Abstract
Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) og -β2 er korrelert med dårligere prognose i magekreft (GC), som fungerer både svulsten og immunceller. Men deres uttrykk i precanser og tumor-celleinteraksjoner med perifert blod mononukleære celler (PBMC) uklare. Proteinnivåer av TGF-β1 og -β2 ble analysert ved hjelp av immunhistokjemi og tilsvarende mRNA-nivåer ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR i 93 kirurgiske og biopsiprøver. Serum TGF-β konsentrasjonen ble påvist ved enzymbundet immunosorbentanalyse. AGS og MKN45 cellelinjer ble direkte eller indirekte cocultured med PBMC
in vitro
. TGF-β og Smad molekyler ble påvist etter cocultures og vekst av GC-celler og PBMC ble vurdert av celleproliferasjonsanalyse. Resultatene viste positiv farging for TGF-β1 ble påvist i 20% av kontrollprøver, 52,3% av forstadier til kreft, 59,1% av tidlig GC og 66,7% av avanserte GC prøver, korrelert med lesjon progresjon (χ
2 = 9,487,
P
= 0,002). Alle vev var positive for TGF-β2. TGF-β1 mRNA nivåene ble øket i avansert kreft, mens TGF-β2 øket tidligere. TGF-β1 mRNA-nivåer høyere i tumoren enn i peritumor, som positivt korrelert med Smad2 og Smad7. Serum TGF-beta nivåene var signifikant høyere hos pasienter med tidlig og avansert kreft sammenlignet med kontroller (TGF-β1:50.08 ± 4,38 og 45,76 ± 5,00 vs. 27,78 ± 6,11 ng /ml, TGF-β2:133.61 ± 21,90 og 111,34 ± 15,76 vs 59,41 ± 15,42 ng /ml, både
P
0,05). Nivåene av TGF-β1 mRNA og cytokinsekresjon var høyere i GC-celler etter direkte coculture sammenliknet med indirekte kultur. TGF-β1 ble redusert og TGF-β2 ble økt i PBMC etter cocultures. Videre TGF-β1 hemmet levedyktigheten av PBMC, men ikke kreftceller. Kollektivt, kan neoplastisk transformasjon være en tidlig begivenhet som involverer økning av TGF-β1 i den generelle og lokale miljøet. TGF-β1 produksjonen er fremmet av direkte interaksjon mellom GC celler og PBMC, som kan legge til rette for utvikling av kreft
Citation. Ma GF, Miao Q, Zeng XQ, Luo TC, Ma LL, Liu YM, et al . (2013) Transforming Growth Factor-β1 og -β2 i Gastric forstadier til kreft og kreft og roller i Tumor-celle interaksjoner med perifere mononukleære blodceller
In Vitro
. PLoS ONE 8 (1): e54249. doi: 10,1371 /journal.pone.0054249
Redaktør: Noriko Gotoh, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Japan
mottatt: 16 august 2012; Godkjent: 10 desember 2012; Publisert: 14 januar 2013
Copyright: © 2013 Ma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Xinjiang Uygur autonome region Science and Technology Support Project (No.200991127) (https://www.kjzj.gov.cn/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er en av de mest ødeleggende kreft hos mennesker, med en høyeste insidensraten skjer i Øst-Asia [1]. Transformerende vekstfaktor β (TGF-B) spiller viktige roller i ondartet svulst progresjon [2] – [4]. TGF-β familien inneholder TGF-β1, TGF-β2, og TGF-β3, som oppviser forskjellig og ikke-overlappende handlinger in vitro [5]. TGF-β1 og TGF-β2 hovedsakelig bidrar til progresjon av kreft ved å opptre i både tumorceller og stromale celler [6], [7], og et tap av følsomhet for vekstinhibering med TGF-β er tenkt å forekomme i de fleste kreftceller. I mellomtiden, kreftceller oppnå en fordel ved selektiv reduksjon av tumor-undertrykkende aktivitet av TGF-β og styrking av dets onkogene aktivitet [8], [9]. Tidligere studier har vist at TGF-β1 utgjør en selvstendig prognostisk faktor korrelert med tumorstadium og dårligere prognose [5], 10,11. Men statusene TGF-β protein og mRNA og deres roller i transformasjonen fra mage forstadier til kreft (PC) til carcinoma fortsatt uklare.
