Abstract
Ataxia-telangiectasia mutated (ATM) er en Ser /Thr-protein kinase som spiller en kritisk rolle i DNA-skade-indusert signalering og initiering av cellesyklus kontrollpunkt signalering i respons til DNA-skadende midler slike som ioniserende stråling. Vi har tidligere rapportert ATM proteintap ved immunhistokjemi (IHC) i 16% av menneskelig magekreft (GC) vev. Vi antok at
ATM
genet intron mutasjoner målrettet av mikro ustabilitet (MSI) føre ATM protein tap i en undergruppe av GC. Vi studerte mononukleotid mutasjoner i intron av
ATM
genet, ATM IHC og MSI i GC. Ti menneskelige mage kreft cellelinjer ble undersøkt for
ATM
genmutasjon på introner, RT-PCR, direkte sekvensering, og immunhistokjemi. GC vev av 839 pasienter ble analysert for MSI og ATM IHC. Blant dem var 604 tilfeller analysert for
ATM
mutasjoner i introner foregå exon 6, ekson 10 og ekson 20. To menneske GC cellelinjer (SNU-1 og -638) viste
ATM
intron mutasjoner, sletting i RT-PCR og direkte sekvensering, og ATM protein tap av IHC. Frekvensen av
ATM
mutasjon, MSI, og ATM protein tap var 12,9% (78/604), 9,2% (81/882) og 15,2% (134/839), henholdsvis. Analyse av assosiasjoner mellom MSI, ATM genmutasjon, og ATM proteintap avslørte høyt co-eksisterende
ATM
genet endringer og MSI.
ATM
intron mutasjon og ATM protein tap ble påvist i 69,3% (52/75) og 53,3% (40/75) av MSI positiv GC. MSI positivitet og ATM proteintap var til stede i 68,4% (52/76) og 48,7% (37/76) av GC med ATM intron mutasjon.
ATM
mutasjon og ATM proteintap hadde karakteristikker av alderdom, distal plassering av svulst, stor svulst størrelse, og histologisk intestinal type. Vår studie kan tolkes som at
ATM
genmutasjon på intron kan bli målrettet av MSI og føre til ATM protein tap i en utvalgt gruppe av GC.
Citation: Kim HS, Choi SI, Min HL, Kim MA, Kim WH (2013) Mutasjon på Intronic gjentakelser av Ataxia-Telangiectasia mutert (ATM) Gene og ATM proteintap i Primær Gastric Cancer med mikro Ustabilitet . PLoS ONE 8 (12): e82769. doi: 10,1371 /journal.pone.0082769
Redaktør: Hoguen Kim, Yonsei University School of Medicine, Republikken Korea
mottatt: 21 juli 2013; Godkjent: 27 oktober 2013; Publisert: 06.12.2013
Copyright: © 2013 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT Future Planning (NRF-2012R1A1A2004648). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ataxia-telangiectasia mutated (ATM) genet er en komponent av DNA-skade respons (DDR) og aktiveres av DNA-dobbeltstrengbrudd (DSB), og signaliserer cellesyklus kontrollpunkt for å forsinke passeringen av cellene gjennom syklusen til rette for DNA-reparasjon. Genet er lokalisert til kromosom 11q22-23.
ATM
genet er svært store, som spenner over en genomisk region på 150 kb, som består av 66 eksoner med en kodende sekvens av 91 668 bp.
ATM er innblandet i respons til DSB sin som oppstår fysiologisk i spesialiserte celletyper som for eksempel kjønnsceller og lymfocytter. Minibanken protein hjelper cellene i erkjenner skadet eller ødelagt DNA-trådene. Minibanken protein koordinerer DNA-reparasjon ved å aktivere enzymer som reparerer ødelagte tråder. Effektiv reparasjon av skadet DNA-trådene bidrar til å opprettholde stabiliteten av cellens genetiske informasjonen [1].
ATM tap ble observert hos 16% av menneskelig GC vev i en stor kohortstudie [2]. Inaktivering av
ATM
genet kan være en hyppig hendelse i utviklingen av menneskets magekreft (GC); Men hendelsene knyttet til tap av
ATM
uttrykk i GC kunne ikke forklares med den lave forekomsten av
ATM
mutasjon. De fleste av de
ATM
mutasjoner identifisert i primær GC cellelinjer og GC vev var punktmutasjoner [3].
