Abstract
Bakgrunn
TM4SF1 er overuttrykt i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) og påvirker utviklingen av denne kreftformen. Dessuten er multiresistens (MDR) vanligvis forbundet med svulst chemoresistance i bukspyttkjertelkreft. Men fortsatt er sammenheng mellom TM4SF1 og MDR ukjent. Denne forskningen har som mål å undersøke effekten av TM4SF1 på gemcitabin motstand i PDAC og utforske mulige molekylære mekanismen mellom TM4SF1 og MDR.
Metoder
uttrykk for TM4SF1 ble evaluert i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og menneskelige pankreasgang epitel (HPDE) cellelinjer ved kvantitativ RT-PCR. TM4SF1 siRNA transfeksjon ble gjennomført ved hjelp Hiperfect transfeksjon reagens å slå ned TM4SF1. Transkripsjonene ble analysert ved kvantitativ RT-PCR, RT-PCR og Western blotting for videre studier. Den celleproliferasjon og apoptose ble innhentet for å undersøke følsomheten til gemcitabin av kreft i bukspyttkjertelen celler etter stanse TM4SF1
in vitro
. Vi viste at cellesignalisering av TM4SF1 mediert chemoresistance i kreftceller ved å vurdere uttrykk for multiresistens (MDR) gener ved hjelp av kvantitativ RT-PCR.
In vivo
, vi brukte ortotopiske bukspyttkjerteltumormodeller for å undersøke effekten av spredning etter stanse TM4SF1 av et lentivirus-mediert shRNA i MIA PACA-2 cellelinjer.
Resultater
Den mRNA uttrykk for TM4SF1 var høyere i sju bukspyttkjertelkreft cellelinjer enn i HPDE cellelinjer. I tre gemcitabin-sensitive cellelinjer (L3.6pl, BxPC-3, SU86.86), ekspresjon av TM4SF1 var lavere enn den i fire gemcitabin-resistente cellelinjer (MIA PACA-2, Panc-1, Hs766T, AsPC- 1). Vi vurderte at TM4SF1 var en antatt mål for gemcitabin motstand i kreft i bukspyttkjertelen celler. Ved hjelp av ASPC-1, MIA PACA-2 og PANC-1, undersøkte vi at TM4SF1 stanse berørte celleproliferasjon og øker prosentandelene av celle apoptose mediert av behandling med gemcitabin, sammenlignet med celler som ble behandlet med negativ kontroll. Denne motstanden var assosiert med uttrykk for multiresistens gener inkludert ABCB1 og ABCC1.
In vivo
, stanse av TM4SF1 i MIA PACA-2 cellelinjer økte effektiviteten av gemcitabin-basert behandling i ortotopiske bukspyttkjerteltumormodeller evaluert ved hjelp av ikke-invasiv selvlysende avbildning.
Konklusjon
Disse funnene tyder på at TM4SF1 er en overflate membranantigen som er sterkt uttrykt i kreft i bukspyttkjertelen celler og øker chemoresistance til gemcitabin. Således kan TM4SF1 være et lovende mål for å overvinne den chemoresistance av kreft i bukspyttkjertelen
relasjon:. Cao J Yang J, Ramachandran V, Arumugam T, Deng D, Li Z, et al. (2015) TM4SF1 Fremmer Gemcitabine Resistance av bukspyttkjertelkreft
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 10 (12): e0144969. doi: 10,1371 /journal.pone.0144969
Redaktør: James Freeman, University of Texas Health Science Center, UNITED STATES
mottatt: 26 august 2015; Godkjent: 25 november 2015; Publisert: 28.12.2015
Copyright: © 2015 Cao et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av NIH-DK05207 (til CD Logsdon), Cancer Center Support Core-stipend CA016672 (UT MD Anderson Cancer Center), den Lockton Endowment (til CD Logsdon), og Natural Science Foundation National Kina, 81301826 (til Jia Cao)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den mest aggressive menneskelige malignitet med høy dødelighet [1]. Den gjennomsnittlige 5-års overlevelse for pasienter diagnostisert med PDAC er 7,1% og median overlevelse varighet er kortere enn 6 måneder [2, 3]. Siden mangler av tidlige spesifikke symptomer, er de fleste av pasientene diagnostisert i sene stadier. Kjemoterapi bruker gemcitabin er ansett som en første-linje behandling for lokalavansert eller metastatisk kreft i bukspyttkjertelen for å forlenge overlevelsestiden og forbedre kvaliteten på pasientenes liv [4]. Men den høye frekvensen av motstand mot gemcitabin reduserer anti-tumor effekt [5]. Dermed er effektive kjemoterapeutiske metoder fortsatt sterkt behov for å forbedre resultatet for denne kreftformen.
