Abstract
Bakgrunn
Elektroporering, en fremgangsmåte for å øke permeabiliteten av membraner til ioner og små molekyler, anvendes i klinikken med kjemoterapeutiske legemidler for kreftbehandling (electrochemotherapy). Elektroporasjon med kalsium bevirker ATP (adenosin trifosfat) reduksjon og kreftcelledød og kan være en ny kreftbehandling. Denne studien tar sikte på å forstå forholdet mellom anvendt elektrisk felt, kalsium konsentrasjon, ATP uttømming og effekt
Metoder
I tre humane cellelinjer -. H69 (småcellet lungekreft), SW780 ( blærekreft), og U937 (leukemi), ble levedyktighet bestemt etter behandling med 1, 3, eller 5 mM kalsium og åtte 99 uS pulser med 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 eller 1,6 kV /cm. Fitting analyse ble brukt for å kvantifisere celledrepende virkning i nærvær av kalsium. Post-behandling intracellulær ATP ble målt i H69 og SW780 celler. Post-behandling intracellulær ATP ble observert med fluorescens konfokal mikroskopi av Quinacrine-merket U937 celler.
Resultater
Både H69 og SW780 celler viste doseavhengig (kalsiumkonsentrasjon og elektrisk felt) reduksjon i intracellulær ATP (p 0,05) og redusert levedyktighet. Den 50% effektive celledrap ble funnet ved 3.71 kV /cm (H69) og 3,28 kV /cm (SW780), redusert til 1,40 og 1,15 kV /cm (henholdsvis) med 1 mM kalsium (lavere EC50 for høyere kalsiumkonsentrasjoner). Quinacrine fluorescens intensitet av kalsium-electroporated U937 celler var en tredjedel lavere enn i kontrollgruppen (p 0,0001).
Konklusjoner
Kalsium electroporation doseavhengig redusert celle overlevelse og intracellulær ATP. Økende ekstracellulær kalsium tillater bruk av et lavere elektrisk felt.
Generelt Betydningen
Denne studien støtter bruk av kalsium electroporation for behandling av kreft og muligens senke det påtrykte elektriske felt i fremtidige studier.
Citation: Hansen EL, Sozer EB, Romeo S, Frandsen SK, Vernier PT, Gehl J (2015) doseavhengig ATP Nedbryting og Cancer Cell Død etter Kalsium Electroporation, relativ effekt av kalsiumkonsentrasjon og elektriske feltstyrke. PLoS ONE 10 (4): e0122973. doi: 10,1371 /journal.pone.0122973
Academic Redaktør: Boris Rubinsky, University of California i Berkeley, USA
mottatt: 29 desember 2014; Godkjent: 11 februar 2015; Publisert: 08.04.2015
Copyright: © 2015 Hansen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. ELH ble støttet av et stipend fra den danske Kreftforeningen (R81-A5208-13-S7) og ved en bevilgning fra COST Handling «European Network for utvikling av Electroporation- baserte teknologier og behandlinger «(TD1104-010414-042351). SR ble støttet av en bevilgning fra COST Handling (TD1104-040514-041263). JG var en Royal Swedish Academy of Sciences Research Fellow støttet av en bevilgning fra Acta Oncologica Foundation (2009-2014). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklære patentet «Terapeutiske anvendelser av kalsium electroporation effektivt å indusere tumor nekrose» (PCT /DK2012 /050496, co-oppfinnere SKF og JG) har blitt sendt. Andre forfattere erklærer ingen interessekonflikt. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Electroporation er en metode som brukes til å generere økt porousness av cellemembranene ved å bruke termiabiliseringsmiddel elektriske pulser [1]. Fremgangsmåten kan brukes for å indusere passasje av ellers ikke-gjennomtrengende stoffer [2-5] eller ioner slik som kalsium [6,7] inn i cellene gjennom cellemembranen [8].