DNA mismatch reparasjon (MMR) system korrigerer feilene som kan oppstå under DNA-replikasjon, mens homolog rekombinasjon og ikke-homolog ende bli involvert i reparasjon av DNA DSB. Mutasjoner i DNA DSB reparasjonsgener som
ATM, MRE11, RAD50, NBS1 Hotell og
ATR
, er antatt å spille en rolle i utviklingen av gastrointestinale maligniteter med nedsatt MMR-funksjon. I tykktarmssvulster med en svekket MMR system, mutasjoner av intronic mononukleotid repetisjoner i
ATM Hotell og
MRE11
ble funnet å resultere i avvikende skjøting, etterfulgt av redusert uttrykk av villtype protein [4 ].
Ca. 10% av GC er forbundet med mikrosatelitt ustabile (MSI). MSI refererer til endringer i antall nukleotid-repetisjoner i mikro områder som befinner seg innenfor de kodende regioner av gener, og resulterer i rammeskiftmutasjoner. MSI har blitt identifisert i proteinkodende regioner av kjente målgener inkludert
TGF-βRII, IGFIIR, BAX product: [5-7], og
hRAD50
gener [8].
hRAD50, BLM
, og
BRACA1
gener har poly (A) mononukleotid gjentar innenfor de kodende regionene,
hMSH6
har (C) 8 kanalen,
NBS1
har (A) 7 kanalen, og
ATM
har (T) 7 kanalen. Rammeskifte mutasjoner av disse genene med variabel forekomst ble rapportert tidligere [9-11].
I tillegg til de mange mutasjoner akkumulert i nøytrale mikrosekvenser, MSI genererer også mutasjoner i kreftgener, dvs. i de gener som spiller en aktiv rolle i den flertrinnsprosess kreftutvikling. Selv gjentatte sekvenser i den kodende region av gener som er kortere enn den typiske mikro loci anvendt for genkartlegging, er deres tilbøyelighet til å gjennomgå spontane glidning feil i løpet av replikasjonen er fremdeles høyere enn for nonrepetitive sekvenser. Mutasjoner av en intronic gjenta ble rapportert å indusere nedsatt uttrykk for
MRE11
gen [12,13]. Polypyrimidine gjenta mutasjoner i
ATM
genet kan forstyrre riktig mRNA spleising [14]. Men det er ingen bevis for at innsetting /sletting skjer på disse ikke-kodende mononukleotid sekvenser påvirke normal ATM protein funksjon i MSI-relaterte GC. I menneskelig GC vev med MSI, hyppigheten av
ATM
mutasjon og foreningen med tap av protein funksjon er ikke forstått tydelig. Vi har antatt at mononukleotid veis endringer i intron
ATM
-genet er forbundet med tap av ATM-proteinet funksjon i GC med MSI.
Vi undersøkte mutasjoner på intronic (T) 15 i
ATM
gen intervenerende sekvens (IVS) foregående ekson 6, noe som fører til 22 bp sletting av exon 6 i humane mage kreft cellelinjer . I denne studien ble mutasjoner av
ATM
genet sammen med tilstedeværelse av MSI undersøkt i humane GC cellelinjer og primære GC vev. Våre resultater viste at
ATM
gen intron mutasjon var hyppig i GC med MSI og var signifikant assosiert med tap av ATM protein funksjon.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne retrospektive studien ble utført ved hjelp av prøvene over hyllene etter patologisk diagnose, og alle prøvene ble anonymisert før studien. Denne retrospektive studien ble godkjent av Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (H-1010-065-336) med fraskrivelse av informert samtykke under forutsetning av anonymiserings.