multiresistens (MDR) er preget av kryssresistens mot cellegifter med målse [6]. De viktigste mekanismene for gemcitabin chemoresistance er relatert til narkotika opptak, metabolisme og handling [4]. En av de vanligste grunnene til å resultere i MDR i kreftceller er via overekspresjon av adenin trifosfat (ATP) -binding kassett (ABC) transportører. Disse transportører bidrar til MDR ved å indusere den antiapoptotic maskineri, å øke den intracellulære legemiddelutstrømningen og redusere medikamentkonsentrasjonene [7]. Nylig har studier vist at gemcitabin motstand i kreft i bukspyttkjertelen celler er assosiert med ekspresjon av MDR [8,9]. Derfor er det viktig å hemme disse transportører for å gjenopprette sensitiviteten til kjemoterapeutiske motstand i bukspyttkjertelkreft.
TM4SF1 er et medlem av den fire-transmembran-domene familie med en tetraspanin topologi og sekvens-homologi med IL-TMP, TM4SF5, L6D, OCTM4, og TCCE518. Uttrykket nivåer av TM4SF1 er økt i ulike menneskelige epitelceller karsinomer inkludert lunge, bryst, tykktarm, eggstokkreft, prostatakreft og nyre karsinom [10-12]. Det spiller en viktig rolle i regulering av tumor angiogenese, motilitet, migrering og invasjon [13, 14]. Viktigere, nylig studie har vist at TM4SF1 målretting Antistoff legemiddelkonjugater representerer en lovende terapeutisk middel mot kreftceller og svulsten blodkar [15]. Dermed målet med denne studien var å undersøke om TM4SF1-overekspresjon bukspyttkjertelkreft cellelinjer er involverte i gemcitabin motstand og å avgrense mekanismen.
I denne studien har vi ønsket å finne ut om TM4SF1 kan gi kreft i bukspyttkjertelen med evnen til å gemcitabin resistance.We funnet at TM4SF1 ble sterkt uttrykt i gemcitabin-motstandsbukspyttkjertelcancercellelinjer. Stanse av TM4SF1 økte gemcitabin følsomheten kjemoresistent celler og redusert uttrykk av ABCB1 og ABCC1
in vitro
.
In vivo
, celler som mangler TM4SF1 hadde redusert bukspyttkjerteltumorvekst og økt respons til behandlinger med gemcitabin. Disse resultatene tyder på at TM4SF1 bør undersøkes nærmere som et potensielt mål for kreft i bukspyttkjertelen terapi.
Materialer og metoder
Narkotika og reagenser
gemcitabin ble kjøpt fra Eli Lilly and Co (Indianapolis, IN). Alle reagenser ble levert av Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), med mindre angitt nedenfor.
bukspyttkjertelkreft cellelinjer og kulturforhold
Den menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer HS766T, MIA PACA-2, PANC-1, ASPC-1, BxPC-3, L3.6PL og SU.86.86 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). BxPC-3 og ASPC-1-celler ble rutinemessig dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum i en 37 ° C inkubator i en fuktet atmosfære av 5% CO2, mens alle andre bukspyttkjertelcancercellelinjer vokste i Dulbeccos modifiserte Eagles medium, Humant pankreasgang epitelceller (HPDE) celler [16] levert av Dr. Tsao (University of Toronto) ble dyrket i keratinocytt serumfritt medium. Cellelinjene ble innhentet fra ATCC og ble godkjent av kort tandem repeat profilering og passert i vårt laboratorium for færre enn 6 måneder etter mottak eller gjenoppliving.
