Abstract
I tidligere studier, parasporin-2Aa1, opprinnelig isolert fra
Bacillus thuringiensis
stamme A1547, viste seg å være cytotoksisk mot spesifikke humane kreftceller, men virkningsmekanismer ble ikke undersøkt . I denne studien fant vi at proteinase K aktivert parasporin-2Aa1 protein isolert fra en roman
B
.
thuringiensis
belastning, 4R2, var spesielt cytotoksisk til endometrial, tykktarm, lever, livmorhals, bryst og prostata kreft. Den viste ingen toksisitet mot normale celler. Etter behandling med proteinase K-aktivert parasporin-2Aa1, ble det observert morfologiske forandringer og western blot-analyse viste at spaltingen av poly (ADP-ribose) polymerase, caspase-3 og kaspase-9 i kreftcellelinjer utelukkende, en indikasjon av programmert celledød, apoptose. Flowcytometri analyser, ved hjelp av propidiumjodid og annexin V, samt en caspaser 3/7 analysen bekreftet apoptose-induksjon. Ytterligere analyser ble utført for å studere overlevelsesreaksjonsveier, inkludert AKT, XIAP, ERK1 /2 og PAR-4, en kjent induser av apoptose. Disse resultatene indikerer at parasporin-2Aa1 er en selektiv cytotoksisk protein som induserer apoptose i ulike humane kreftcellelinjer fra ulike vev
Citation. Brasseur K, Auger P, Asselin E, Parent S, Côté JC, Sirois M (2015) Parasporin-2 fra en New
Bacillus thuringiensis
4R2 Strain induserer Kaspaser Aktivering og apoptose i humane kreftceller. PLoS ONE 10 (8): e0135106. doi: 10,1371 /journal.pone.0135106
Redaktør: Ferenc Gallyas, Jr., Universitetet i Pecs Medical School, UNGARN
mottatt: 9 april 2015; Godkjent: 16 juli 2015; Publisert: 11 august 2015
Copyright: © 2015 Brasseur et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av den interne UQTR forskergruppen. Kevin Brasseur var innehaver av et doktorgradsstipend fra den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR). Eric Asselin er innehaver av Canada Research Chair i molekylær gyneco-onkologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bacillus thuringiensis
er en Gram-positiv bakterie som produserer krystallinske parasporale slutninger under sporulation. Disse inneslutninger er laget av proteiner, de A-endotoksiner. De er klassifisert i to familier, krystall (Cry) og cytolytiske (CYT) proteiner kodet av
gråte Hotell og
sitte
gener, henholdsvis [1,2]. De Cry proteiner har blitt grundig studert siden 1970-tallet på grunn av sine spesielle insekt aktiviteter mot Lepidoptera, tovingede og coleopteran [3]. Ved inntak av en utsatt insekt, er parasporale slutninger oppløst i den alkaliske insekt midgut, ropet protoxins frigjøres og deretter behandles av midgut proteaser for å gi aktiverte toksin proteiner. Disse binder seg til spesifikke reseptorer lokalisert på membranen av epitel-tarmceller, som fører til poredannelse og i siste instans til insektdød [1,4].
Den vellykkede utvikling og bruk av
B
.
thuringiensis
-baserte formuleringer for bekjempelse av skadeinsekter har ført til isoleringen av tusener av nye stammer og hundrevis av Cry-proteiner er nå blitt karakterisert i varierende grad [5]. Flere studier har vist at ikke insekt Cry proteiner er mer utbredt enn de insekt Cry proteiner [6]. Dette førte til forskning av potensielt nye biologiske aktiviteter fra de ikke-insekt Cry proteiner. Etter en stor screening, noen ikke-insekt og ikke-hemolytiske Cry proteiner viste cytotoksisk aktivitet mot humane kreftceller og disse nye
B
.
thuringiensis
toksiner ble kalt parasporins [7,8]. Så langt, seks familier av parasporins, PS1 -PS6, har blitt identifisert [9]. Hver parasporin familie viser bestemt spektrum og virkningsmekanisme mot humane kreftceller.