Cellelinjer og vevsprøver
Ten human magekreft celle linjer-SNU-en, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU- 620, SNU-638, SNU-668 og SNU-719 ble oppnådd fra den koreanske cellelinje Bank (Seoul, Korea). Alle cellelinjer ble dyrket i RPMI1640 supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone, Lorgan, UT, USA) og antibiotika (100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator. En cellelinje vev rekke lysbilde laget av høstet og faste menneskelig GC cellelinjer ble oppnådd for immunhistokjemi (Superbiochips, Korea).
formalinfiksert, parafininnstøpte GC vevsprøver fra 839 pasienter som gjennomgikk kurativ gastrektomi for primære magekreft behandling mellom en
st januar 2004 og 31
st desember 2005 ved Seoul National University Hospital ble samlet. Pasientene inkludert 577 menn og 262 kvinner med en gjennomsnittsalder på 57,6 år (spredning: 4 til 87 år). Informasjon om svulst stedet ble innhentet fra 835 tilfeller: øvre tredjedel i 109, midt på tredjeplass i 323, nedre tredjedel i 383, og hele magen i 20 tilfeller. Basert på Lauren klassifisering, kreft ble histologisk klassifisert som intestinal type i 381, diffus type i 327, blandet i 123, og ubestemt i 8 tilfeller. Ut av de 839 tilfellene, 165 var tidlig GC og 674 ble avansert GC. Lymfeknutemetastaser var til stede i 531 tilfeller og fraværende i 308 tilfeller. To hundre og førti fem pasienter ble diagnostisert som stadium I, 254 som stadium II, 291 som fase III, og 85 som stadium IV. Adjuvant kjemoterapi etter operasjonen ble utført på 533 pasienter, som omfatter 32 pasienter i fase I, 153 i Stage II, 260 i trinn III, og 82 i Stage IV. Gjennomsnittlig oppfølgingstid var 49,3 måneder (spredning: 0-85 måneder). Lokalt tilbakefall ble bemerket i 185 (21,0%), fjern metastase i 85 (9,6%), og død ved en hvilken som helst årsak i 289 av 882 pasienter (32,8%). Pasientoverlevelsesdata, inkludert datoer og dødsårsaker, ble hentet fra Korean Central Kreftregisteret, Helse- og velferdsdirektoratet, Korea. Standard histopatologisk undersøkelse inkludert vurdering av krefttype og patologisk tumorstadium, i henhold til kriterier fastsatt av syvende utgaven av AJCC Staging Manual [15].
DNA-ekstraksjon og MSI besluttsomhet
svulstvev prøver på objektglass ble undersøkt under et lysmikroskop. Et område av tumoren, hvor prosentandelen av tumorceller som overskredet et minimum 50% av alle cellene i dette området, og et sammenkoblet område av normalt mucosal vev som ikke inneholder noen tumorceller ble merket og skrapet med et knivblad. Det skrapte vev ble oppsamlet i 1,5 ml mikrorør inneholdt 50 ul av vev lyseringsbuffer (0,5% Tween 20 [Sigma, St. Louis, MO], 100 mM Tris-HCl buffer [pH 7,6], 1 mM EDTA, og 20 pg proteinase K [ ,,,0],Sigma]). Rørene ble inkubert i 24 til 48 timer ved 55 ° C inntil vevet holdige lyseringsbuffer ble klart. Proteinase K ble inaktivert ved inkubering ved 95 ° C i 10 minutter, og det ekstraherte DNA ble lagret ved -20 ° C inntil bruk. MSI ble vurdert på loci BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, og D17S250. Svulster ble klassifisert som MSI + når minst to (40%) av de 5 mikro markørene ble knyttet til alleler av endrede størrelse i tumor-DNA sammenlignet med DNA fra ikke-tumorvev.
Påvisning av mutasjoner av
ATM
på intron mononukleotid gjentar
PCR forsterkning ble utført i 10 mL volum som inneholder 1 mL genomisk DNA, 5 pmol hver av forover og bakover primere, og 5 mL Premix. Trettitre sykluser med PCR ble utført med syklusparameteren av 95 ° C i 30 sek, 30 sek ved en glødetemperatur som passer for hvert primerpar og 65 ° C i 1 minutt, etterfulgt av 10 min forlengelse ved 72 ° C.