TGF-β er en sterk immunundertrykkende cytokin produsert av immunsystemet og ikke-immune celler , inkludert kreftceller [12], [13]. TGF-β kan fremme tumorvekst ved å fremkalle epitelceller til å gjennomgå epitelial-mesenkymale overgang [14]. Inhibering av TGF-β signalering er blitt rapportert å forebygge progresjon og metastasering av visse avanserte tumorer [15], [16], mens TGF-β1 har vist seg å redusere immunresponsen [17], [18] og stimulere angiogenese [19 ] i svulstens mikromiljø. Smad proteiner, som intracellulære effektorer av TGF-β signalering, blir aktivert av reseptorer og translocate inn i kjernen for å regulere transkripsjon [20]. Men Smad-avhengighet av TGF-β signalering i mage PC og tidlig kreft er fortsatt ikke fullt ut forstått.
TGF-β spiller viktige roller i svulstens mikromiljø, som involverer ikke bare samspill mellom immune og ikke-immune celler , men også veksling av noen cytokiner produksjon. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) er viktige cytokin-utskillende celler i immunsystemet og deres interaksjon med kreftceller kan fremkalle eller undertrykke kreft-spesifikke immunresponser, inkludert apoptoseinduksjon og cytokin produksjon, noe som bidrar mest til tumorprogresjon [12], [21 ], [22]. Interaksjoner mellom kreftceller og PBMC skje på to måter: ved direkte celle-til-celle-kontakt, og ved indirekte cytokin-avhengig middel. Selv om noen studier har vist at mange tumorceller kan generere CD4 + CD25 + regulatoriske T-celler fra perifert CD4 + naive T-celler via sekresjon av TGF-β [23], [24], [25], andre har vist at nivåene av cytokiner av TNF-α, interleukin (IL) -1β, IFN-γ ble økt i samspillet mellom tykktarmskreftceller og lymfocytter [26]. De to metoder for kontakt ble ikke sammenlignet i disse studiene, og den viktigste type interaksjon forblir således ukjent.
I denne studien evaluerte vi protein og mRNA-nivåer av TGF-β1, TGF-β2, og andre korrelerte molekyler i kirurgiske og endoskopiske prøver fra pasienter med forstadier til kreft og kreft, for å analysere sine roller i kreftutvikling. Vi har også cocultured GC celler med PBMC for å avgjøre om de interaksjon gjennom direkte celle-til-celle kontakt avhengig eller indirekte cytokin avhengig hjelp i et simulert svulstens mikromiljø.
Materialer og metoder
Pasient prøver
i alt 93 saker ble inkludert i denne studien, som består av 30 kirurgisk resected primære GC prøver, 43 neoplastisk og kreftprøver hentet fra endoskopisk submucosal disseksjon (ESD), og 20 kontrollbiopsiprøver fra normal-vises mage slimhinnen hos pasienter som ikke neoplastiske eller inflammatoriske sykdommer. Kjennetegn ved pasientene ble analysert som følger: 20 normalt vev (12 menn, 8 kvinner, gjennomsnittsalder = 45.20 ± 14,01 år, ringte 28-63 år), 21 PC herunder hovedsakelig lavgradig eller høyverdig intraepitelial neoplasi (15 hanner , 6 tisper, gjennomsnittsalder = 65,86 ± 7,81 år, range 57-79 år), 22 tidlig GC (EGC) definert som overfladisk svulst invadere ikke mer enn submucosa (14 menn, 7 kvinner, gjennomsnittsalder = 63.50 ± 13,82 år, rekkevidde 41-81 år), og 30 avanserte GC (AGC) (21 menn, 9 kvinner, gjennomsnittsalder = 59,48 ± 10,75 år, range 30-70 år). Alle pasientene ble bekreftet ved patologisk undersøkelse. Histologisk typen ble vurdert i henhold til Verdens helseorganisasjon klassifisering [27]. Gruppene studerte var demografisk sammenlignbar med kontrollgruppen (
P
0,05).
Etikk erklæringen
Pasienter som fikk radiochemotherapy, led av andre kreftformer, eller som hadde en familiehistorie med GC ble ekskludert fra studien. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag. Prosjektet ble godkjent av forskningsetiske komité for Zhongshan Hospital [28].
