinjer som er følsomme overfor Bezielle [8].
A. Bezielle induserer celledød i kreftceller, men er mindre cytotoksisk mot ikke-transformbrystceller. Brystkreftcellelinje MDAMB231 og ikke-transformerte linje MCF10A ble behandlet med Bezielle ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer, og cellenes levedyktighet ble kvantifisert ved bruk av CCK-8 assay kit. Resultatene er gjennomsnitt ± S.E. (N = 4). B. Celler ble behandlet med Bezielle ved 250 ug /ml i en halv time eller 6 timer, lastet med ROS-sensitive sonder, og analysert ved strømningscytometri for grønn (H
2DCFDA) eller rød (MitoSox) fluorescens. Resultatene er uttrykt som ganger økning i fluorescens i de behandlede celler sammenlignet med ubehandlede probe belastede celler. Resultatene er gjennomsnitt ± S.E. (N = 3). Signifikante forskjeller mellom MDAMB231 og MCF10A er indikert (** P 0,01). C. Western blot-analyse av MDAMBRho-0-celler valgt i lav konsentrasjon av etidiumbromid bekrefter eliminering av mitochondrially kodede underenheten 2 på åndedrett komplekse IV, og derfor inhibering av OXPHOS. D Analyse av ROS induksjon i Rho-0-cellene utføres slik det er beskrevet i BE Analyse av celledød induksjon ved Bezielle i Rho-0-celler utført som beskrevet i A. Betydelige forskjeller mellom de angitte grupper er indikert (* P 0,05, ** P . 0,01)
induksjon av døden i kreftceller ved Bezielle er en direkte konsekvens av induksjon av ROS og oksidativt stress, fordi samtidig behandling med antioksidanter N-acetyl-cystein (NAC) eller pyruvat hemmet DNA-skade og celledød [8]. Vi forsøkte å identifisere de cellulære kildene til Bezielle-indusert ROS. Cellelinjer ble behandlet med Bezielle for forskjellige tider og lastet med celle-gjennomtrengelige indikatorer på ROS CM-H
2DCFDA det blir fluoriserende respons på peroksyd-type oksygenradikaler [26], eller MitoSox Red, sterkt selektive for mitokondrielle superoksyd [ ,,,0],27]. Vi har observert en gradvis tidsavhengig økning i ROS i brystkreftcellelinjer MDAMB231 og SKBR3, men ikke i MCF10A celler etter behandling med Bezielle (figur S1). Figur 1B illustrerer ROS-nivåer ved 30 minutter og 6 timer etter behandling. Data er uttrykt som ganger økning i fluorescens over den sett i ubehandlede celler ladet med den fluorescerende indikator. MDAMB231 produserte mer enn ROS MCF10A celler allerede etter de første 30 minutters inkubering med Bezielle, men med tiden forskjellen i ROS-nivåer indusert i de to cellelinjen ble stadig mer markert. På seks timer med behandling både peroxide og mitokondrie superoksid ble økt med ca fem og seks ganger, henholdsvis i MDAMB231 celler. Økningen i ROS-nivåer i MCF10A var mye mer beskjeden, og så vidt overskredet to ganger i løpet av de basale ROS-nivåer, selv etter 6 timers behandling (figur 1B). Det er mulig at den kontinuerlig akkumulering av ROS i tumorcellelinjer er direkte relevant for deres følsomhet for Bezielle
Resultatene stilte et spørsmål angående innholdet i peroxide typen radikaler forårsaket av Bezielle. Nemlig ikke Bezielle indusere både peroxide og superoxide, eller er peroxide bare en konvertering produkt av mitokondrie superoxide? Tatt i betraktning at superoksid er en kort levde arter av reaktivt oksygen, de høye nivåene av det observert ved 6 timer er trolig på grunn av kontinuerlig generasjon av mitokondrier. De tilsvarende høye nivåer av peroxide typen ROS kunne følge av konvertering av superoksid til peroxide av superoksid dismutase.