Variasjon av mononukleotid gjenta i
ATM
genet ble oppdaget ved hjelp av en PCR-basert analyse. Genomisk DNA ble amplifisert med primers- F-CCTTTTTCTGTATGGGATTATGG, R-TGAACATCTTGTGAAGGTTTCAG for exon6 (T) 15 (155 bp), F-TCCTTTTAGTTTGTTAATGTGATGGA, R-GCTGTTGGGGTAGAAGCTGA for exon10 (T) 15 (165 bp), og F-GCCAATGGAAGATGTTCTTGA, R- CATCTTGGTCACGACGATACA for exon20 (T) 15 (178 bp).
Påvisning av avvikende spleising i
ATM
Total RNA (2,5 mikrogram) fra menneskelige mage kreft cellelinjer som er utarbeidet av TRIzol reagens (GIBCO-BRL) ble anvendt for første tråd cDNA-syntese med Superscript II revers transkriptase (GIBCO-BRL) og oligo-d (T)
12-18 primer. En aliquot av reaksjonsblandingen ble amplifisert ved PCR for å syntetisere forskjellige segmenter av ATM-cDNA.
PCR-amplifikasjon ble utført i 20 ul volum inneholdende 1 pl revers-transkribert cDNA, 5 pmol hver av forover og revers primere, og 10 mL Premix. Trettifem sykluser med PCR ble utført med syklusparameteren av 95 ° C i 30 sek, 30 sek ved en glødetemperatur som passer for hvert primerpar og 72 ° C i 1 minutt, etterfulgt av 10 min forlengelse ved 72 ° C. PCR-produktene ble elektroforesebehandlet i 2% agarosegel inneholdende etidiumbromid, og visualisert under UV-lys. β-aktin ble benyttet som intern standard.
Tre RT-PCR-primerpar som stammer fra
ATM
sekvenser (GenBank NM_000051) som ble brukt var F-TGGTGCTATTTACGGAGCTG og R-TTCGAAAGTTGACAGCCAAA å detektere transkripsjoner av exon 5-7 (produkt størrelse: 347 bp), F-TCCCTTGCAAAAGGAAGAAA og R-TACTGGTGGTCAGTGCCAAA for ekson 9-11 (produkt størrelse: 504 bp), og F-TGGAGAAGAGTACCCCTTGC og R-GATTGACTCTGCAGCCAACA for ekson 19-22 (produkt størrelse: 415 bp ).
Sekvensanalyse
Sekvensering ble utført av dideoxy-kjedeterminering metoden ved hjelp av DNA-sekvensering kit (Applied Biosystems) og ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Forsterkede PCR produktene ble renset enzymatisk ved hjelp av en presequencing kit (Amersham Life Science, Cleveland, Ohio, USA), i henhold til produsentens instruksjoner, og deretter direkte sekvensert ved hjelp BigDye terminator-metoden (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvenseringsreaksjoner ble kjørt på en ABI 3100 automatisert sequencer (Applied Biosystems, Biosystems, Foster City, CA, USA) og data innhentet ble analysert ved hjelp av DNA-sekvensering analyse 3.7 programvare (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De nye dataene har blitt deponert i GenBank (sjonsnummer: KF704396)
Immunohistochemistry
Representative tumor-blokkseksjoner og celle-line array deler av 4-mikrometer tykkelse ble deparaffinized og rehydrert i gradert. alkohol. Antigen gjenfinning ble oppnådd ved press -cooking prøvene i 0,01 mol /l citratbuffer i 5 min. Kaninen monoklonalt antistoff (klon Y170 erholdt fra Epitomics, Burlingame, CA, USA) ble anvendt for immunhistokjemi. ATM var farget i kjernen av normal gastrisk mucosa, stromale celler og lymfocytter. Intensitet ble gradert som 0 (helt negativ), ± (tvetydig farging, observert signal kun ved høy effekt mikroskopi med × 40 okular), + /3 (svak positiv), ++ /3 (moderat positiv) og +++ /3 (sterkt positiv, nesten lik lymfocytter og nøytrofiler). Kriteriene for negative tilfeller ble definert som mindre enn 10% av celler farget som svakt positiv (+ /3) eller høyere intensitet, det vil si mer enn 90% av cellene viser fullstendig negativ (0) eller tvetydige farging (±) [2- ].