Immunohistochemistry (IHC)
TGF-B1 og TGF-p2 protein nivåer ble undersøkt ved IHC i 4-μm- tykke parafinsnitt kuttet fra en enkelt valgte blokk inneholder neoplastiske og ikke-neoplastiske mage vev. Prøvene ble rutinemessig avvokset og hydrert. Etter blokkering av endogen peroksidase-aktivitet, ble hentet antigener ved oppvarming med etylendiamintetraeddiksyre (pH = 9,0). Antigener ble deretter påvist ved anvendelse av et standard fargeprosedyre (EnVision ™ Detection Kit, Dako, CA, USA). Kanin polyklonale antistoffer ble brukt til å påvise TGF-β1 og TGF-β2 (alle fortynninger 1:100, Santa Cruz Biotechnology, California). For antistoff-negative kontrollene, ble de primære antistoffene substituert med normalt kaninserum. Saker ble ansett som positivt dersom minst 5% av dysplastiske eller kreftceller vises cytoplasma farging for TGF-β1 eller TGF-β2 ved x 100 forstørrelse.
Kvantitativ Real-time Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR)
Total RNA ble isolert fra biopsi og kirurgiske prøver, eller fra dyrkede celler, ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, USA). Komplementært DNA ble fremstilt ved bruk av oligo
dT primere i henhold til protokollen som fulgte med Primer Script ™ RT Reagent (Takara, Tokyo, Japan). Uttrykket nivåer av TGF-β1, TGF-β2, Smad2, Smad3, Smad4 og Smad7 mRNA ble bekreftet ved SYBR® Grønn II QRT-PCR ved anvendelse av Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) med to trinn, ved 95 ° C i 30 sekunder og deretter 60 ° C i 1 min, gjentatt i 40 sykluser. Alikvoter av PCR-produktene ble analysert ved smeltekurver for å teste deres spesifisitet. Alle primere, inkludert TGF-β1, TGF-β2, Smad2, Smad3, Smad4 og Smad7, ble testet for forsterkningsvirkningsgrad og normalisert til mRNA-nivået av glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) (tabell S1). Alle QRT-PCR eksperimenter ble utført av samme etterforsker uten kunnskap om de tilsvarende kliniske data.
Celler og cellekultur
AGS og MKN45 GC cellelinjer ble kjøpt fra Shanghai Institute of Cell Biology , Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). De ble rutinemessig dyrket i DMEM-medium (Gibco, Invitrogen, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco) i 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C.
Isolering av PBMC
PBMC ble isolert fra venous blod fra GC-pasienter eller kontroller, som tidligere beskrevet [22], [29]. I korthet ble 3 ml av blodet ble umiddelbart fortynnet i 3 ml av fosfatbufret saltløsning og lagt på 3 ml Ficoll-Paque Plus ™ (Amersham Healthcare, Aylesbury, UK). Etter sentrifugering, ble PBMC gjenvunnet fra den interlaget, resuspendert i fullstendig kulturmedium og dyrket ved 37 ° C i 24 timer for å tillate festing av adherente celler, slik som dendritiske celler.
Cell coculture Model
Transwell-plater (Corning, New York, USA) ble anvendt som en indirekte coculture modell, som inneholder nedre kammer og topp kamre med 0,4-um membranfilter porer som ikke tillater GC-celler til å passere gjennom, men tillate medium å utveksle fritt. Ko-inkubasjon av de to typer celler ble anvendt som en direkte coculture modell. Enkelt kultur av GC-celler ble definert som mono-kultur. GC-celler ble justert til 5 x 10
5-celler /ml utsådd i de nederste kamre i 6-brønns plater og inkubert i 8 timer for å tillate festing. Setter inn inneholder 5 × 10
5 celler /ml kultur PBMC ble deretter overført til de beste kamre og cocultured i ytterligere 24 timer i FBS fritt betinget medium eller fullstendig medium. Som negative kontroller ble innsatser med PBMC-er lagt på brønner med det samme dyrkningsmedium i fravær av kreftceller, og brønner med GC-celler var igjen uten innsatser. Celletallet i den monokultur gruppen var dobbelt så høy som i den coculture gruppe, for å sikre tilsvarende celletall i alle grupper. Supernatanter og celler ble samlet separat etter 24 timer for videre bruk.