Parasporin-2Aa1 (PS2Aa1, også klassifisert Cry46Aa1) produsert av
B
.
thuringiensis
serovar
Dakota
belastning A1547 har blitt intenst gransket for sin giftige aksjon i kreftceller [9-11]. Når den aktiveres med proteinase K, er PS2Aa1 minst 400 ganger mer giftig for den menneskelige kreftcellelinje HepG2 (human hepatocytt-kreft) enn for den normale human cellelinje HC (human normal hepatocytter), og humane kreftcellelinje HeLa (human livmorhals kreft) [12]. I HepG2-celler, synes den monomere toksinet til å binde til en ukjent reseptor-protein lokalisert i lipid flåten [13]. Når bundet til reseptoren, oligomerizes PS2Aa1 for å permeabilisere membranen som fører til poredannelse [11,12]. En glykosylfosfatidylinositol (GPI) -anchored proteinet ser ut til å være involvert for effektiv cytocidale effekten av PS2Aa1 [13]. Poredannelse resulterer i endringer av cytoskeletal strukturer, fragmentering av organeller, forandringer i cellemorfologi slik som cellesvelling og endelig cellelyse [11]. Modusen av celledød synes å være ikke-apoptotiske men denne hypotese ble ikke bekreftet [11-13]. Dermed ytterligere karakterisering av de intracellulære hendelser som er involvert i induced- PS2Aa1 celledød var obligatorisk å bekrefte hvorvidt apoptose var involvert.
I denne studien, en ekstra
B
.
thuringiensis-stamme kalt
Bt
4R2 som inneholder genet som koder for proteinet Cry46Aa1 (PS2Aa1) er blitt undersøkt for å identifisere de mekanismene som er involvert i cytocidale-avhengig celledød induksjon. Vi fant ut at PS2Aa1 var svært cytotoksisk til mange kreftceller
in vitro
. For ytterligere å undersøke mekanismen ved hjelp av utvalgte kreftceller fra forskjellige vev (HepG2-hepatocytter kreft, PC-3-prostatakreft og MCF-7-brystkreft) har vi funnet at apoptose celledød var oppstått via caspaser og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage. Vi fant også at PS2Aa1 viser svært lav giftighet for normal cellelinjer (IOSE-144, HIESC, HIEEC og MCF-10A).
Vi støtter videre hypotesen om apoptoseinduksjon med identifisering av ulike overlevelses pathway hemming inkludert AKT , XIAP, ERK1 /2 og induksjon av tumor suppressor PAR-4 etter behandling med PS2Aa1. Vi har også funnet ut at inhibering av PI3K /AKT vei i kombinasjon med toksinet øker, i en synergistisk måte, effektiviteten av PS2Aa1 å indusere apoptose i kreftceller. Dermed ser PS2Aa1 å være en celle-drapet diskriminerende toksin regulere apoptose i forskjellige humane kreftceller.
Materialer og metoder
bakteriestamme og kultur media
B
.
thuringiensis
serovar
Dakota
belastning 4R2 ble brukt i denne studien. Det ble innhentet fra
Bacillus
Genetic Stock Senter (Ohio State University, Columbus, OH, USA). Bakterieceller ble dyrket ved 30 ° C på næringsagar fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) ved pH 7,1.
Celler og dyrkningsbetingelser
human hepatocytt-kreftcellelinje HepG2 (HB-8065), humane prostatacancercellelinje PC-3 (CRL-1435), human epitelial kolorektal adenokarsinom-cellelinjen Caco-2 (HTB-37), human epitelial cervix adenokarsinom-cellelinje HeLa (CCL-2), human uterus endometrium adenokarsinom-cellelinje Hec-1A (HTB-112), human uterus endometrium adenokarsinom-cellelinje KLE (CRL-1622), human bryst adenocarcinoma cellelinje MDA-MB231 (HTB-26), human brystcancer-cellelinjen MCF-7 (HTB -22), humane ikke-tumorigene epitelceller MCF-10A (CRL-10317), human epitelial eggstokk adenokarsinom-cellelinje OVCAR-3 (HTB-161) og human epitelial eggstokk adenokarsinom-cellelinje SKOV-3 (HTB-77) ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC). Menneskelig udødelig ikke-tumorigent eggstokkreft overflaten epithelial cellelinje IOSE-144 ble vennlig levert av Dr. David Hunstman (British Columbia Cancer Research Center, Vancouver, BC, Canada). Menneskeudødelivmor stromale celler HIESC og menneskeudøde endometrial epitelceller HIEEC var en slags gave og produsert av Dr. Michel Fortier (Centre Hospitalier de l’Université Laval, Quebec City, QC, Canada) [14]. Menneske