Statistisk analyse
SPSS 15.0 pakken ble brukt for statistiske analyser. Chi-kvadrat test og Cox modellen ble brukt. Alle p-verdier er tosidige og P-verdier. 0,05 ble ansett som viktig for de statistiske metodene i denne studien
Resultater
Mutasjon på intronic mononukleotid gjentakelser av ATM-genet i menneskets mage kreft cellelinjer
Blant 10 menneskelige mage kreft cellelinjer, SNU-en og SNU-638 ble karakterisert som MSI positiv,
ATM
genmutasjoner positiv og ATM tap av IHC. I SNU-1 og SNU-638, ble 22 basepar delesjon av exon 6 påvist ved RT-PCR og det ble bekreftet i etterfølgende sekvensanalyse (figur 1). SNU-5, SNU-16, SNU-484, SNU-601, SNU-620, SNU-668, og SNU-719 var MSI negative og hadde vill type
ATM
genet. Selv om SNU-216 var MSI negativ, det næret mutasjoner i
ATM
genet, og hadde sterk ATM uttrykk oppdaget av IHC (tabell 1).
(A) BAT26 (blå) og BAT25 (grønn) viste stabilt mønster i SNU-5 (øvre) og ustabil mønster i SNU-en (nedre). (B) ATM-genet PCR produktene inintervening sekvens (IVS6) (oransje), IVS10 (blå), IVS20 (grønn) viste normal lengde i SNU-5 (øverst) og forkorting i SNU-en (lavere). (C) RT-PCR av
ATM
exon 6, ekson 10, og ekson 20 i mage kreft cellelinjer. SNU-1 og 638 viste 22-bp sletting ved ekson 6. (D) Direkte sekvensering av IVS 6. SNU-5 har normal sekvens og SNU-1 har 22 sletting på understrekede sekvenser. (E) Immunohistochemistry av ATM protein i magekreft cellelinjer. Negativ i SNU-1, tvetydig i SNU-638, mild positiv i SNU-16 og sterk positiv i SNU-5. (F) Skjematisk fremstilling av en 22-bp sletting av ekson 6 av
ATM plakater (882del22).
MSI
ATM
genmutasjon av intronic mononukleotid gjentar
ATM
sekvense
ATM
RT-PCR
ATM IHC
Bat 26
Bat 25
IVS 6
IVS 10
IVS 20
Exon 6
exon 10
exon 20
exon 6
exon 10
exon 20
SNU-en +++++ 22-bp delnono22-bp delnonoNegativeSNU-5 —– nonononononoPositiveSNU-16 —– ndndndnononoPositiveSNU-216 – +++ nononono nonoPositiveSNU-484—–ndndndnononoPositiveSNU-601—–ndndndnononoPositiveSNU-620—–ndndndnononoPositiveSNU-638+++++22-bp delnono22-bp del nonoNegativeSNU-668 —– ndndndnononoPositiveSNU-719 —– ndndndnononoPositiveTable 1. mikro ustabilitet status og
ATM
genet profiler av menneskelige mage kreft cellelinjer.
IVS, intervenerende sekvens ; IHC, immunhistokjemi. CSV Last ned CSV
Mutasjon på intron mononukleotid gjentakelser av
ATM
genet og mikro ustabilitet i magekreft vev
Hyppigheten av intronic mutasjon i
ATM
genet ble bestemt som 12,9% (78/604). Frekvensen av
ATM
genmutasjon var 9,3% (50/540) i intron foregående IVS 6; 11,0% (59/534) i intron foregående IVS 10 og 8,8% (46/523) i intron foregående IVS 20; Blant dem, IVS 6 og IVS 10 overlappet i 39, 10 og IVS IVS 20 i 35, 10 og IVS IVS 20 i 34, IVS 6, IVS 10 og IVS 20 i 31 tilfeller (tabell 2). Frekvensen av MSI positivitet var 9,2% (81/882) og ATM protein tap var 15,2% (134/839) i vår studie av GC. I 596 tilfeller ble assosiasjoner mellom MSI (figur 2A), ATM genmutasjon (figur 2B), og ATM protein tap (figur 3) analysert.