Kvantitativ sanntid revers transkripsjon PCR-analyse
Total RNA ble isolert fra bukspyttkjertelcancercellelinjer og HPDE, og kvaliteten av RNA ble bestemt som tidligere beskrevet [17]. RNA ble brukt for kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon analyse. Real-time kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon ble utført med SYBR grønt som tag ved hjelp av en iCycler. (Bio-Rad)-sekvens av primerne er tilgjengelig på forespørsel
Omvendt transkripsjon PCR-analyse
PCR ble utført ved hjelp av en PCR Kit (Promega) med følgende forsterkning programmet. Pre- denaturering i 3 minutter ved 94 ° C denaturering i 30 sekunder ved 94 ° C, glødning i 30 sekunder ved 60 ° C, forlengelse i 30 sekunder ved 72 ° C, og en avsluttende forlengelsestrinn ved 72 ° C i 10 min. PCR ble utført i 30 sykluser. Etter PCR, ble 5 mL av PCR produktene kjøres på en 1% agarosegel og visualisert ved relative pixel densitometry.
Transient transfeksjon av små interfererende RNA
ASPC-en, MIA PACA-2, og PANC-1-celler ble sådd ut på 100 mm skåler og transient transfektert med kontroll liten interfererende RNA (siRNA [siControl]) og TM4SF1 siRNA (siTM4SF1) ved sluttkonsentrasjoner på 10 nmol /l med Hiperfect transfeksjon reagens (QIAGEN). SiRNA sekvens målretting TM4SF1 var AAGGACCACTATGTCTTGATT. mRNA ble isolert fra ASPC-en, MIA PACA-2, og Panc-1 celler for kvantitativ RT-PCR etter 48 timer.
Western blotting-analyse
Protein ble ekstrahert med RIPA buffer supplert med 1% PMSF i 30 minutter. Hver ekstrakt inneholdende 50 ug protein ble separert ved 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Membranene ble blokkert i 5% fettfri tørrmelk i 3 timer og deretter inkubert med kanin-anti-TM4SF1 (Abcam, 1: 1 000 fortynning) ved 4 ° C over natten. Membraner ble inkubert med pepperrotperoksydase-konjugert geit-anti-kanin-IgG-antistoff i 2 timer ved romtemperatur. Blottene ble påvist ved anvendelse av ECL (Millipore) og eksponert for røntgenfilm for å visualisere bildene.
Utvikling av stabile kort hårnål RNA-uttrykkende cellelinjer
stanse av TM4SF1 i bukspyttkjertelkreft celle linjer ble oppnådd ved å bruke lentiviral infeksjon. Lentiviral plasmid vektorer som inneholder kontroll og TM4SF1 kort hårnål RNA (shRNA; Åpne Biosystems) ble ko-transfektert med emballasje vektorer og lentivirus ble produsert i 293T celler via kalsium transfeksjon som beskrevet tidligere [17] .TM4SF1 shRNA-inneholder vektorer ble titrert, og MIA PACA-2 ble infisert med 25 ul viral supernatant /per milliliter medium blandes med polybrene (4 mg /ml medium). Cellene ble deretter utvalgt etter sin resistens overfor puromycin (1-3 ug /ml). Stabil bukspyttkjertelkreft cellelinje ble utviklet etterpå.