ovarialcancer celler A2780 ble vennlig levert av Dr. G. Peter Raaphorst (Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, ON, Canada). Menneskelig livmor adenokarsinom cellelinje Ishikawa ble vennlig levert av Dr. Samuel Chogran (Université de Montréal, Montreal, QC, Canada). HepG2, PC-3, HIEEC og HIESC cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og 50 pg /ml gentamycin. MCF-7 og OVCAR-3 cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 medium inneholdende 10% bovint vekst serum og 50 ug /ml gentamycin. MDA-MB-231-cellelinjen ble opprettholdt i RPMI 1640 medium inneholdende 5% bovint serum vekst og 50 ug /ml gentamycin. HEC-1A-cellelinjen ble opprettholdt i McCoys medium inneholdende 5% bovint serum vekst og 50 ug /ml gentamycin. SKOV-3-cellelinjen ble opprettholdt i McCoys medium inneholdende 10% bovint vekst serum og 50 ug /ml gentamycin. HeLa, Ishikawa og A2780 cellelinjer ble holdt i DMEM-F12-medium inneholdende 2% bovint vekst serum og 50 ug /ml gentamycin. MCF-10A-cellelinjen ble opprettholdt i DMEM-F12-medium inneholdende 5% fetalt serum vekst, 20 ng /ml EGF, 0,5 mg /ml hydrokortison, 100 ng /ml koleratoksin, 10 ug /ml insulin og 1X Penicillin-Streptomycin. KLE-cellelinjen ble opprettholdt i DMEM-F12-medium uten HEPES inneholdende 10% bovint vekst serum og 50 ug /ml gentamycin. Caco-2-cellelinjen ble opprettholdt i DMEM-F12-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og 50 pg /ml gentamycin. IOSE-144-cellelinjen ble opprettholdt i MCDB105-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og 50 pg /ml gentamycin. Alle celler ble holdt ved 37 ° C med 5% CO
2.
Total DNA
Totalt DNA fra
B
.
thuringiensis
4R2 ble isolert fra en 5 ml natten kultur hjelp QIAmp DNA blod mini kit (Qiagen, Toronto, ON, Canada), i henhold til produsentens instruksjoner for bakteriell DNA-ekstraksjon.
PCR forsterkning
primere som brukes i denne studien ble utformet i vårt laboratorium fra
gråte
46Aa1 genet nukleotidsekvens. Primere for PCR amplifisering var som følger:
Bt
4R2-2F: 5’TAACCGGAGGGCTTCAAG -3 «(fornuft) og
Bt
4R2-1R: 5’TAATTCCCCCATTTTGGG -3′ (anti ). PCR ble utført på et Applied Biosystems 2720 termosykler (Life Technologies, Ottawa, ON, Canada). PCR-reaksjonene ble utført i et volum inneholdende 200 uM 50ul hver av deoksynukleotidtrifosfater (dNTP), 1X PCR-buffer, 0,5μM av hver primere, 100 ng av DNA og 1,25 enheter av Taq DNA-polymerase. Alle PCR reagenser var fra New England Biolabs (Ottawa, ON, Canada). PCR ble utført ved en innledende denatureringstrinn ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 45 s, 50 ° C i 30 s, 72 ° C i 2 minutter og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min. PCR produktene var størrelse separert på en 1% agarosegel og visualisert ved hjelp SYBR-Safe (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) flekker på UV transillumination.
DNA-sekvense
amplikonene ble renset ved hjelp av Mini Eluer PCR Purification Kit fra Qiagen. De rensede PCR reaksjoner ble løst på en 3130XL Genetics Analyser (Applied Biosystems) på Ibis Plate-forme d’Analyser Génomiques (PAG) de l’Université Laval (Quebec City, QC, Canada). Begge tilnærmingene av DNA-sekvensen ble sekvensert: Den 940pb sekvensen ble sammenlignet med Blast-N verktøy (National Center for Biotechnology Information; www.ncbi.nim.nih.gov)
Utarbeidelse av aktiverte parasporale proteiner
belastning 4R2 ble dyrket> på nærings agarskåler, inkubert i 4 dager ved 30 ° C inntil cellelyse. Cellene ble høstet fra platene og vasket to ganger med sterilt destillert vann. Pelleten inneholdende sporer-krystall-proteiner ble oppløseliggjort i 500 ul av oppløsningsbuffer som inneholdt 56 mm Na
2CO
3 (pH-verdi: 11,4) og 11 mm ditiotreitol (DTT) i 1 time ved 37 ° C. Uoppløselig materiale ble pelletert ved sentrifugering ved 13 200 rpm i 2 minutter, og supernatanten ble ført gjennom en 0, 22μm membranfilter. 250 uJ av filtratet ble overført til et sterilt sentrifugerør 1,5mL og pH ble justert til 8 med 1M Tris-HCl (pH 4,98).