For å undersøke hvilken rolle mitokondrie superoxide i celledød indusert av Bezielle, har vi ansatt en velprøvd metode av invalidiserende mitokondriell respirasjon ved å dyrke celler i nærvær av etidiumbromid. Etter dyrking av cellene i lav konsentrasjon av etidiumbromid i 6 uker, har disse cellene (MDAMB231Rho-0) tapt ekspresjon av mitokondrielle proteiner som er kodet i mitokondrie genome som vist i figur 1C, slik at mitokondrier ikke funksjonelle. Dette ble også bekreftet ved å undersøke mitokondriell oksygenforbruk på MDAMB231 Rho-0-celler, som var sterkt redusert (se nedenfor, Fig. 6). De Rho-0-cellene ble behandlet med Bezielle, og kontrollert for induksjon av ROS og celledød. Figur 1D viser at MDAMB231 Rho-0-celler, som ventet, ikke genererer mitokondriell superoksyd i respons til Bezielle, noe som bekrefter rollen av mitokondriell elektrontransport i induksjon av ROS ved Bezielle. Nivåer av peroxide generert i Bezielle behandlet Rho-0 celler ble noe økt på 30 minutter med inkubasjon, men viste ingen ytterligere økning over tid (figur 1D), en sterk støtte for vårt forslag at høye peroxide nivåer kan skyldes i stor grad til konvertering av mitokondrie superoxide. Viktigst, MDAMB231 Rho-0-cellene ble veldig sterkt beskyttet mot celledød indusert av Bezielle (figur 1E) tyder sentral rolle mitokondriene i døden av tumorceller behandlet med Bezielle.
Potensielle andre cellulære kilder ROS indusert av Bezielle
de data som er beskrevet ovenfor tungt implisere mitochondrially generert superoxide i Bezielle cytotoksisitet. Imidlertid, mens induksjon av mitokondriell superoksyd ved Bezielle ble fullstendig forhindret i Rho-0 celler, CM-H
2DCFDA påvisbart peroksyd-typen ROS, som nevnt ovenfor, ble ikke fullstendig opphevet (figur 1D). Vi har vurdert muligheten for at noen andre cellulære enzymer som er i stand til å produsere peroxide eller ekstra-mitokondrie superoxide kan bidra til oksidativt stress forårsaket av Bezielle. Vi har brukt hemmere av flere cellulære enzymer som produserer ROS: difenylen -jod (DPI) og apocynin for hemming av NADPH oksidase; allopurinol å inhibere xantine oksidase, nordihydroguaiaretinsyre (NDGA) for å hemme LOX, og nitro-L-arginin-metylester (L-NAME) for å hemme nitrogenoksydsyntase. MDAMB231 celler ble behandlet med Bezielle i nærvær av hver av disse inhibitorer, og graden av celledød, så vel som ROS-induksjon ble kvantifisert i relevante analyser. Ingen av inhibitorene redusert ROS-nivåer i Bezielle-behandlede celler med unntak av DPI (ikke vist og figur 2A). På samme måte, med unntak av DPI, viste ingen ingen beskyttende effekt på celledød (ikke vist).
A. MDAMB231 celler ble inkubert med Bezielle i fravær eller nærvær av 0,75 pM DPI i 6 timer og kontrollert for ROS produksjon. B. celledød i MDAMB231cells behandlet med Bezielle i 24 timer i fravær eller nærvær av 0,75 mikrometer DPI. Alle resultater i A og B er gjennomsnitt ± S.E. (N = 3). Signifikant forskjell (* P 0,05, ** P 0,01) mellom de indikerte gruppene er vist. C, Celledød i bryst carcinoma celler SKBR3 behandlet med Bezielle i 24 timer i fravær eller nærvær av 0,75 pM DPI. Resultatene er gjennomsnittet av to eksperimenter.
Figur 2A viser hemming av både peroksidtype ROS og mitokondrie superoksid produksjon av DPI i Bezielle-behandlede celler. Den observerte sterk hemming av mitokondriell superoksid av DPI var uventet, siden hemming av NADPH oksidase (NOX) ikke bør ha en dyp effekt på mitokondriene, selv om noen publiserte studier antyder eksistensen av en krysstale mellom Nox aktivering og mitokondrie produksjon av superoksid [28], [29]. Imidlertid DPI ble også rapportert å være en potent inhibitor for mitokondriell superoksydproduksjon sannsynligvis gjennom ikke-spesifikk hemning av NADH-ubikinon oksidoreduktase i mitokondrie-kompleks I [30].