ATM
intron mutasjon og ATM protein tap ble påvist i 69,3% (52/75) og 53,3% (40/75) av MSI positiv GC. MSI positivitet og ATM proteintap var til stede i 68,4% (52/76) og 48,7% (37/76) av GC med ATM intron mutasjon. MSI positivitet og ATM intron mutasjon ble påvist i 35,7% (40/112) og 33,0% (37/112) av GC med ATM protein tap (tabell 3). Hyppigheten av ATM IHC Resultatene viste en signifikant høyere ATM tap i en undergruppe av MSI positive og
ATM
mutasjon positiv GC (figur 4A). Tretti tre av 596 tilfeller (5,5%) har de alle tre molekylære funksjoner (figur 4B).
Beliggenhet
Gjentar (villtype)
Intron mutasjon i GC
Intron mutasjon i MSI positiv GC
Intron mutasjon i ATM IHC negativ GC
ATM
IVS 6 (T)
1550/540 (9,3%) 42/50 (84,0%) 29/111 (26,1%)
ATM
IVS 10 (T)
1559/534 (11,0%) 47/59 (78,7%) 29/111 (26,1%)
ATM
IVS 20 (T)
1546 /523 (8,8%) 34/46 (73,9%) 22/107 (20,6%)
ATM
IVS 6 eller IVS 10 eller IVS 20 (T)
1578/604 (12,9%) 53/76 (69,7%) 37/112 (33,0%) Tabell 2. Incidencies av
ATM
gen intron mutasjon i mage kreft (GC)
IVS, intervenerende sekvens.; MSI, mikro ustabilitet; IHC, immunhistokjemi. CSV Last ned CSV
Nedre kjørefelt viste ustabilitet i BAT26 (blå) og BAT25 (grønn). (B) nedre felts viste mutasjon ved intervenerende sekvens 6 (IVS6) (blå).
(A) Negativ. (B) Tvil (+/-). (C) Svak positiv (1 + ~ 2 +). (D) Sterk positive (3+).
ATM IHC
MSI
ATM
mutasjon
N
Negativ
Positiv
NegativeNegative49768 (13,7%) 429 (86,3%) Positive244 (16,7%) 20 (83,3%) Subtotal52172 (13,8%) 449 (86,2%) PositiveNegative237 (30,4%) 16 (69,6%) Positive5233 (63,5%) 19 (36,5%) Subtotal7540 (53,3%) 35 (46,7%) Negative52075 (14,4%) 445 (85,6%) Positive7637 (48,7%) 39 (51,3%) Total596112 (18,8%) 484 (81,2%) Tabell 3. Frekvens av ATM protein uttrykk i undergrupper i henhold til mikro ustabilitet (MSI) status og
ATM
intron mutasjon.
CSV ned CSV
(A) Frekvenser av ATM proteintap ved immunhistokjemi i mage kreft undergrupper av MSI status og
ATM
intron mutasjon. (B) Venn-diagram som viser antall magekrefttilfeller med overlappende molekylære egenskaper blant høyt nivå mikro ustabilitet (MSI-H),
ATM
intron mutasjon, og ATM proteintap.
Clinicopathologic korrelasjoner av
ATM
genmutasjon i GC
GC pasienter med
ATM
genmutasjon ble forbundet med alderdom, stor svulst størrelse, distal plassering, intestinal type, dypere invasjon, og lavere tilbakefall. GC pasienter med negativ ATM IHC var forbundet med alderdom, stor svulst størrelse, godt til moderat differensiert type, og intestinal type Lauren klassifiseringssystem (tabell S1). Chi-kvadrat test
ATM
genmutasjon status i ATM IHC negative og positive grupper med clinicopathologic variabler ble utført. I ATM IHC negative gruppe,
ATM
mutasjon positiv GC var forbundet med alderdom (P = 0.032) og distal plassering (P = 0,045). I ATM IHC positiv gruppe,
ATM
genmutasjon ble assosiert med godt eller moderat differensiert type GC (P = 0,022) (tabell S1).