Cell Proliferation Assay
En Cell-IQ celledyrking plattform (Chip-Man Technologies, Tampere, Finland), utstyrt med en fase -contrast mikroskop (Nikon CFI Achromat fasekontrast objektiv med 10 x forstørrelse, Nikon, Japan) og et kamera, ble brukt til å påvise vekst av tumorceller, som tidligere beskrevet [30]. I korthet GC ble cellene dyrket på 24-brønners plater (1 x 10
4 celler /brønn) i 24 timer og deretter behandlet med TGF-β1 (Peprotech, USA) ved 25 ng /ml. Kontrollgrupper ble ubehandlet. Cellene ble deretter inkubert i ytterligere 72 timer i Cell-IQ system. Bilder ble tatt ved 30-minutters intervaller i 72 timer, kontrollert av Image programvare (Chip-Man Technologies), og analysert ved hjelp av fritt-distribuert image programvare (McMaster biophotonics Facility, Hamilton, ON), ved hjelp av manuell tracking plug-in opprettet av Fabrice Cordeliéres (Institut Curie, Orsay, Frankrike). The Cell-IQ system diskriminerer automatisk dele og stabile celle etapper, og beregner den totale celle tall under spredning. Åtte bilder ble analysert for hver gruppe.
Mobiliteten av lymfocytter gjør det vanskelig å overvåke og beregne celle tall nøyaktig ved hjelp av Cell-IQ system. Vi brukte derfor en Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay (Dojindo, Kumamoto, Japan) for å vurdere levedyktigheten til PBMC, i henhold til leverandørens anvisninger. Kort sagt ble kultivert PBMC sådd ut ved 5 x 10
3 celler /brønn på 96-brønners plater. Kulturer ble behandlet med TGF-β1 eller ubehandlet som kontroll. Etter 72 timer ble CCK-8 reagenser tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert i 4 timer. -Celler ble deretter bestemt for fem brønner pr forsøksgruppen, på grunnlag av absorbansen ved 450 nm av den reduserte CCK-8-reagens, ved anvendelse av en automicroplate leser (Flexstation 3, Molecular Devices, USA). Cellelevedyktigheten ble uttrykt som prosent av levedyktige celler i forhold til tellinger av ubehandlede celler. Hvert eksperiment ble utført to ganger. Data ble midlet og en representant forsøket ble vist.
Enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA)
TGF-ß1 og TGF-ß2 nivåer i monokultur og coculture systemene ble bestemt ved hjelp av sandwich-ELISA Quantikine human TGF-β1 immunoassay og TGF-ß2 immunoanalyser (R
P
0,05). Sub-analyse viste at TGF-β1 mRNA-nivåene var signifikant høyere i forhold til AGC PC og kontrollgruppene (
P
0,05), mens TGF-p2-nivåene ble øket i EGC og AGC, sammenlignet med den kontrollgruppen (
P
0,01) (figur 2B). Videre TGF-β1 mRNA nivåene var høyere i svulst enn i peritumor (
P
0,001) (figur 2C); Men TGF-p2 nivåer viste motsatt tendens (
P
0,05) (figur 2D). I tillegg korrelasjonsanalyse identifisert positive korrelasjoner mellom mRNA nivåer av TGF-β1 og Smad2 (
r =
0,346,
P =
0,025) og Smad7 (
r =
0,461,
P =
0,002) (Figur 2E og 2F). TGF-β2, viste imidlertid ingen sammenheng med Smad2 eller Smad7, og verken TGF-β1 eller TGF-β2 ble korrelert med Smad3 eller Smad4. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at TGF-β1 og TGF-β2 kan spille ulike roller i tumorprogresjon.