solubilisert proteiner ble spaltet med enten proteinase K (endelig konsentrasjon ved 185μg /ml) eller trypsin (sluttkonsentrasjon på 300μg /ml) i 1 time ved 37 ° C. Fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) ble tilsatt (sluttkonsentrasjon 1 mM) for å stoppe proteolytisk prosessering. For å bekrefte tilstedeværelsen av parasporale proteiner, ble utført SDS-PAGE-analyse som beskrevet andre steder [15] under anvendelse av 4% stabling gel og 12% separering av gelen. Etter elektroforese ble gelen farget med 0, 1% Coomassie-blått R-250 (Sigma-Aldrich). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canada).
Analyse av cytotoksisitet
Den antiproliferative aktivitet av
B
.
thuringiensis
4R2 toxin proteiner ble vurdert ved hjelp av MTT-analyse [16,17]. Kort, plater ble sådd med 180μL av normale celler og kreftceller i suspensjon (for HIESC, 14 000, IOSE-144, 12 000, HIEEC, 15 000, Ishikawa, 16 000, HeLa, 16 000, KLE, 14 000; Hec- 1A, 12 000, Caco-2, 20 000, PC-3, 16 000, HepG2, 20 000, A2780, 16 000, OVCAR-3, 20 000, Skov-3, 14 000, MCF-7, 16 000; MDA-MB231, 12 000 og MCF-10A, 8000) i medium ved hjelp av 96-brønner plater. Platene ble inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 24 timer. Fersk oppløst og aktivert
B
.
thuringiensis
4R2 toksin proteiner (med proteinase K eller trypsin) i oppløsnings buffer ble fortynnet i friskt medium, og 100 pl aliquoter inneholdende økende konsentrasjoner av toksinet proteiner (0μg /ml til 20 ug /ml) ble tilsatt, og platene ble inkubert i en annen 24 timer. Den endelige konsentrasjon av oppløsningsbuffer (56mm Na2CO3, 11 mm DTT, 100 ug /ml proteinase K (eller 30 mg /ml trypsin) og 1 mM PMSF) i kulturmediet var 8%, og ble holdt konstant i alle forsøk. Etter 24 h, 10 ul av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) (5 mg /ml i PBS) ble tilsatt til brønnene. Fire timer senere ble 100 ul av solubiliseringen-løsning (10% natriumdodecylsulfat (SDS) i 0,01 M HCl) tilsatt, og platene inkuberes over natten (37 ° C, 5% CO
2). Den optiske tetthet ble lest ved hjelp av en Fluostar optima BMG (BMG Labtech Inc., Durham, NC, USA) ved 565nm. Readings fra behandlede celler ble sammenlignet med målinger fra kontroll celleplater festet på behandlingen dagen; og andelen av hemming av cellevekst ble beregnet for hvert toksin protein (proteinase K aktivert eller trypsin aktivert). Forsøkene ble utført in triplo. Analysene ble betraktet som gyldig når variasjonskoeffisienten for et gitt sett av betingelser, og inne i samme eksperiment var 10%.
Lys mikroskopi observasjon
For observasjon av morfologiske endringer, normal (HIESC) og kreftceller (PC-3, MCF-7 og HepG2) ble observert etter 24 timer behandling med proteinase K aktivert toksin proteiner ved 1 ug /ml (MCF-7) eller 2 ug /ml (HIESC, PC-3 og HepG2). 10X og 20X forstørrelse ble brukt sammen med et Olympus (modell BX60) lysmikroskop (Carsen Group, Markham, ON, Canada).