spredningsanalyse
Vi brukte MTS analyse for å undersøke effekten av gemcitabin etter stanse TM4SF1 på spredning av ASPC-en, Mia Paca-2 og PANC -1 cellelinjer. Celler som vokser på en 6-brønners plate ble behandlet med kontroll siRNA eller siTM4SF1. 24 timer etter transfeksjon, ble cellene samlet og 1500 celler ble sådd ut i 96-brønners plater. Etter at cellene ble behandlet med gemcitabin i 48 timer, ble 15μL av MTS-løsning tilsatt til hver brønn, inkubert ved 37 ° C i 2 timer. Celle tall ble beregnet ved hjelp av fotometrisk avlesning, som beskrevet tidligere [18,19].
apoptose studie med fluoresens-aktivert celle sortering analyse
in vitro
I forrige undersøkelse fant vi bukspyttkjertelkreft cellelinjer ASPC-1, MIA PACA-2 og Panc-1 var resistente mot gemcitabin
in vitro product: [19]. Standard propidiumjodidfarging av kreft i bukspyttkjertelen celler ved bruk av hypoton lysis-fremgangsmåten ble benyttet for apoptose studier med fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). ASPC-1, ble MIA PACA-2 og PANC-1-celler forbigående transfektert med siControl eller siTM4SF1 i 24 timer utsådd i seks-brønns plater. Apoptose ble indusert i cellene ved å behandle dem med gemcitabin (1, 5 eller 10 umol /l) i 48 eller 72 timer. Cellene ble deretter oppsamlet ved trypsinering, fiksert med 70% kald etanol, blandet med 500 ul av en hypoton løsning (0,1% natriumcitrat, 0,1% Triton X-100, 20 pg /ml RNase, og 50 ug /ml propidiumjodid) , inkubert i 30 minutter og analysert via flowcytometri ved hjelp av et EPICS-XO system (Beckman Coulter). Celler som gjennomgår apoptose på grunn av DNA-fragmentering ble oppdaget som befolkningen av celler med sub-G1 DNA innhold.
Dyr og Tumor vekst studie
in vivo
Denne studien ble gjennomført ut i henhold til de retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health. Bruk av mus ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité MD Anderson Cancer Center.
MIA PACA-2-celler ble modifisert til å stabilt uttrykke en ildflue luciferase genet via lentiviral transfeksjon [20]. Den tumorgene evne TM4SF1 shRNA-dempede-celler ble sammenlignet med den for kontroll shRNA-transfekterte celler i ortotopiske pankreastumorer som ble dannet i 5 uker gamle hann atymiske nakne nu /nu mus. 28 naken nu /nu mus ble delt inn i fire grupper (gruppe 1, shCtrl, gruppe 2, shCtrl + GEM, gruppe 3, shTM4SF1, gruppe 4, shTM4SF1 + GEM). Alle dyr ble gitt mat og sterilt vann autoklaveres på en daglig 12 timers lys /12 timers mørk syklus. MIA PACA-2-celler ble stabilt transfektert med shTM4SF1 eller kontroll shRNA. Disse cellene deretter økte til 80% konfluens, og ble høstet via trypsinering, vasket en gang i PBS og resuspendert til en sluttkonsentrasjon på 5 x 10
6 celler /ml. Cellesuspensjoner (50 ul hver) ble injisert inn i pancreases av syv mus per testgruppe. Etter en uke, ble disse musene behandlet med eller uten gemcitabin (100 mg /kg kroppsvekt). Tumorvekst ble vurdert ved hjelp bioluminescent bildebehandling og overlevelse av dyr ble registrert. Musene ble overvåket hver uke for eventuelle symptomer og tegn. Etter 7 uker, to mus hadde tegn på åndenød og unormal bevegelse og en av tumorene ble overskredet 15% kroppsmasse. Alle mus ble avlivet på isoflurananestesi fulgt ved cervikal dislokasjon, og hver musens bukspyttkjertel ble fjernet. Også svulstene ble veid.