Reversible elektroporering, hvor celle membranene forsegle etter transient permeabilisation, anvendes i klinikken i kombinasjon med kjemoterapeutiske medikamenter for lokal behandling av ondartede tumorer (electrochemotherapy) [9-11]. Erstatte kalsium for kjemoterapeutika i denne prosedyren (kalsium electroporation) kan være en roman, effektiv og billig behandling kreft [6].
Det er av stor klinisk interesse for å utforske muligheten for å minimere det elektriske feltet omfanget under behandling , både i unngåelse av muskelsammentrekninger og i utviklingen av elektroder som kan behandle dypt liggende tumorer. Å utsette cellene for å splitte-dose elektroporering har vist seg å øke celle følsomhet for electrochemotherapy, et fenomen som kalles electrosensitation [12]. Vår studie tar sikte på å undersøke en mulig økning i følsomheten også til irreversible electroporation behandling når økende ekstracellulært kalsium. Irreversible electroporation (IRE) [13] er en annen electroporation basert terapi, hvor sterkere elektriske feltene brukes til å drepe kreftceller gjennom irreversible membran permeabilisation. Økende elektrode terapeutiske bredde ved å redusere det elektriske felt er en spesiell bekymring i IRE, så vel som andre electroporation baserte terapier [14]. For IRE, kanskje legge kalsium øke radius behandling og effekt.
Kalsium er en allestedsnærværende andre budbringer involvert i en rekke cellulære prosesser inkludert kontrollert nekrose (necroptosis) [15-18]. Konsentrasjonsgradienten for kalsium gjennom cellemembranen er strengt regulert for å opprettholde cellulær homeostase. I normale celler den intracellulære konsentrasjonen av ionisert kalsium blir opprettholdt rundt 100 nM, vesentlig lavere enn den ekstracellulære konsentrasjon, som typisk overstiger 1 mM [16,19]. Stigningen er opprettholdt gjennom en rekke membranpumper, for eksempel Ca
2 + -ATPases, som forbruker ATP (adenosin trifosfat) for energi til enten utvise overflødig kalsium fra cellen eller overføre den til cellulære avdelinger som endoplasmatisk retikulum eller mitokondriene [20-22].
Vi har vist tidligere at mobilnettet ATP nivåer slipp følgende kalsium electroporation [6]. Når en dramatisk økning i intracellulært kalsium finner sted, eventuelt ved kalsium elektroporering, en økt aktivitet av Ca
2 + -ATPases forbruker all hast cellulært ATP [19]. En økning i kalsium påvirker også mitokondriene fører til tap av produksjon ATP [20]. Videre er dannelsen av forbigående porer i plasmamembranen kan føre til lekkasje av ATP fra cellen [23]. Totalt, cellulært ATP avtar når et toksisk nivå av kalsium induseres inn i cellen, eventuelt gjennom disse mekanismene. Dette ATP uttømming kan bidra til oppstart av celledød [6,24].
Kalsium electroporation er sammenlignbare i effektiviteten til electrochemotherapy
in vitro product: [7] og er for tiden under den første kliniske studien i en randomisert dobbelt blindet fase II non-inferiority studie (ClinicalTrials.gov-ID NCT01941901). Mer kunnskap om mekanismen av kalsium electroporation er nødvendig for å videre forstå og utnytte dette antitumor modalitet.
For å undersøke sammenhengen mellom kalsiumkonsentrasjon og pulserende elektriske felt i å skaffe ATP uttømming og tilstrekkelig celledrap
in vitro
, brukte vi cellelinjer kjent for å ha ulik respons til kalsium electroporation behandling
in vivo
: H69 human småcellet lungekreft med høy følsomhet (77-100% nekrose i tumorer 6 dager etter kalsium electroporation [ ,,,0],9]) og SW780 human blærekreft cellelinje med lav følsomhet (1-60% nekrose i tumorer 6 dager etter kalsium electroporation, upubliserte data). Vi har også utforsket de kortsiktige effektene av kalsium electroporation på ATP-innholdet av en menneskelig leukemi cellelinje (U937) med confocal bildebehandling med fluoriserende fargestoff quinacrine.
Denne studien undersøker forholdet mellom anvendt elektrisk felt, kalsiumkonsentrasjonen , cellelinje følsomhet og effekten på ATP-innhold og overlevelse.