Antistoffer og reagenser
Na
2CO
3, DTT, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid, HCl, SDS, PMSF, Tris-HCl og proteinase K ble alle oppnådd fra Sigma-Aldrich. Alle primære antistoffer ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Bervely, MA, USA) med unntak av β-aktin (Sigma-Aldrich). Sekundært antistoff, HRP-konjugert geite-anti-kanin ble kjøpt fra Bio-Rad Laboratories. Annexin V /PI apoptose kit ble kjøpt fra Invitrogen. MEK ½ inhibitor, U0126, ble hentet fra Cell Signaling Technology og PI3K inhibitor, Wortmannin, ble hentet fra Sigma-Aldrich.
Western blot
PS2Aa1 behandlede cellene ble vasket med PBS og sendt til lyse i kalde RIPA buffer som inneholder proteasehemmere (Complete fra Roche Applied Science, Laval, QC, Canada) og fosfatase inhibitor (PhosSTOP fra Roche Applied Science), etterfulgt av tre fryse-tine sykluser. Like mengder cellelysater, bestemt ved bruk av Bio-Rad DC-proteinanalyse, ble separert på polyakrylamidgeler (10-14%) og overført på nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). Membranene ble blokkert i 5% melk, PBS 1X, 0,06% Tween 20 i 1 time ved romtemperatur, ble probet med primært antistoff, vasket i PBS 1X, 0,06% Tween 20, og inkuberes med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Bio-Rad ). Deteksjon ble utført ved hjelp SuperSignal West Femto substrat (Thermo Fisher Scientific, Nepean, ON, Canada), som beskrevet av produsenten hjelp UVP Bioimaging systemer.
Måling av Annexin V /PI celler
FITC Annexin V /død celle apoptose Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble de behandlede celler oppsamlet, vasket med PBS og fortynnet i 1 x Annexin bindingsbuffer (100 ul). For hver prøve ble 5 ul av Annexin V og 2 ul av propidium jodid (PI) tilsatt til cellesuspensjonen og inkubert i 15 min ved romtemperatur. En ytterligere 100 ul volum av Annexin bindingsbuffer ble tilsatt til hver prøve for en total på 200 ul. Prøvene ble analysert (10 000 hendelser) ved hjelp av en Beckman Coulter strømningscytometer Cytomics FC500. Analysene ble utført ved hjelp av CXP Analysis programvare (Beckman Coulter, Mississauga, ON, Canada).
caspase 3-7 analysen
For å måle den spesifikke aktiviteten av caspase 3 og 7, en selvlysende assay kit heter caspase-Glo 3/7 analyse (Promega, Madison, WI, USA)) ble brukt. Denne analysen gir en proluminescent caspase-3/7-substrat inneholdende en sekvens (DEVD) spesifikke for kaspase 3 og 7. Hvis caspaser 3 og /eller 7 er aktive, blir substratet spaltes og aminoluciferin skal slippes ut. Kort, plater ble sådd med 180μL av normale celler og kreftceller i suspensjon (for HIESC, 14 000, PC-3, 16 000, HepG2, 20 000 og MCF-7, 16 000) i medium. Platene ble inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 24 timer. Fersk oppløst og aktivert
B
.
thuringiensis
4R2 toxin proteiner (med proteinase K) i oppløsnings buffer ble fortynnet i friskt medium. Deretter ble 100 ul aliquoter som inneholder toksinet, med eller uten inhibitorer, ble tilsatt og platene ble inkubert i ytterligere 24 timer. Den endelige konsentrasjon av oppløsningsbuffer (56mm Na2CO3, 11 mm DTT, 100 ug /ml proteinase K og 1 mM PMSF) i kulturmediet var 8%, og ble holdt konstant i alle forsøk. Etter 24 timer, ble 100 ul av Caspase-Glo 3/7 reagens tilsatt til brønnene. En time senere ble den optiske tetthet leses med en Fluostar optima BMG (BMG Labtech Inc., Durham, NC, USA). Avlesninger fra behandlede celler ble sammenlignet med målinger fra kontrollceller ved å bruke gangers økninger. . Hver eksperimentene ble utført i duplikat
Statistiske analyser
Dataene ble utsatt for enten enveis variansanalyse eller t-test (PRISM programvareversjon 5.00, GraphPad, San Diego, CA ). Forskjeller mellom forsøksgruppene, ved bruk av en enveis variansanalyse ble bestemt ved Tukey-test. Statistisk signifikans ble akseptert når p 0,05.