Den selvlysende avbildning ble utført med en kryogenisk avkjølt imaging system kombinert med en datainnsamling datamaskin som kjører den levende bilde programvaren (Xenogen). Før avbildning, ble dyrene bedøvet i en akrylkammer med en 1,5% isofluran /luftblanding og injisert intraperitonealt med 15 mg /ml Luciferin kaliumsalt i PBS ved en konsentrasjon på 150 mg /kg kroppsvekt. Digital graysclae dyre bilder ble ervervet, som ble etterfulgt av oppkjøp og overlegg av en pseudocolor bilde som representerer den romlige fordelingen av påviste fotoner som kommer ut av aktiv luciferase i hvert dyr. Signalintensitet ble kvantifisert som summen av alle oppdagede fotoner innenfor regionen av interesse per sekund.
Celleproliferering studie ved hjelp av en prolifererende cell nuclear antigen analysen
in vivo
Analysis av kreft i bukspyttkjertelen celle proliferasjon i tumorvevet ble utført ved anvendelse av en kommersielt tilgjengelig prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) kit (Jackson Immunoresearch) som beskrevet i detalj tidligere [21]. Parafininnstøpte deler av tumorvev ble behandlet med og uten gemcitabin ble analysert for proliferasjon. Immunhistokjemiske flekker av seksjonene ble analysert ved hjelp av et Olympus mikroskop. Bilder av delene ble tatt med et avkjølt CCD kamera (fotometriske) og Smart Capture programvaren (Digital Scientific). For å kvantifisere hendelsene spredning ble flekker resultatene evalueres av en patologisk forsker (Dr. Henry Wang).
Statistisk analyse
Alle
in vitro
Forsøkene ble utført i triplikat og man har utført tre eller flere ganger. Data er presentert som middel fra uavhengige eksperimenter (± standardfeil [SE]). Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt ved anvendelse av Kruskal-Wallis eller to-halet uparet Student t-test, Dunnetts multiple sammenligningstest og Mann-Whitney U-test. P nivåer mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
TM4SF1 er sterkt uttrykt i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer
I tidligere profilering studier ble TM4SF1 mRNA uttrykk forhøyet i bukspyttkjertelen svulster og kreft cellelinjer [22]. Og studien fant at fire cellelinjer (BxPC-3, SU86.86, CFPAC-en, L3.6pl) var følsom og fem cellelinjer (Panc-1, Hs766T, MIA PACA-2, ASPC-en, Mpanc96) ble motstandsdyktig mot gemcitabin basert på 50% vekstinhibering [19]. Vi undersøkt videre TM4SF1 mRNA uttrykk i syv bukspyttkjertelkreft cellelinjer og HPDE celler. Kvantitativ RT-PCR-analyse indikerte at alle bukspyttkjertelkreft cellelinjer uttrykte av TM4SF1 i større grad enn de ikke-transform HPDE-celler. MRNA-ekspresjon av TM4SF1 i fire gemcitabin-sensitive cellelinjer (MIA PACA-2, Panc-1, Hs766T, ASPC-1) var høyere enn i tre gemcitabin-resistente cellelinjer (L3.6pl, BxPC-3, SU86. 86) (fig 1).
Kvantitativ RT-PCR-analyse resulterte vedrørende uttrykk for TM4SF1 mRNA i human bukspyttkjertelkreft celle lines.TM4SF1 mRNA ble mer høyt uttrykt i kreftcellelinjer enn i HPDE celler. MRNA uttrykk for TM4SF1 var lavere i tre gemcitabin-sensitive cellelinjer (L3.6pl, BxPC-3, SU86.86) enn at i fire gemcitabin-resistente cellelinjer (MIA PACA-2, Panc-1, Hs766T, AsPC- 1).