Materialer og metoder
Tre humane cellelinjer ble anvendt for forsøkene. Eksperimenter analysere ATP innhold og levedyktighet utført ved Københavns universitetssykehus Herlev brukt H69 human småcellet lungekreft og SW780 human blære kreft cellelinjer. Den U937 human leukemi cellelinje ble brukt til eksperimenter ved Frank Reidy Research Center for Bioelectrics.
Cell dyrking
H69 human småcellet kreft cellelinje lunge stabilt transfektert med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) regulert av cytomegalovirus promotor [25] ble vennlig levert av Department of Radiation Biology, København universitetssykehus. Den SW780 human blære overgangsordning celle carcinoma ble vennlig levert av Dr. Lars Dyrskjøt Andersen, Institutt for molekylær medisin, Aarhus universitetssykehus [26]. Den U937 menneskelige histiocytisk lymfom monocytt cellelinje (ATCC CRL-1593,2) ble vennlig levert av Olga Pakhomova, Frank Reidy Research Center for Bioelectrics, Old Dominion University.
Alle cellelinjer ble opprettholdt i RPMI 1640 dyrkingsmedium som inneholder 10 % føtalt kalveserum (Gibco, Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO
2.
Elektroporering protokoll
Celler i HEPES-buffer (10 mM HEPES (Lonza), 250 mM sukrose, 1 mM MgCl
2 i sterilt vann) med sluttkonsentrasjon 6,1 x 10
6 celler /ml, ble avkjølt på is i 5 min. For kalsium elektroporering (CAEP), 20 pl HEPES buffer inneholdende CaCl
2 ble tilsatt til electroporation kyvetter med 4 mm elektrodeavstanden (Molecular Bioproducts Inc., San Diego, CA, USA) for å gi en sluttkonsentrasjon på 0 mM, 1 mM, 3 mM, eller 5 mM CaCl
2 etter tilsetning av 180 ul av cellesuspensjon. Kyvettene ble holdt på is i 5 minutter før elektroporering (EP). EP besto av 8 pulser på 99 us med 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, 1,2 kV /cm, 1,4 kV /cm eller 1,6 kV /cm henholdsvis, levert ved en frekvens på 1 Hz ved hjelp av et BTX T820 firkantbølge electroporator ( BTX Harvard Apparatus). Etter 20 minutters inkubering ved 37 ° C og 5% CO
2, ble cellene fortynnet i 5 ml kulturmedium (sluttkonsentrasjon 2,4 x 10
5-celler /ml).
ATP-testen
Cellular ATP-nivået ble målt i H69 og SW780-celler ble behandlet med kalsium, med eller uten elektroporering ved hjelp av ATP-luminescens analyse (Enliten ATP assay; Promega) etter cellelyse. For ATP-testen 11,5 x 10
4 celler /ml H69-celler eller 4,6 x 10
4 celler /ml SW780 celler i 100 ul kulturmedium var i 96-brønners plater i overensstemmelse med innledende optimalisering.
Cellene ble behandlet i henhold til den protokoll electroporation. Celler elektroporert med HEPES-buffer, ikke-elektroporert celler med kalsium, og ubehandlede celler ble anvendt som kontroller. Celler tre ganger tint og frosset, deretter ultralydbehandlet (ultralydbad Branson 1200), ble brukt som kontroll (døde celler). Etter sentrifugering av 96-brønners plater Supernatanten ble fjernet. Cellulære ATP-innholdet 1, 2, 4 og 8 timer etter behandling ble bestemt ved lyse av cellene (30 min) og deretter å tilsette 100 ul rl /liter reagens, og måling av lysemisjon ved hjelp av et luminometer (LUMIstar, Ramcon).