Resultater
Karakterisering av B. thuringiensis 4R2 cytotoksiske krystall protein
SDS-PAGE analyse av oppløste krystallproteiner viste et hovedbånd anslått til 37 kDa, tilsvarende den native formen av Cry46Aa1 protein (figur 1). I PCR-eksperimenter med Cry46Aa1 spesifikke primere, var et 940bp amplifikasjonsprodukt oppnådd. Analyser av nukleotidsekvensen ved hjelp av BLAST-verktøy avslørte at nukleotidsekvensen var 100% homologe med den proteinase K aktivert Cry46Aa1 nukleotidsekvens (NCBI aksesjonsnummer AB099515.1). På grunn av denne nukleotidsekvens identitet, de 37 kDa krystall proteiner fra
B
.
thuringiensis
4R2 ble kåret PS2Aa1
(A) Lane. 1: Molekylvekt markør; lane 2: oppløst pro-PS2Aa1. (B) nukleotider sekvens av
gråte
46Aa1 genet fragment oppnådd etter forsterkning med Bt4R2-2F og Bt4R2-1R primerpar.
Cytotoksisitet av PS2Aa1 i kreft og normale celler
Trypsin (brukt som kontrollbehandling) og proteinase K aktivert krystall proteiner fra
B
.
thuringiensis
4R2 (PS2Aa1) ble undersøkt for cytotoksisitet mot normale og kreft humane celler ved hjelp av MTT-analyse for en 24 timers behandling (Fig 2). Ingen cytocidale aktivitet ble observert etter trypsinbehandling av krystall solubiliserte proteiner for noen av de cellelinjer. Blant de cellene som ble testet, proteinase K aktivert krystallproteiner var svært cytotoksiske til HepG2, MCF-7, KLE, Hec-1A, MDA-MB231 og PC-3 celler samtidig er moderat cytotoksiske til Caco-2 celler. Ingen signifikant cytotoksisk aktivitet ble observert i A2780, OVCAR-3, SKOV-3 og HeLa-kreftcellelinjer. Ingen av de normale cellelinjer (IOSE-144, HIEEC, HIESC og MCF-10A) viste cytotoksiske effekter. Cytotoksisiteten av krystall proteinene var doseavhengig og ble undersøkt ved hjelp av serielle fortynninger proteiner. Basert på sin høye følsomhet for PS2Aa1, HepG2, ble PC-3 og MCF-7 kreftcellelinjer valgt for videre eksperimenter. HIESC celler ble anvendt som en normal cellelinje-modell for ytterligere å undersøke effekten av PS2Aa1 på ikke-cancerceller.
Normale dyrkede humane celler (A) og kreft dyrkede humane celler (B) (2 X 10
4 celler) ble preinkubert ved 37 ° C i 20 timer; toksinet behandlet med trypsin (○) eller proteinase K (●) ble tilsatt (sluttkonsentrasjoner, 0.3μg /ml til 20 ug /ml), videre inkubert i 24 timer. Celleproliferasjon ble analysert ved hjelp av MTT.
Morfologiske endringer i kreftceller indusert av PS2Aa1
For ytterligere å studere effekten av PS2Aa1, konsentrasjoner fra 1 ug /ml til 2 ug /ml ble brukt basert på den foregående celle-levedyktighet eksperiment. Følgende behandling av PS2Aa1 proteinase K aktiverte proteiner i HepG2 (2 ug /ml), PC-3 (2 ug /ml) og MCF-7 (1 ug /ml) celler, morfologiske egenskaper av de behandlede celler ble observert i henhold til lys-mikroskopi (Figur 3) . Celle krymping, karakteristisk for apoptotisk celledød [18], ble bare observert i HepG2, MCF-7 og PC-3 kreftceller. Imidlertid ble det ikke observert morfologiske endringer på HIESC; bekrefter den ikke-cytotoksisitet av PS2Aa1 på normale celler som tidligere er observert med MTT forsøk. Det ble ikke observert nekrose morfologiske endringer som celle hevelse eller blebbing [18].
PC-3 (A), MCF-7 (B), HepG2 (C) og HIESC (D) celler ble behandlet med 1 ug /ml eller 2 ug /ml
B
.
thuringiensis
4R2 toxin proteiner for 24 timer. Etter 24 timer ble cellene observert ved lysmikroskopi ved en forstørrelse på 10X og 20X. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter.