Ikke overraskende inhibering av Bezielle indusert produksjon ROS ved DPI hadde en beskyttende effekt på Bezielle-indusert celledød (figur 2B). Selv om DPI alene var noe cytotoksisk for celler, det sterkt svekket celledød indusert av Bezielle (figur 1E). For å utelukke at effekten av DPI behandling er et spesielt trekk ved MDAMB231 celler har vi undersøkt effekten av DPI på celledød i en ekstra brystkreft cellelinje SKBR3. De SKBR3 cellene viste en enda sterkere beskyttelse av DPI enn MDAMB231, noe som indikerer at den beskyttende virkning av DPI mot Bezielle er ikke et isolert fenomen (figur 2C).
Vi har derfor undersøkt om den ikke-fagocyttiske NOX kjent uttrykkes i brysttumorer [29], [31] kan være involvert i Bezielle cytotoksisitet. Resultatene av disse eksperimentene er vist i figur S2. Kort fortalt, selv om NOX4 ser ut til å bli oppregulert ved Bezielle i tumorceller, delvis stanse av sitt uttrykk i MDAMB231 celler indikerte at NOX4 produsert ROS ikke spille en betydelig rolle i celledød indusert av Bezielle.
Spørsmålet imidlertid fremdeles holdt seg om mekanismen i det mitokondrielle ROS reduksjon av DPI. Vi har funnet at DPI, selv ved lav konsentrasjon som brukes her, hemmer mitokondriell respirasjon (se nedenfor), og således, i kraft, virker som inhibitor for OXPHOS, lik den ablasjon av mitokondriell funksjon i Rho-0-celler.
Induksjon av DNA-skader
Bezielle induserer oksidativ DNA skade som er avgjørende for dens evne til å selektivt drepe kreftceller [8]. Vi har undersøkt hvordan mangel på funksjonell mitokondrier og behandling med DPI påvirker induksjon av DNA-skade ved Bezielle i MDAMB231 celler. Celler behandlet med Bezielle ble analysert ved Comet assay for to parametere av DNA-skade: prosent av celler med skadet DNA, og den oliven moment (som gjenspeiler graden av DNA-skade i individuelle celler). Som vist i figur 3A, behandling med Bezielle resulterte i progressivt økende antall celler med DNA-skade i opptil 6 timer. Etter dette tidspunktet, døde celler med delvis degradert eller alvorlig skadet DNA startet innsamling, slik at kometen kvantifisering vanskelig. Analyse av kometen halen øyeblikket (figur 3B) viste en sterk økning av DNA-skader per celle indusert av Bezielle over tid. Den økende mengde av DNA-skade per celle i en tidsavhengig måte korrelerer godt med den observerte økningen i ROS-nivåer (figur 2B).
A. MDAMB231 kontrollceller (MM231), MDAMB231 Rho-0 variant (RHO-), eller MDAMB231 celler i nærvær av DPI (+ DPI) ble behandlet med Bezielle for tiden angitt og utsatt til alkalisk Comet assay analyse. Resultatene er vist i prosent av cellene som danner kometer, gjennomsnitt ± S.E. (N = 3). Signifikante forskjeller (* P 0,05, ** P 0,01) mellom de Rho-0 og kontrollgruppene, og mellom DPI-behandlede og kontrollgruppene er vist. B. Samme eksperimenter som i A, men resultatene er middeloliven øyeblikk av kometene indusert av Bezielle i tre cellepopulasjoner. Minst 50 komet ble analysert pr hvert tidspunkt i fire separate forsøk. ble observert mellom kontrollceller og både Rho- og DPI-behandlede grupper; signifikante forskjeller (0,01 ** P 0,05, ** P 0,01) mellom celler behandlet i 30 minutter sammenlignet med både 2 og 6 timer er vist. D. Western blot-analyse av PARP-aktivering (PAR) i de indikerte celler behandlet med Bezielle i 1 time. Også vist er mangelen på ekspresjon av det kodede protein mitochondrially (kompleks IV subenhet II) i Rho-0-celler, ekspresjon av mitokondrie protein VDAC kodet i kjerne-DNA, så vel som β-actin som en lasting kontroll. E. MDAMB231 celler og MDAMB231-Rho-0-celler ble behandlet med Bezielle for de angitte tider og analysert for tilstedeværelse av poly-ADP-ribosylert proteiner. β-actin tjener som en lasting kontroll.