(A) TGF-β1 mRNA nivåer i sekvensen fra kontrollene (
n
= 20), forstadier til kreft (PC) (
n
= 21), tidlig magekreft (EGC) (
n
= 22), til avansert magekreft (AGC) (
n
= 30). Data er gitt som middelverdier ± SD av transkripsjonsnivåer normalisert til GAPDH. (B) Tilsvarende TGF-β2 mRNA-nivåer i den samme sekvens. (C) og (D) TGF-ß1 nivåer ble oppregulert og TGF-p2-nivåer ble nedregulert i tumorvev, sammenliknet med peritumoral vev fra de samme pasientene. Nivåer var normalisert til GAPDH. Data fra QRT-PCR i 20 sammenkoblede tilfeller vises. (E) og (F) signifikant positiv korrelasjon mellom TGF-β1 og Smad2 /Smad7, ved hjelp av en bivariat korrelasjon modell. Data representerer de transkripsjonsnivåer i 36 tilfeller av GC etter normalisering til GAPDH. (G) Serumkonsentrasjonen av TGF-β1 og TGF-β2 målt ved hjelp av ELISA var signifikant høyere i tidlig og avansert GC sammenlignet med kontroller (
F =
4,745 og
P =
0,018;
F =
4,939 og
P =
0,015, henholdsvis). Det var ingen signifikant forskjell mellom tidlig og avansert GC.
Ctrl
: kontrollerer frivillige;
EGC
: tidlig mage kreft;
AGC
:. avansert magekreft
TGF-beta serumnivåer
For ytterligere å undersøke forekomsten av TGF-β i det generelle miljøet, vi sammenlignet serumkonsentrasjoner av TGF-β hos pasienter med EGC eller AGC til de i kontrollene. Serumkonsentrasjonen av TGF-β1 i kontroller og hos pasienter med EGC og AGC var 27,78 ± 6,11, 50,08 ± 4,38 og 45,76 ± 5,00 ng /ml, henholdsvis, mens de tilsvarende verdier for TGF-β2 ble 59,41 ± 15,42, 133,61 ± 21,90 og 111,34 ± 15,76 ng /ml, respektivt. Nivåer av både TGF-β1 og TGF-β2 var signifikant høyere hos pasienter med EGC eller AGC forhold til de i kontrollene (
F =
4,745 og
P =
0,018;
F =
4,939 og
P =
0,015). Men det var ingen signifikante forskjeller mellom pasienter med tidlig og sent stadium av GC (figur 2G). Disse resultater antyder at den unormale status av TGF-β i gastrisk karsinogenese kan være en systemisk reaksjon som involverer ikke bare svulsten mikromiljøet, men også det generelle sirkulasjonssystemet.
coculture In Vitro
A coculture modellen ble etablert for å bestemme om direkte celle-til-celle-kontakt eller indirekte cytokin avhengig kontakt er hovedmekanismen i en etterligne tumor mikromiljøet. For det første var det ingen signifikant forskjell i resultatene av TGF-β1 og TGF-β2 mRNA-nivåer i GC celler i direkte coculture modell ved hjelp av PBMC isolert fra GC-pasienter eller kontrollene (figur 3A), og disse dataene ble derfor samlet for analyse. Videre konsentrasjoner av TGF-β1 i cellesupernatanten av cocultures ble signifikant økt sammenlignet med de i PBMC eller GCer dyrket alene i en FBS-fritt miljø (
P
0,05) og dets nivå i direkte coculture gruppe var betydelig høyere enn de i den indirekte gruppen (
P =
0,029); imidlertid, selv om TGF-p2-nivåer ble også øket i direkte cocultures, forskjellene etter cocultures var ikke signifikant (figur 3B).