MTS levedyktighet assay
levedyktigheten av H69 og SW780-celler behandlet med kalsium, med eller uten elektroporering ble bedømt ved bruk av MTS (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (carboxymethophenyl) -2- (4-sulfonyl) -2H-tetrazolium) analyse (Cell Titer Aqueous 96 Non-Radioactive Cell Proliferation assay; Promega). MTS-analysen er en kolorimetrisk metode som estimerer hastigheten på stoffskiftet i levende celler. Etter behandling 100 pl cellesuspensjon (2,4 x 10
5 celler /ml) ble sådd i 96-brønners plater. Etter 24 timers inkubering 20 ul MTS /PMS-reagens ble tilsatt til hver brønn (sluttkonsentrasjoner på 333 mikrogram /ml MTS og 25 uM PMS). Etter 1 times inkubering ved 37 ° C og 5% CO
2 cellelevedyktigheten ble bedømt ved å måle optisk tetthet (OD) ved bruk av Multiscan-oppstigning ELISA-leser (ThermoLabsystems, Finland) ved 490 nm med bakgrunns målinger ved 690 nm.
Monterings relasjoner mellom eksperimentelle parametre og celleoverlevelsesdata
data~~POS=TRUNC analysen~~POS=HEADCOMP ble utført ved hjelp av MATLAB (Natick, MA, USA) programvare. Den celleoverlevelse (uttrykt som prosent av kontroll) i H69 og SW780-cellelinjer ved 24 timer etter behandling, ble plottet mot det elektriske felt amplitude ved hver kalsiumkonsentrasjon i betraktning. Den best tilpassede kurven ble deretter hentet. Fra monteringskurvene, ble den elektriske feltstyrke (E
50) som kreves for å drepe minst 50% av cellene i hver kalsiumkonsentrasjon trukket ut, for å kvantifisere effektiviteten av celledreping av elektroporering i fravær eller i nærvær av kalsium.
ATP bildebehandling
Ved hjelp av konfokal skanning bildebehandling med en Leica TCS SP8 mikroskop, ble ATP innhold etter electroporation vurderes i U937 celler med fluorescerende fargestoff quinacrine (Sigma-Aldrich, USA), en ikke- spesifikk markør med høy affinitet for adeninnukleotider [15]. Fire betingelser ble undersøkt: Celler ble behandlet med 3 mM ytre kalsium; celler eksponert for electroporating pulser (1 kV /cm, 8 x 99 uS, 1 Hz); celler eksponert for både 3 mM kalsium og ytre electroporating pulser; og ubehandlede kontrollprøver. Celler ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i dyrkningsmedium inneholdende 10 uM kinakrin, etterfulgt av elektroporering protokoll beskrevet i avsnitt 2.2. (Samme cellekonsentrasjon anvendes, men kjøling utelukket, og celler ble elektroporert i 1 mm kyvetter i nærvær av 10 pM propidiumjodid). Umiddelbart etter electroporation celler ble overført henholdsvis å dekke glass kamre for avbildning inneholdende RPMI 1640 medium, 1,6 uM kinakrin og 1,25 uM propidiumjodid (Molecular Probes, USA, en indikator for membran permeabilisation) med 1: 6-fortynning av begge cellene og fargestoffer (celle konsentrasjonen 1 x 10
6 celler /ml) og til 96-brønners plater for levedyktighet assay. Vi avbildes den quinacrine fluorescens 15 minutter etter behandling. Fluorescensintensiteten ble målt i 9 bilder pr tilstand. I hvert bilde, ble fluorescens av tjue tilfeldig valgte cellene integrert og i gjennomsnitt bruker MATLAB programvare (180 celler totalt).
Resazurin levedyktighet analysen
levedyktighet ble vurdert ved hjelp resazurin analysen U937 celler (Life Technologies , USA) utført 24 timer etter eksponering. Ti mikroliter reagens (Prestoblue, Molecular Probes) ble tilsatt til hver brønn inneholdende 90 ul cellesuspensjon (cellekonsentrasjon 2,4 x 10
5 celler /ml). Etter 1 times inkubering ved 37 ° C og 5% CO
2, ble cellelevedyktigheten vurdert ved å måle fluorescens ved hjelp av Synergy to mikroplateleser (BioTek Instruments, USA).