Survival analyse
den Cox modellen ble brukt i både univariate og multivariate tester. Univariat Cox regresjonsanalyse for total overlevelse og sykdomsfri overlevelse viste signifikant prediktiv verdi av noen etablerte prognostiske faktorer som lymfeknutemetastase, dybde av svulst, og Lauren klassifisering av histologisk type. Pasientgruppen som fikk adjuvant chemotherpy hadde en signifikant høy relativ risiko for overordnet (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) (P 0,001, relativ risiko = 3,82 [95,0% CI, 2,81 til 5,18] for OS og P 0.001, relativ risiko = 5,63 [95,0% CI, 3,69 til 8,58] for DFS). Imidlertid ble ingen signifikante trender av relativ risiko (RR) observert for
ATM
intron mutasjon, MSI, eller ATM IHC tap. Multivariat analyse med variabler av dybden av tumor, lymfeknute status, Lauren klassifisering av histologisk type adjuvant kjemoterapi,
ATM
intron mutasjon, og ATM protein uttrykk ble utført. ATM intron mutasjon har en lavere relativ risiko med en borderline betydning for total overlevelse (P = 0,05, relativ risiko = 0,60, [95,0% KI 0,36 til 1,00]) (tabell 4).
Total overlevelse
Sykdomsfri overlevelse
Relativ risiko
95,0% KI
P-verdi
N
Relativ risiko
95.0% KI
P-verdi
N
Avansert Gastric Cancer8.263.00-22.750.005965.051.81-14.130.00544Lymph node positive6.663.47-12.770.005963.201.58-6.480.00544Diffuse typen histology1.431.06 -1.940.025961.611.09-2.360.02544Adjuvant chemotherapy0.990.57-1.730.985962.171.00-4.720.05544
ATM
intron mutation0.600.36-1.000.055960.560.29-1.080.08544ATM protein loss1.190.82-1.730 .355961.100.67-1.810.70544Table 4. multivariat Cox regresjonsanalyse.
CSV ned CSV
Diskusjoner
Våre resultater viste at mutasjoner i et intron gjenta i
ATM
genet resultere i avvikende spleising, noe som fører til 22 bp delesjon og proteinekspresjon ATM tap i GC-cellelinjer. Disse resultatene er i samsvar med den forrige rapporten [13] om identifisering av en spleising feil i
MRE11
forløper transkripsjon knyttet til mutasjoner av en poly (T) 11 repeat innen intervenerende sekvens 4 (IVS-4), utelukkende i MMR-mangelfull kreft cellelinjer og primære svulster. Våre resultater viser at ATM protein tap i GC betydelig korrelert med tilstedeværelse av intronic genmutasjon i
ATM
.
I Ataxia-telangiectasia pasienter, 70% -90% av
ATM
mutasjoner er tull, frame shift, eller spleising mutasjoner som avkorte proteinet [16]. Ifølge COSMIC databaser (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), mutasjoner ved koding regioner av
ATM
genet ble påvist hos 5% (433 av 9249) av ulike kreftformer. Blant dem magekreft viste mutasjon bare i 1,35% (1 av 74). Selv
ATM
genmutasjon i GC var rapportert tidligere [3,9], omfattende forklaring var begrenset av den lave hyppigheten av mutasjoner og forholdsvis høy forekomst av funksjonelle tap av ATM [2]. I vår studie, ca 70% av MSI positiv GC viste signifikant
ATM
genet intronic mutasjon assosiert med ATM protein tap. Våre resultater støtter sterkt at intronic mutasjon av
ATM
med underliggende MSI er en av de viktigste mekanismene for ATM tap i menneskelig GC. ATM tap skyldes avvikende spleising forbundet med intronic forkorting i MSI positive tykktarmskreftcellelinjer. Ejima et al. søkte
ATM
genmutasjoner ved hjelp av 62 par av oligonukleotidprimere, som tilsvarer regionen som strekker seg fra ekson 4 til exon 65 av
ATM
og dets flankerende introner. Avkorting av mononukleotid områder med
ATM
introner utgjorde 34 (87%) av 39 intronic endringer. Tretti-en av dem ble funnet i de 5 colon-tumorcellelinjer som har MSI (LS180, HCT15, HCT116, SW48, og LoVo). De viste også lav uttrykk for ATM protein i MSI positive kolorektal kreft cellelinjer [14]. Minibanken uttrykket er betydelig redusert i mange brystcarsinomer og fant ingen
ATM
mutasjon i at cellelinje [17]. Dette indikerer forskjellige funksjoner i
ATM
gen forandringer mellom gastrointestinale og brystkreft.