TM4SF1 stanse øker følsomheten for gemcitabin
for å undersøke den funksjonelle rollen TM4SF1 i kreft i bukspyttkjertelen celler, vi transient transfektert ASPC-en, MIA PACA-2, og PANC-1 celler med siControl og siTM4SF1 og bekreftet stanse av TM4SF1 i cellene ved hjelp av kvantitativ RT-PCR, RT-PCR og Western blotting (fig 2A og S1 figur) .For å evaluere effektene av TM4SF1 på celle overlevelse og motstand mot kjemoterapi, vi behandlet MIA PACA-2, PANC-1 og ASPC-1-celler, som alle uttrykker høye nivåer av TM4SF1 nativt, med forskjellige konsentrasjoner av gemcitabin i nærvær av enten siControl eller siTM4SF1. MTS analyseresultatene viste at spredningskapasiteten var lavere i siTM4SF1 celler enn det i siControl celler etter behandling med gemcitabin (figur 2B). Også stanse av TM4SF1 økte apoptotiske respons på behandling med gemcitabin med forrige konsentrasjon (1, 5 eller 10μmol /L) i alle tre cellelinjer [19] (figur 2C).
(A) Kvantitativ RT PCR og Western blotting demonstrerte ved å stanse all TM4SF1 i ASPC-en, MIA PACA-2 og PANC-en cellelinjer. Cellelinjene ble transient transfektert med siControl eller siTM4SF1, og mRNA ble isolert fra dem etter 48 timer og protein ble isolert etter 72 timer. (B) ASPC-1, PANC-1 og MIA PACA-2-celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av gemcitabin, respektivt. Resultatene av MTS-analysen viste at spredning evnen til siTM4SF1 celler var lavere enn for siControl celler etter behandling med gemcitabin. (C) Etter 72 timer, ble prosentandelen av celler med sub-G0 /G1 DNA-innhold identifiseres via FACS. TM4SF1 stanse resulterte i økt sensitivitet av cellene til behandling med gemcitabin, noe som resulterer i økt apoptose priser. (Kolonner, betyr for tre forsøk,. Barer, standardavvik * P. 0,05 versus kontroll).
TM4SF1 regulerer uttrykket av multiresistensgener i kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
multiresistens (MDR) gener bidrar til gemcitabin følsomhet i bukspyttkjertelen kreftceller. Den ABCB1, ABCC1, ABCC3 og ABCC5 er godt karakterisert MDR gener. I ASPC-en, MIA PACA-2 og PANC-1 cellelinjer, mRNA uttrykk for ABCB1 og ABCC1 ble betydelig redusert etter stanse TM4SF1 bruker kvantitativ RT-PCR (fig 3).
Kvantitativ RT-PCR data viser fold endringer i mRNA nivå av ABCB1 og ABCC1 gener etter stanse TM4SF1 i ASPC-en, MIA PACA-2 og PANC-1 cellelinjer.
TM4SF1 stanse øker følsomheten for kreft i bukspyttkjertelen celler til gemcitabin-indusert vekst
in vivo
for ytterligere analyse av påvirkning av TM4SF1
in vivo
, vi transfektert MIA Paca-2 som har relativt høye nivåer av endogen TM4SF1 uttrykk med shRNA konstruerer til stabilt redusere TM4SF1 uttrykk. Vi bekreftet shRNA lyddemping bruker kvantitativ RT-PCR og Western blotting og observerte at TM4SF1 mRNA uttrykk redusert med mer enn 80% med shTM4SF1 # 1 (figur 4A). Deretter analyserte vi effektene av stabilt stanse TM4SF1 på pankreastumorer utviklet i immuno-mangelfull mus. Ortotopiske svulster ble utviklet med MIA PACA-2-celler som stabilt uttrykker shControl eller shTM4SF1 og ble overvåket ved hjelp av ikke-invasiv bioluminescent bildebehandling. Celler som mangler TM4SF1 utviklet tumorer i en lignende grad som kontroller. Imidlertid gemcitabin behandling hadde nesten ingen virkning på de shControl-transfekterte grupper av disse svært gemcitabin-resistente celler, men etter tie TM4SF1 i disse cellene, gemcitabin-baserte behandlingen resulterte i markert lavere tumorvolumer (fig 4B). Støtte til sensibilisering av MIA PACA-2 celler til behandling med gemcitabin ved stanse av TM4SF1, PCNA analyse (fig 4C) indikerte markert lavere spredning av vev med taushet TM4SF1 og behandlet med gemcitabin enn for alle andre vev (tabell 1).