Statistiske analyser
Forskjeller i ATP luminescens intensitet mellom gruppene ble testet med ATP luminescens analysen ble validert og analysert med en eksponentiell nedgang modell med Bonferroni korreksjon ved hjelp av SAS programvare (versjon 9.2). Luminescens verdier ble log transformert før analyse. Toveis ANOVA (Analyse av variansen) med Bonferroni korreksjon ble brukt for å vurdere forskjeller i levedyktigheten mellom gruppene ble testet med MTS spredning analysen også bruker SAS 9.2-programvaren. T-test ble brukt for vurdering av forskjeller mellom gruppene ble testet med resazurin levedyktighet analysen og for avbildes grupper analysert med MATLAB programvare.
Resultater
Cellular ATP og levedyktighet etter kalsium electroporation
bare kalsium (uten electroporation).
å utsette cellene for å øke ekstracellulære konsentrasjoner av kalsium i fravær av elektroporering hadde ingen tilsynelatende virkning på cellulær ATP-nivå eller levedyktighet i forhold til kontrollene i en av de to cellelinjer (fig 1A og 1B, 2A og 2B)
Cellular ATP-nivåer bestemmes 1, 2, 4 og 8 timer etter kalsium electroporation behandling av to humane cellelinjer (H69, en liten kreftcellelinje celle lunge (A).; og SW780, en blærekreft cellelinje (B)). Ekstracellulære kalsiumkonsentrasjoner på 0 mM, 1 mM, 3 mM, eller 5 mM og påtrykte elektriske felt på 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, eller 1,2 kV /cm. Resultatene er vist som prosent av kontroll (ingen elektroporering, uten tilsatt kalsium). . Normalisert til kontroll ved hvert tidspunkt (%), midlere-S.D, n = 6.
levedyktighet, vurdert ved hjelp av MTS analyse av H69, en human småcellet lungekreft-cellelinje (A); og SW780, en human blære kreftcellelinje (B) 24 timer etter behandling med kalsium elektroporering. Endelige ekstracellulære kalsiumkonsentrasjoner på 0 mM, 1 mM, 3 mM, eller 5 mM og påtrykte elektriske felt på enten 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, eller 1,2 kV /cm. Celler tre ganger tint og frosset, deretter sonikert ble anvendt som kontroll (døde celler). Resultatene er illustrert som prosent av kontroll (ingen elektroporering, uten tilsatt kalsium), electroporation (EP), mener + SD, n = 6.
Electroporation bare (uten kalsium).
øke det elektriske felt hadde ingen signifikant effekt på den ATP-innholdet av H69-celler, ved å utsette dem for elektroporering alene (figur 1A). ATP-nivåer i elektroporerte kun H69 prøver økte over tid i løpet av inkubasjonstiden som tidligere er observert [6]. Det var ingen signifikant nedgang i levedyktigheten til H69 celler behandlet med pulserende elektrisk felt alene (Fig 2A).
Å øke det elektriske feltet 0,8 til 1,2 kV /cm ikke har en signifikant effekt på ATP-innholdet av SW780 -celler, når utsette dem for elektroporering alene (figur 1B). Som vist i figur 2B, var det en 28% reduksjon i levedyktighet av SW780-celler ble behandlet med 0,8 kV /cm elektrisk felt som indikerer at elektroporering alene forårsaket celledød, selv om det ikke er statistisk signifikant.
Kalsium elektroporering-H69 celle ATP .
ATP nivåer redusert i H69 celler med økende kalsiumkonsentrasjoner og økende elektriske feltet (figur 1A). Kalsium elektroporering ved å bruke 0,8 kV /cm betydelig redusert det intracellulære ATP-nivået når den kombineres med 5 mM kalsium sammenlignet med ubehandlede kontroller (p 0,05). Ved bruk av 1,0 kV /cm og 1,2 kV /cm, alle testet kalsiumkonsentrasjoner (1, 3, og 5 mM) betydelig redusert det intracellulære ATP-nivået sammenlignet med ubehandlede kontroller og kalsium alene (p 0,001). Å øke det elektriske felt 0,8 til 1,0 kV /cm i kalsium elektroporering med 1 mM kalsium betydelig redusert ATP-nivået (p 0,05). Ytterligere økning av felt 1,0 til 1,2 kV /cm hadde ingen ytterligere virkning på ATP-nivå.