MDAMB231 Rho-0-celler, mindre enn halvparten av cellene i den behandlede populasjonen viste tilstedeværelse av DNA-skade, selv etter 6 timer (figur 3A), og oliven øyeblikk analyse oppdaget at lave nivåer av DNA-skade per celle som ikke øke over tid (figur 3B). Tilstedeværelse av DPI hatt begrenset effekt på antallet av celler med DNA-skade, men hadde en sterk hemmende effekt på økningen i DNA-skade per celle over tid. Den svake virkning av DPI på antallet av celler med DNA-skade kan være relatert til den svakere beskyttende virkning av DPI mot Bezielle indusert død sammenlignet med beskyttelse i Rho-0-cellene (figur 1E og 2B).
Vi har også analysert Bezielle induserte DNA-skade i MCF10A celler, og har observert at selv i den kontinuerlige nærvær av Bezielle i vekstmediet, ble DNA-skade i disse cellene reduseres gradvis over tid (figur 3C). Vi foreslår at mye lavere nivåer av ROS indusert i MCF10A celler (figur 1B) førte til begrenset nivåer av DNA-skader som ble vellykket reparert. Dette kan forklare den tidsavhengige reduksjon av DNA-skade i MCF10A cellene.
Vi har dokumentert hyper aktivering av PARP i tumorceller behandlet med Bezielle, og dens rolle i induksjonen av celledød. Vi har undersøkt om PARP ble aktivert i MDAMB231 Rho-0 celler eller i DPI-behandlede celler. Som vist i figur 3D, ble PARP sterkt aktivert i MDAMB231 celler. I Rho-0 celler, PARP aktivering var betydelig mindre robust. I DPI-behandlede celler, Bezielle aktivert PARP til nivåer i mellom disse observert i kontroll versus Rho-0 celler (Figur 3D). PAR-ylation av proteiner i MDAMB231 celler fortsatte i timer etter start av behandling med Bezielle, men i Rho-0-cellene aktivering av PARP var ikke bare mye svakere, men også av forbigående natur (figur 3E). Til sammen dataene ovenfor viser at mangel på funksjonelle mitokondrier sterkt hemmet induksjon av ROS, DNA skade, aktivering av PARP og celledød ved Bezielle. Vi konkluderer derfor med at mitokondriene er den primære celle målet for Bezielle.
Kreftceller behandlet med Bezielle gjennomgå en kollaps av oksidativt forsvarssystem
Tidligere publisert analyse av transkripsjons endringer indusert av Bezielle i tumorceller [8] indikerte at glutation redoks-systemet er involvert i cellulær respons overfor Bezielle, en konklusjon understøttes av den siste proteomic og metabolomic analyse [24]. Således ble det observert forhøyet ekspresjon av cystationin-beta-syntase og glutamat cystein ligase modifiserende middel GCLM i Bezielle behandlede tumorceller, men ikke i ikke-transformerte celler. Derfor har vi undersøkt nivåer av redusert glutation (GSH) i celler behandlet med Bezielle. Resultatene i figur 4A viser en sterk og rask nedgang av GSH i MDAMB231 celler. Nivåer av GSH ble noe redusert i MCF10A, men nedgangen i GSH var relativt mild og ikke vedvarende. Ved lengre inkubasjonstider, GSH ble nesten helt oppbrukt i MDAMB231-celler (ikke vist). GSH er en viktig antioksidant, og konvertering av oksidert GSH (GSSG) til GSH krever NADPH. Vi har derfor undersøkt nivåer av NADPH i celler behandlet med Bezielle. Selv etter bare 4 timer (figur 4B) var det en dyp uttømming av NADPH i MDAMB231 celler.