PS2Aa1 induserer celledød ved apoptotiske mekanismer
For å bekrefte våre tidligere observasjoner om de morfologiske endringer knyttet til apoptose skjer i kreftceller, vi utførte annexin V /propidiumjodid (PI) farging analyse på de behandlede celler. Annexin V har evnen til å sette flekker fosfatidylserin på den ytre paknings av plasmamembranen og dens tilstedeværelse på den ytre paknings i stedet for den indre paknings er en unik egenskap av apoptose [19]. Resultatene viste at 6 timer og 24 timer etter behandling, PS2Aa1 indusert høyt nivå av apoptose i alle tre kreftcellelinjer (figur 4A-4C), og meget lite i normal endometrial cancer cellelinje HIESC (figur 4D) Dette er i direkte korrelasjon med MTT resultatene assay (fig 2). De fleste kreftceller viste høy grad av apoptose etter 6 timer fra behandlingen som indikerer den høye effektiviteten av PS2Aa1 i å indusere apoptose.
PC-3 (A), MCF-7 (B), HepG2 (C) og HIESC (D ) celler ble behandlet med
B
.
thuringiensis
4R2 toxin proteiner (1 ug /ml (B) eller 2 ug /ml (A, C, D)) i 24 timer. Annexin V og PI-farging ble påvist ved FACS-analyse. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med tilsvarende mock-behandlede celler
Fordi PS2Aa1 induserer høy giftighet og masse celler er PI positive først etter 24 timer, bestemte vi oss for å utføre en caspase-3/7 analyse for å sjekke hvis PS2Aa1 spesifikt aktiverer caspases -3 og -7 å indusere apoptose (fig 5). Etter 24 timers behandling, øket PS2Aa1 betydelig aktiviteten av både caspaser -3 og -7 i PC-3 og HepG2-kreftcellelinjer (figur 5A og 5C). MCF-7 cancercellelinjen er caspase-3 mangelfull og med tanke på denne mangel, kan bare caspase-7 måles ved hjelp av denne analysen i denne cellelinjen [20]. En betydelig økning av kaspase-aktivitet kan observeres i MCF-7 kreftcellelinje som indikerer at apoptose indusert blir kompensert av caspase-7, implisert i virkningsmekanismen til PS2Aa1 (figur 5B). Lavt nivå av celledød ble tidligere observert i normal cellelinje HIESC av Annexin V /PI flowcytometri, og følgelig ingen signifikant økning av caspase-3/7-aktivitet kan bli målt ved hjelp av caspase-analysen i HIESC (figur 5D).
PC-3 (A), MCF-7 (B), HepG2 (C) og (D) HIESC celler ble behandlet med
B
.
thuringiensis
4R2 toxin proteiner (2 ug /ml) i 24 timer. Nivået av caspaser-3/7 ble målt ved anvendelse av Caspase-Glo 3/7 analysen. MCF-7 (B-celler) er Caspase-3 mangelfull og bare Caspase-7 kan måles. * P 0,05 og ** P. 0,01 sammenlignet med tilsvarende mock-behandlede celler
For ytterligere å undersøke apoptoseinduksjon, vi også målt forskjellige apoptose markører av western blot analyse som kløyvet caspase-3, 8, -9 og kløyvet PARP. Våre resultater viste at så tidlig som 6 timer fra behandlingen med PS2Aa1, ble caspase-3 spaltning /aktivering observert i både PC-3 og HepG2-kreftceller (figur 6A og 6C, MCF-7 er caspase-3-negativ). Når aktivert, kaspase-3 er en effektor caspase og kan gjøre proteolytisk spaltning med forskjellige proteiner, som for eksempel reparasjon proteinet PARP, så som fører til celledød ved apoptose. Imidlertid krever caspase-3-initiator caspaser fra enten den indre eller ytre vei til å bli spaltet /aktivert [21,22]. Ved western blot analyse, målte vi kløyvet caspase-8 (ytre vei) og kløyvet caspase-9 (indre vei), og fant ut at bare caspase-9 spalting /aktivisering var til stede i alle tre kreftcellelinjer (figur 6A-6C) mens caspase-8 spaltning /aktivering ble ikke observert (data ikke vist). I sammenheng med caspases cleavage, PS2Aa1 også indusert PARP spalting /nedbrytning i alle tre kreftcellelinjer (figur 6A-6C). Spaltes PARP og spaltes caspase-3-proteinnivået er lavt etter 24 behandling av toksinet i HepG2-kreftcellelinje (figur 6C). Dette er sannsynligvis fordi de fleste av cellene var døde etter 6 timer (mer enn 75%). Etter 24 timer med behandling, nesten alle HepG2 celler var flytende og død ( 92%). Proteiner var sannsynligvis alle degradert på grunn av proteaser aksjon i slutten av apoptose fører til massive protein og cellulær destruksjon [23]. Det er videre støttet av MTT-data (figur 2B) og Annexin V /PI strømningscytometri (figur 4C og 4 H) som indikerer at nesten 100% av cellene er døde ved denne konsentrasjon etter 24 timers behandling forklarer situasjonen observert. Det er også bemerkelsesverdig at ingen av disse markørene av apoptose ble observert i normal cellelinje HIESC (Fig 6D) indikerer at ingen apoptose ble fore bruker maksimal dose av PS2Aa1 (2 pg /ml) tidligere brukt på kreftcellelinjer. Western blot bånd som er synlige i normal cellelinjen HIESC er basalnivået av de forskjellige markørene, observeres kun etter høy utstilling for å avsløre de passende proteinbåndene (figur 6D). Dette er i overensstemmelse med fravær av apoptose og caspaser-3/7-aktivitet observert i tidligere eksperimenter for den normale cellelinje HIESC (figurene 4 og 5).