Kalsium elektroporering-H69 celleviabilitet.
Som vist i figur 2A, kalsium elektroporering forårsaket signifikant nedgang i H69 celle levedyktighet for alle testede doser over 1 mM kalsium med 0,8 kV /cm (p 0,05). Ytterligere økning i elektrisk felt eller kalsiumkonsentrasjonen ikke har en betydelig tilleggseffekt på H69 levedyktighet (figur 2A).
Kalsium electroporation-SW780 celle ATP.
Som vist i figur 1B, 1, 3 eller 5 mM kalsium elektroporering signifikant redusert ATP-nivåer i alle pulsforhold sammenlignet med ubehandlede kontroller, så vel som kalsium alene (p 0,05). Å øke det elektriske felt 0,8 til 1,0 kV /cm, og 1,0 til 1,2 kV /cm ved behandling med 1 mM kalsium elektroporering redusert betraktelig ATP-nivået (p 0,0001). Legge til kalsium i electroporation prosedyren betydelig redusert ATP i alle pulsforhold (p 0,0001)..
Kalsium electroporation-SW780 celleviabilitet
Som skjematisk vist i figur 2B, kalsium electroporation forårsaket betydelig reduksjon i SW780 celle levedyktighet for alle testede doser over 1 mM kalsium med 0,8 kV /cm (p 0,0001) (figur 2B). Å øke det elektriske felt 0,8 til 1,2 kV /cm i vesentlig grad påvirket SW780 levedyktighet i nærvær av kalsium (p 0,001). Maksimal SW780 celledrap kreves 1,2 kV /cm og 5 mM kalsium førte til lavere verdier i MTA analysen enn frysing og tining cellene tre ganger med påfølgende ultralydbehandling (p 0,001).
Montering analyse av celleoverlevelsesdata
etter analyse med MATLAB kurvetilpasning verktøy, fant vi ut at den beste tilpasning funksjon for forholdet mellom celle overlevelse etter 24 timer, og det elektriske feltet amplitude på faste konsentrasjoner kalsium, var en to-parameter eksponensiell funksjon,
y (x) = a · exp (-b · x)
der
x
er det elektriske feltet amplitude og
y (x)
er prosentandelen av celleoverlevelse. Resultater på SW780 celler er rapportert i figur 3. E
50 parameter ved hver kalsiumkonsentrasjonen anses ble ekstrahert ved hjelp av funnet funksjonen. Resultatene, som er skjematisk angitt i tabell 1 for både H69 og SW780 cellelinje, tillot oss å kvantifisere økt celledrepende effektivitet av elektroporering i nærvær av kalsium. I begge cellelinjer, og for alle kalsiumkonsentrasjoner testet, det elektriske felt som kreves for å halvere celleoverlevelse etter 24 timer etter behandling i nærvær av ekstracellulært kalsium var to til tre ganger lavere enn i tilfellet med electroporation alene. Forskjellige responser ble oppnådd mellom de to cellelinjer. Den H69 cellelinje som kreves høyere elektrisk felt amplitude (ca. 20%) enn SW780-celler for å oppnå en 50% reduksjon i celleviabilitet, med en ekstracellulær konsentrasjon av kalsiumklorid fra 1 til 5 mM. Den SW780-cellelinjen kan være mer følsomme for behandling med lave doser av kalsium enn H69-celler
in vitro
.
Celle overlevelse (%) versus elektrisk felt (E) ved kalsium elektroporering ved anvendelse av 0, 1, 3, eller 5 mM kalsium i SW780 humane blærecancerceller vurdert ved anvendelse av MTS-analyse 24 timer etter behandling. Elektrisk felt amplitude på 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, 1,2 kV /cm, 1,4 kV /cm, eller 1,6 kV /cm ble brukt. Montering Kurver ble utledet ved hjelp av MATLAB programvare. Resultatene er illustrert som prosent av kontroll (ingen elektroporering, uten tilsatt kalsium), gjennomsnitt ± SD, n = 6.