Kvantitativ RT-PCR og Western blotting viste ved å stanse all TM4SF1 i MIA Paca-2 stabilt transfektert med shControl eller shTM4SF1. (B) Svulster forårsaket av MIA PACA-2-celler som stabilt uttrykker shControl eller shTM4SF1 og uttrykker luciferase genet utviklet i nakne mus. Ved slutten av forsøket ble dyrene analysert ved hjelp av selvlysende avbildning. Vekter av tumorer indusert av MIA PACA-2-celler som stabilt uttrykker shRNA med eller uten gemcitabin (100 mg /kg) behandling i nakne mice.The tumorvektene (g) av shCtrl, shCtrl + GEM, shTM4SF1 og shTM4SF1 + GEM var 0,934 ± 0,132, 0,792 ± 0,101, 0,750 ± 0,149 og 0,398 ± 0,080. TM4SF1 lyddemping av gemcitabin resulterte i markert lavere tumorvekter enn i kontrollmusene (* P & 0,05). (C)
In vivo
spredning ble målt ved PCNA analysen på parafin seksjoner fra shControl og shTM4SF1 dyr behandlet med gemcitabin. Et representativt bilde med en forstørrelse på 200 x indikerer celleformering er vist.
diskusjon
Både metastase og chemoresistance var assosiert med redusert overlevelse av kreftpasienter. Forskere undersøkt som TM4SF1 som en tetraspanin krysser membranen kan være forbundet med den tetraspanin anriket microdomanin (TERM) på plasmamembranen, som spiller roller i organiseringen av integriteten av membran-reseptorer, inkludert integriner for å påvirke celle-adhesjon, migrasjon og metastasering. TM4SF1 ble også plassert på intracellulære vesikler og ble rettet mot slutten endocytiske organeller gjennom en biosyntetiske vei til å påvirke cellemotilitet [13, 23]. Den L6 antistoffbasert immunterapi oppnådd delvis remisjon hos pasienter med metastatisk brystkreft. Flere undersøkelser viste at TM4SF1 ble overuttrykt i humane tumor vaskulære endotelceller og TM4SF1-antistoff ble selektivt rettet mot svulst blod fartøy endotelceller og kreftceller med liten toksisitet. TM4SF1 påvirket vaskulær modning og interaksjon med inte å indusere endotelceller migrasjon og celle-celle interaksjoner [24-27]. Jaminet gruppe undersøkte nye fremgangsmåter for felles antistoffer som 8G4 med cytotoksiske medikamenter kan forventes å behandle med tumor og tumor angiogenese [28]. Den tidligere forskning viste at TM4SF1 var involvert i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen og hemmet celler migrasjon og invasjon [29, 30]. Det var imidlertid ukjent om TM4SF1 bidratt til chemoresistance av gemcitabin i PDAC.
Derfor fokuserte vi på rollen TM4SF1 i bukspyttkjertelen adenokarsinom ved å observere effekten av å kneble dette genet på kjemoterapeutiske middel
in vitro Hotell og
in vivo
. I vår studie har vi gitt bevis for at TM4SF1 ble mer høyt uttrykt i bukspyttkjertelen cellelinjer enn i normal bukspyttkjertelen epitel (HPDE) celler og gemcitabin resistens i kreft i bukspyttkjertelen celler kan skyldes uttrykk for TM4SF1. Stanse TM4SF1 redusert kapasitet celleproliferasjon, forbedret apoptose celler og delvis reversert chemoresistance av gemcitabin i ASPC-en, MIA PACA-2, og PANC-en cellelinjer. Tidligere arbeid undersøkt som chemoresistance i kreft i bukspyttkjertelen celler var via regulerer uttrykk for MDR gener inkludert ABCB1, ABCC1, ABCC3 og ABCC5 [9]. Så, vi evaluert om TM4SF1 indusert uttrykk for MDR gener for å påvirke gemcitabin følsomhet i bukspyttkjertelen kreftceller. Etter stanse TM4SF1, uttrykk for to ABC transportører (ABCB1, ABCC1) gener signifikant redusert i ASPC-en, MIA PACA-2, og PANC-1 celler, som ga bevis for at TM4SF1 kan være korrelert med MDR gener å regulere gemcitabin motstand.