PC-3 (A), MCF-7 ( B), ble HepG2 (C) og (D) HIESC celler behandlet med
B
.
thuringiensis
4R2 toxin proteiner (1-2μg /ml) for 6 timer og 24 timer. Nivåene av apoptose-spesifikke proteiner spaltes caspase-3, caspase-9 og PARP ble bestemt i behandlede celler ved hjelp av western blot-analyse. MCF-7 (B-celler) er Caspase-3 mangelfull. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Regulering av ulike overlevelses og dødsveier i respons til PS2Aa1
Alle tidligere forsøk viser at PS2Aa1 toksinet kan indusere celledød i kreftceller ved apoptose-induksjon. For å undersøke mulige involvering av andre overlevelse /dødsveier, utførte vi flere eksperimenter på PC3 prostatakreftceller ved hjelp av western blot analyse. Vi først undersøkte AKT overlevelse pathway kjent for å være en viktig overlevelsesmekanisme for kreftceller. Proteiner fra AKT-reaksjonsveien er ofte endres i kreft og den høye overlevelses signal fra disse mutasjonene er ofte ansvarlig for motstanden av kreftceller til å Therapeutics behandlinger, og det blir umulig å indusere apoptose [24-28]. Våre resultater viste en høy reduksjon av fosforylert (den aktive formen) AKT ved serin 473. Total AKT-nivået ble også minsket noe som tyder på at det også er delvis ansvarlig for reduksjon av p-AKT nivå. XIAP, en inhibitor av kaspase og en ubiquitin ligase for PTEN (en negativ regulator av AKT-fosforylering) ble også redusert (figur 7A) [29]. ERK1 /2, proteiner av MAPK-reaksjonsveien, krever aktivering /fosforylering for å indusere apoptose i kreftceller etter behandling med cisplatin eller andre stimuli apoptose [30-32]. Som observert i cisplatin behandlinger, PS2Aa1 induserte en økning på ERK1 /2 fosforylering i 24 timer etter behandling, mens total ERK nivå overnattet stabil (figur 7B). Dette tyder på at ERK-aktivering er nødvendig for induksjon av apoptose. Til slutt har vi nylig oppdaget en ny mekanisme knyttet til tumor suppressor PAR-4 som spaltes av caspase-3 ved apoptose stimuli og er i stand til å indusere apoptose når spaltet [33,34]. På grunn av PS2Aa1 kapasitet til å aktivere apoptose mekanismer, spurte vi hvorvidt PAR-4 spalting kan være involvert i apoptose-induksjon ved behandling med toksinet. Interessant, en spaltet fragment på tilnærmet 25 kDa først så snart 6 timer etter behandling med PS2Aa1 i fullt samsvar med vår hypotese (figur 7C). Tilstedeværelsen av det spaltede PAR-4-fragment, vanligvis til stede bare i kreftceller som gjennomgår apoptose, forsterker ideen om at PS2Aa1 induserer apoptose i kreftceller.
PC-3-kreftceller ble behandlet med Bt 4R2 toksin proteiner (2 ug /ml) i 6 timer og 24 timer.