Confocal fluorescens avbildning av ATP og permeabilitet
brukte confocal fluorescens avbildning av quinacrine-merkede celler for å undersøke endringer i intracellulære nivåer og distribusjon av ATP [27-30]. Figur 4 viser valgte representative bilder tatt 15 minutter etter behandling. Den gjennomsnittlige kinakrin fluorescens av kalsium elektroporerte prøvene var omtrent 30% lavere enn i de kalsium-bare prøver (p 0,0001), skjematisk vist i figur 5A. Det elektriske feltet nødvendig for å drepe halvparten av cellene (E
50) under de undersøkte betingelser i nærvær av 3 mM kalsium, ble anslått til 0,70 kV /cm.
U937, en human leukemicellelinje. Endelige ekstracellulære kalsiumklorid konsentrasjoner på 0 mM eller 3 mM og påtrykte elektriske felt på 1,0 kV /cm. Quinacrine fluorescens (øverste rad), 10 mikrometer; propidiumjodid fluorescens (midterste rad), 7,5 mikrometer;
U937, en human leukemi cellelinje fase kontrast celle bilder (nederste rad).. (A) Cellular kinakrin fluorescensintensiteten av U937 15 minutter etter at kalsium elektroporering. Den ekstracellulære quinacrine konsentrasjonen var 10 mikrometer under lasting og electroporation. Endelige ekstracellulære kalsiumkonsentrasjoner på 0 mM eller 3 mM og påtrykte elektriske felt på 1,0 kV /cm ble anvendt. Kolonnene viser gjennomsnittet av 180-celler (9 eksperimenter x 20 celler). Vilkårlige enheter (AU), mener + S.D., n = 9. (B) U937 celleviabilitet målt 24 timer etter kalsium electroporation. Levedyktighet bedømmes for U937 ved hjelp av resazurin celleproliferasjonsanalyse. Ekstracellulære kalsiumkonsentrasjoner på 0 eller 3 mm. Påtrykte elektriske felt på 1,0 kV /cm. Resultatene er illustrert som prosent av kontroll (ingen elektroporering, uten tilsatt kalsium), mener + SD, n = 6.
Permeabilisation av U937 celler preget av tilstrømningen av propidiumjodid ble forsinket og mer uregelmessig etter kalsium electroporation forhold til electroporation uten kalsium (fig 4).
Vi har også observert morfologiske endringer i kalsium electroporated celler uberegnelig utstilling kompromittert membran integritet, blebbing, krymping, eller uregelmessig celle form (figur 4).
Resazurin levedyktighet assay
resultatene av levedyktighet analysen (figur 5B) av U937-celler viser at det var mer levedyktige celler i prøven behandlet med kalsium alene enn i den kalsium-elektroporert prøve (p 0,0001).
Diskusjoner
Denne studien utforsker respons i mobilnettet ATP nivå og levedyktighet til annen electroporation parametre og kalsiumkonsentrasjoner for kalsium electroporation behandling. Både H69 og SW780 cellelinjer viste en reduksjon doseavhengig i cellulære ATP og levedyktighet med økende elektrisk felt sammen med økende kalsiumkonsentrasjon (figur 1A og 1B). Resultatene har ikke fullt ut avdekke hvorvidt behandlingen kan optimaliseres i henhold til individuell cellelinje følsomhet. Resultatene viste at cellelinjen H69 kreves et høyt elektrisk felt for å indusere maksimal ATP uttømming (Fig 1 A) og celle-kill (figur 2A).
Forskjellen mellom responsene til de to cellelinjene til utforsket parametere for kalsiumkonsentrasjon og elektrisk felt kan delvis forklares ved forskjeller i cellestørrelse. Den cellulære responsen på kalsium electroporation er mindre avhengig av cellestørrelse
in vivo
grunn av en generell mangel på ekstracellulære rom, påvirker cellene evnen til å «skjule» fra puls eksponering [31], en grunn til at
in vitro
resultatene på terskelverdier ikke nødvendigvis forutsi in vivo-effektivitet.