In vivo
, ble ortotopiske svulster utviklet med MIA PACA-2 celler som uttrykker shControl eller shTM4SF1 i immuno-mangelfull mus, som ble overvåket ved hjelp av ikke-invasiv bioluminescent bildebehandling. Vi fant ut at å kneble TM4SF1 kunne øke følsomheten av MIA PACA-2 celler til gemcitabin-indusert vekst. Også, PCNA-analyse viste at spredning av vev med både taushet TM4SF1 og behandlet med gemcitabin var lavere enn for alle andre vev. Disse funnene antydet at TM4SF1 kan være en potensiell chemoresistance mål for kreft i bukspyttkjertelen.
Her vi først gitt bevis for at TM4SF1 mediert gemcitabin motstand via regulering MDR gener uttrykk. Studier har funnet at MDR gener indusert kreftceller til å erverve chemoresistance via påvirker utstrømming av kreftmedisiner fra cellene og redusere intracellulære legemiddelkonsentrasjon [31]. Derfor bør mer innsats gjøres for å overvinne MDR og å undersøke nye molekylære behandlingsformer som genterapi. I kreft i bukspyttkjertelen, undersøkelser viste at MDR proteiner ofte ble uttrykt og påvirket kjemoterapi følsomhet og nytte hos pasienter med avansert kreft i bukspyttkjertelen [32-34]. En annen forskning antydet at gefitinib reversert uttrykk for MDR og restaurert kjemosensitivitet av motstand i BxPC-tre cellelinjer via RAF1 /ERK signalveien [35]. MUC1 var et membranbundet glykoprotein som uttrykt i PDAC å øke chemoresistance av gemcitabin og etoposid. I mekanisme, MUC1 indusert ekspresjon av ABCC1 via en AKT-uavhengig signalering og spesielt den var direkte relatert med promoter-regionen til ABCC1 genet, noe som indikerer at MUC1 kan virke som en transkripsjonsregulator [9] .Further reguleringsmekanisme av TM4SF1 og MDR kan bli undersøkt for resistens overfor kjemoterapeutiske medikamenter i PDAC.
i tillegg TM4SF5, et annet medlem av fire-transmembrane domene-familien, ble observert å være sterkt uttrykt i humane leverkreft vev og celler. Studier i at kreft antydet at TM4SF5 kunne forbedre p27
Kip1 uttrykk og fosforylering og føre til epitelial-mesenchymale overgang (EMT) å megle tumorigenesis, metastaser og gefitinib motstand [36-39]. Videre studier vil være nødvendig for å forstå forholdet mellom de ulike medlemmene av de fire-trans-domene familien.
I konklusjonen, vår studie beskrev at stanse av TM4SF1 sensitivisert kreft i bukspyttkjertelen celler via downregulating ABCB1 og ABCC1 å drepe etter behandling med gemcitabin kan være av spesiell betydning translasjonell. Disse data antydet at nedregulering av TM4SF1 uttrykk kan være av klinisk nytte i bukspyttkjertelkreft behandling. Fremtidig arbeid bør være viet til å forstå mekanismene og stier som er involvert i effektene av TM4SF1 uttrykk på chemoresistance for kreft i bukspyttkjertelen.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. RT-PCR analyseresultater som viser ved å stanse all TM4SF1 i ASPC-en, MIA PACA-2 og PANC-en cellelinjer.
Cellelinjer ble transient transfektert med siControl eller siTM4SF1, og mRNA ble isolert fra dem etter 48 timer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0144969.s001 product: (PDF)