(A) TGF-ß1 og TGF-β2 mRNA-nivåer i GC-celler etter direkte cocultures ble øket sammenlignet med monokultur, men det var ingen signifikant forskjell i TGF-β1 og TGF-β2 mRNA-nivåer i GC-celler, uavhengig av opprinnelsen til PBMC (GC pasienter eller kontroller). (B) TGF-β1concentrations i cellen supernatanten av cocultures ble betydelig økt sammenlignet med de i PBMC eller GCer dyrket alene i en FBS-fritt miljø (
P
0,05). Dens nivåer i direkte coculture gruppen var betydelig høyere enn de i den indirekte gruppen (
P =
0,029). TGF-p2-nivåer ble også øket i direkte cocultures, men forskjellene etter cocultures var ikke signifikant. (C) cytokinproduksjon nivåene var signifikant økt i indirekte coculture grupper etter tilsetning av FBS (
P
0,05), men ingen åpenbar forandring ble påvist i direkte coculture seg. Forsøket ble utført to ganger. Alle data er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikater. (D) Opprinnelse av cytokiner. I GC-celler, ble TGF-β1 mRNA nivåer økte ca. 3 ganger i direkte coculture og økte to ganger i indirekte en sammenlignet med monokulturer; TGF-β2 mRNA nivåer ble signifikant økt etter direkte coculture men ikke statistisk endret etter indirekte en. I PBMC, ble TGF-β1 mRNA-nivåer signifikant redusert og TGF-p2-nivåene ble merkbart øket etter cocultures. Nivåer var normalisert til GAPDH, og nivåer i gruppen monokultur ble definert som 1,0. Alle data er vist som gjennomsnitt ± SD. (E) De mRNA-nivåene av Smad2 og Smad3 i GC-celler ble signifikant økt etter cocultures (
P
0,05), som var høyere i den direkte coculture enn de i den indirekte ett, men det var ingen statistisk forskjell i nivåene av Smad4. (F) Cell-IQ viste at tilsetning av eksogen TGF-β1 (25 ng /mL) for å GC-celler undertrykkes veksten og delingen av tumorceller, men med ingen signifikant forskjell. Åtte bilder fra forskjellige synsfelt ble analysert for hver gruppe. (G) Celletelling leder-8 (CCK-8) analyse viste at TGF-β1 (25 ng /ml) inhiberte levedyktigheten av PBMC vesentlig i 72 timer. Linjen viser inhiberingen forholdet av TGF-P1 stimulerte celler sammenlignet med ubehandlede kontroller.
GC:
magekreft;
PMBC:
perifert blod mononukleære cellen;
Dir-co:
direkte coculture;
Ind-co:
indirekte coculture;
Mono:
monokultur;
FBS:
fetal bovine serum.
ns, etter ikke signifikant; *,
P
0,05; **
P
. 0,05
Vi undersøkte deretter effekten av serum på samspillet mellom kreftceller og PBMC. Overraskende, TGF-ß1 og TGF-ß2 konsentrasjoner i indirekte gruppen, sammenlignet med det i det FBS-fri tilstand, var omvendt høyere enn de i gruppe direkte etter tilsetningen av FBS. Videre er konsentrasjonen av TGF-β1 og TGF-β2 i cellesupernatanten ble signifikant økt i indirekte grupper (
P
0,05), men de var bare svakt økt i direkte grupper (
P
0,05), ved tilsetning av FBS (figur 3C). Dette tyder på at en beriket miljø kan lette cytokin produksjon i indirekte ikke i direkte kommunikasjon.
Videre, for å fastslå opprinnelsen til cytokiner, ble TGF-P1 og TGF-β2 mRNA nivåer målt i GC-celler og PBMC henholdsvis . Sammenlignet med monokultur, ble TGF-β1 mRNA nivåer økte ca. 3 ganger i direkte gruppe og to ganger i den indirekte gruppen i GC celler etter coculture med PBMC; TGF-β2 mRNA nivåer ble signifikant økt i GC celler etter direkte coculture men ikke statistisk endret etter indirekte coculture. I mellomtiden ble TGF-β1 mRNA nivåer sunket betraktelig og TGF-β2 mRNA nivåer ble økt mer enn fem ganger i PBMC etter cocultures (
P
0,05) (Figur 3D). Disse resultatene indikerer at de forhøyede TGF-ß1 nivåer i cellesupernatanten kan stamme fra GC-celler, mens TGF-β2 kan stamme fra PBMC. I tillegg har vi funnet at mRNA-nivåene av Smad2 og Smad3 i GC-celler ble også øket betydelig etter cocultures, som var høyere i direkte coculture enn de i den indirekte ett, men det var ingen statistisk forskjell i nivåene av Smad4 (figur 3E). Samlet viser disse resultater antyder at cytokiner produksjon i hovedsak er avhengig av direkte interaksjon mellom kreftceller og PBMC, og TGF-β /Smad2 /3-signalisering kan bli markedsført under denne prosessen.
Til slutt, for ytterligere å utforske TGF-β1 roller i GC-celler og PBMC, ble cellevekstevne av de to typer celler som detektert ved tilsetning av eksogen TGF-β1 til monokulturer av PBMC eller GC-celler. Cell-IQ viste at gjennomsnittstall for både totalt og dele celler ble redusert; rekonstituert TGF-β1 hemmet veksten av GC-celler etter 72 timer, men forskjellen var ikke signifikant (figur 3F), mens eksogen TGF-β1 betydelig påvirket levedyktigheten av PBMC (figur 3G). Dette funn tyder på at forhøyet TGF-β1 hovedsakelig inhiberte funksjon av mononukleære celler, men ikke av tumorceller.