I tillegg til mutasjoner, kan tumorsuppressorgener inaktiveres ved metylering av cytosin ester i CpG-øyene som er plassert i formidler av mange gener.
ATM
genet er en roman mål for epigenetisk lyddemping gjennom upassende metylering av sin proksimale promoter regionen korrelerer med økt Radiosensitivity og lavt protein uttrykk i en human kolorektal tumor cellelinje [18] og menneskelig glioma cellelinje [18]. uten
ATM
genmutasjoner.
MSI målretting av
ATM
gen representerer en kobling mellom MSI og DNA reparasjon i GC. Flere studier indikerer at funksjonelle tap av ATM økes i MSI og human
ATM
genet er et viktig mål for inaktivering i MSI positiv GC-cellelinjer og vev [19,20]. Årsaken til påfallende høy forekomst av
ATM
gen intron mutasjon i MSI positiv GC kan være på grunn av de mononukleotid gjentas (T) 15, og en lengde på 13 nukleotider eller mer var særlig utsatt for denne målrettede forkorte [14 ]. Hyppigheten av
ATM
gen rammeskift-mutasjon (T) 7 i exon 6-kodende sekvens i MSI positiv GC ble rapportert å være bare 6% (2/36) [8], noe som er mye lavere enn vår observasjon.
Det er rapportert at ATM-mangel sensitizes celler til vekst-inhiberende effekter av PARP-inhibitor, olaparib, i magekreftceller med redusert
ATM
uttrykk [21]. Poly (ADP-ribose) polymerase-inhibitorer er for tiden evaluert i kliniske forsøk mot en rekke kreftformer, inkludert i colon-karsinom [22]. I GC, er ATM-mangel kjent som en prediktor for respons på PARP-inhibitor [23-25]. En markør for homolog rekombinasjon, Rad 51, er kjent for å være prediktiv markør for neoadjuvant anthracylcine-kjemoterapi i brystkreft [26] samt av PARP-inhibitor i GC [24].
Våre resultater viste at ATM proteintap ikke er en aggressiv faktor på GC, selv om den er signifikant assosiert med ugunstig utvikling av HR i MSI negativ GC. Dette kan sammenlignes med andre studier som rapporterer ATM protein tap som en negativ prognostisk faktor [20]. I våre studier,
ATM
mutasjon og ATM negativ GC hadde distinkte clinicopathologic kjennetegn; Men denne gruppen ikke viser noen overlevelse forskjell med andre. I MSI negativ gruppe, HR av GC med ATM protein tap var betydelig høy, men i MSI positiv gruppe, HR i GC med ATM protein tap ikke var signifikant. Dette indikerer at MSI er en potensiell molekylær biologisk faktor som påvirker oppførselen til GC. Dermed vår studie støtter at MSI status kan påvirke sensitiviteten til PARP hemmer ved å påvirke status av DNA skade respons protein uttrykk gjennom mononukleotid gjentar endringer.
I sammendraget,
ATM
genmutasjon i GC er 12,9%, og 33,0% av GC med
ATM
genmutasjon er forbundet med ATM protein tap. MSI positiv GC viste
ATM
mutasjon i 69,7%. Våre resultater tyder på at utfallet av ATM tap og følsomhet for kjemoterapeutisk forbindelse, olaparib, kan bli bedre forstått hvis saker blir stratifisert basert på
ATM
genmutasjon status eller MSI.
Konklusjoner
Vår studie viste
ATM
gen intron mutasjon er til stede i 69% av MSI positiv GC og 49% av
ATM
intron mutasjon er assosiert med tap av ATM-proteinet. Disse tyder på
ATM
gen intron mutasjon målrettet av mikro ustabilitet er forbundet med ATM protein tap i en undergruppe av menneskelig magekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Clinicopathologic korrelasjoner av magekreft med ATM genmutasjon og ATM protein uttrykk.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082769.s001 plakater (docx)