Kalsium elektroporering forårsaket en signifikant kortvarig reduksjon i kinakrin fluorescens i U937-celler, noe som kan tyde på ATP-nedbryting, og behandlingen betydelig redusert celle levedyktighet etter 24 timer. Mer systematiske undersøkelser for å følge kunne bruke en ATP-spesifikk analyse, slik som luminescens fra luciferin-luciferase.
Irreversible elektroporering (IRE) er en prosedyre hvor cellene er utsatt for påtrykte elektriske felt parametere sterke nok til å forårsake permanent skade av cellemembranen, til syvende og sist fører til forstyrret ion homeostase og celledød [14]. IRE forårsaker vev ablasjon med lavere renseeffekt i margen av målrettede vev hvor den elektriske feltstyrken er lavest. Evnen til å oppnå høyere celledrap og forårsake vev ablasjon da øke det elektriske feltet er bakgrunnen for bruk av IRE for kreftbehandling [13], og brukes i dag til behandling av nyre [32], lever [33] og bukspyttkjertelsvulster [34 ], og potensielt for prostata [35] og intrakranielle tumorer [36]. Vi har funnet at ved å øke den ekstracellulære kalsiumkonsentrasjonen i løpet av elektroporering induserer større celledrap, noe som innebærer at tilsetning av kalsium, selv i lave doser, kan potensielt forbedre den terapeutiske effekten av IRE i lavere intensitets regioner av målvevet, som resultatene i tabell 1 viser . Derfor er tilsetning av kalsium til IRE prosedyre kunne potensielt øke radius behandling og effekt.
IRE og elektroporering benyttes i kombinasjon med kjemoterapeutiske medikamenter er stadig mer generell anerkjennelse som et behandlingsform for faste tumorer, og er brukt som palliativ behandling for pasienter uegnet for kirurgi (NICE klinisk retningslinje 446, mars 2013 [2,9-11]). Kalsium electroporation har vist sammenlignbare i effektiviteten til electrochemotherapy
in vitro product: [7] og er for tiden under den første non-inferiority klinisk studie for behandling av kutan metastaser (ClinicalTrials.gov-ID NCT01941901). Effektiviteten av calium elektroporering som en ny kreftbehandling formen blir også undersøkt for behandling av tumorer i de indre organene [37,38].
Tidligere studier som undersøker kalsium elektroporering har vist at behandlingen påvirker cellulære ATP og levedyktighet [ ,,,0],6]. Denne studien bekrefter at teorien med en demonstrasjon av doseavhengigheten, og videre støtter bruk av kalsium som en effektiv og rimelig alternativ til kjemoterapeutika i electroporation prosedyrer.
Så vidt vi vet forholdet mellom kalsiumkonsentrasjon og elektrisk felt i kalsium electroporation behandling av kreftceller har ikke tidligere blitt undersøkt. Våre data viser at kalsium elektroporasjon er effektiv med reduserte elektriske felter hvis kalsiumkonsentrasjonen økes. Mer forskning er nødvendig for å fullt ut forstå hvordan denne romanen kreftbehandling modalitet induserer celledød og rollen som ATP uttømming og forstyrrelse av kalsium homeostase spiller i den terapeutiske effekten av kalsium electroporation.
Konklusjoner
effekten av kalsium elektroporering påvirkes av enkeltcellelinje-responsene og avhenger både av kalsiumkonsentrasjon og på elektrisk felt amplitude. Studien viser at kalsium electroporation reduserer mobilnettet ATP og kreft celle overlevelse betydelig. Resultatene støtter videre bruk av kalsium electroporation som en terapeutisk modalitet i behandling av kreft, samt muligheten for å senke det påtrykte elektriske felt i fremtidige studier med elektroporering.
Takk
Forfatterne takker Olga Pakhomova for å tilby fasiliteter for Resazurin levedyktighet analysen, og takke Marianne Fregil for å yte god teknisk assistanse.