Til sammen utgjør disse funn i den delen vist at interaksjonen mellom tumorceller og PBMC skjer hovedsakelig via direkte celle -til-celle kontakt, men med noen bidrag fra cytokin-avhengige kontakt. Videre er beriket betingelser fremme produksjon av cytokiner, slik som TGF-β1 og TGF-β2. TGF-β1 handlet hovedsakelig ved å hemme funksjonen av PBMC, men ikke fra GC-celler.
Diskusjoner
Misdannelser i vekstfaktor og cytokinutskillelse, spesielt TGF-β, spiller sentrale roller i kreftutvikling [ ,,,0],3], [32]. Men til vår beste kunnskap, protein og mRNA-statusene til TGF-β1 og TGF-β2 i forstadier til kreft har ikke blitt godt undersøkt, og produksjonen av cytokiner i samspillet mellom kreftceller og PBMC fortsatt uklart. Denne studien bestemmes derfor profilene til TGF-β1 og TGF-β2 i mage forstadium for kreft og kreft, og utforsket arten av vekselvirkningen (direkte eller indirekte) mellom kreftceller og PBMC og dens effekt på cytokin-produksjon.
Tidligere studier har funnet at økt ekspresjonsnivå av TGF-ß1 og TGF-ß2 proteiner var assosiert med dårligere prognose [5], [11], og TGF-β1 mRNA og proteinnivåene ble økt i dysplastiske og GC-vev i forhold til normal gastrisk vev [33], [34]; i motsetning til TGF-β2 mRNA-nivåer i vev GC var sammenlignes med kontroller [33]. Resultatene av denne studien bekreftet og utvidet tidligere observasjoner; TGF-β1 mRNA-nivåene var signifikant høyere i AGC, mens TGF-p2-nivåene var høyere i dysplasia og EGC. Videre TGF-β1 mRNA-nivåer høyere i tumoren enn i peritumor, mens TGF-β2 demonstrerte den motsatte tendens. TGF-β1 proteinnivåer viste ved IHC var i samsvar med disse resultatene. Disse funnene antyder at neoplastisk transformasjon kan være en tidlig begivenhet som involverer økning av TGF-β1, sammen med tapet av TGF-β2.
Selv om en tidligere undersøkelse viste at 80% av intestinal-type GC prøver uttrykt TGF -β1 sammenlignet med bare 43% av diffus-type [10], fant vi ingen forskjell i uttrykket av TGF-β1 i forhold til
Hp
infeksjon, Lauren klassifisering eller spredning til lymfeknuter. Aktivert TGF-β1 var rikelig i slimhinnene i
Hp
-infected pasienter, men det var ingen signifikant forskjell sammenlignet med
HP
-negative pasienter [35]. I tillegg viser våre resultater viste også at noen stromale celler ble farget positive for TGF-β1. På samme måte ble mononukleære celler i lamina propria rapportert å være hovedkilden for TGF-β1 [36]. Comerci
et al product: [37] viste at TGF-β1 utskilles i eller produsert ved å støtte stromale elementer kan indirekte fremme tumorprogresjon. Ottaviano
et al product: [38] viste at crosstalk mellom kreftceller og stromale elementer mediert av TGF-β1 påvirket celleoverflate og pericellulær matrix-nedverdigende potensial
in vitro
. Vi har derfor konkludere med at sekresjon av TGF-β av tumorceller og stromale celler kan spille en viktig rolle i forekommende og opprettholdelse av tumor-mikromiljøet.
Resultatene viste at TGF-β ble også uttalt i det perifere system, ettersom serumkonsentrasjon av TGF-β1 og TGF-β2 i GC-pasienter var høyere enn de i kontrollene. Imidlertid er forholdet mellom serumkonsentrasjonen av TGF-β1 og clinicopathological tegn kontroversielt. Tidligere studier funnet at serumkonsentrasjonen av TGF-β1 i GC pasienter som var betydelig høyere enn i kontrollene, og ble positivt korrelert til tumormasse, invasjon, metastase, og klinisk stadium [39], [40].
